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1、SDS-PAGE凝膠電泳,SDS-PAGE凝膠電泳,實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)步驟 注意事項(xiàng) SDS-PAGE的優(yōu)點(diǎn) SDS-PAGE的缺點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)常見問題及處理 小技巧,實(shí)驗(yàn)步驟,試劑配制 (1) 30%丙烯酰胺（Acr）：稱Acr30g，甲叉雙丙烯酰胺（Bis）0.8g，加蒸餾水至100ml，過濾后置棕色瓶中。 4，12月 （2）10%SDS（十二烷基磺酸鈉） （3）1.5mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.8)： 稱取Tris 18.2g, 加入50ml水,用1mol/L鹽酸調(diào)pH8.8,最后用蒸餾水定容至100ml。,（4）1.0mol/LTris-HCl緩沖液(pH6.8): 稱取Tris
2、12.1g,加入50ml水，用1mol/L鹽酸調(diào)pH6.8,最后用蒸餾水定容至100ml （5）0.05mol/LTris-HCl緩沖液(pH8.0)：稱取Tris0.6g,加入50ml水，用1mol/L鹽酸調(diào)pH8.0,最后用蒸餾水定容至100ml （）TEMED（四甲基乙二胺）,（）樣品溶解液： SDS（100mg）+巰基乙醇（0.1ml）+ 溴酚藍(lán)（2mg）+甘油（2g）+ 0.05mol/L pH8.0Tris-HCl（2ml），最后定容至10ml （）固定液：50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混勻 （）染色液：稱取考馬斯亮藍(lán)R250 0.125g，加上述固定液250ml，過濾后備用
3、,（1）脫色液： 冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸餾水定容至1000ml （1）電極緩沖液 （內(nèi)含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸緩沖液pH8.3）：稱Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸餾水使其溶解后定容至1000ml,. 聚膠前準(zhǔn)備,(1) 配制10過硫酸銨溶液(需每天新鮮配制)。 (2) 將單體儲(chǔ)存液、緩沖液、水按照一定比例配制成凝膠溶液。 (3) 將灌膠裝置準(zhǔn)備好。 (4) 待凝膠溶液平衡至室溫(2325)后，真空脫氣15 min。,不連續(xù)系統(tǒng)下層分離膠的聚合,在10 ml凝膠溶液中加入10過硫酸銨50 l (最終濃度為0.
4、05)，TEMED原液5l (最終濃度為0.05)。輕緩地?fù)u動(dòng)溶液(810下)，使激活劑混合均勻。 將凝膠溶液平穩(wěn)地注入兩層玻璃板中(注意要以連續(xù)平穩(wěn)的液流從中間位置注入)，再在液面上小心注入一層水或正丁醇(約23mm高)，以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液中，然后靜置至少90 min。,不連續(xù)系統(tǒng)中的上層濃縮膠 和連續(xù)系統(tǒng)凝膠的聚合,連續(xù)系統(tǒng)只含一種凝膠，它和不連續(xù)系統(tǒng)中的濃縮膠具有相同之處，即在其液面處與空氣相接觸，因此激活劑的含量應(yīng)相應(yīng)地增加，在10m1凝膠溶液中加入10過硫酸銨50 l (最終濃度0.05)，TEMED原液10 l (最終濃度0.1)。,同前將激活劑混合均勻，但搖動(dòng)溶液時(shí)不要搖得過
5、于劇烈以免引入過多的氧氣。 吸去不連續(xù)系統(tǒng)中下層分離膠上的水分，以連續(xù)平穩(wěn)的液流注入凝膠溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齒尖留有氣泡。 靜置90 min以上以保證完全聚合。 如果在聚膠過程中發(fā)現(xiàn)一道道紋線，即凝膠不均勻，可能是聚合速度太快或激活劑未充分混合導(dǎo)致局部濃度過高。,凝膠聚合的速度可以通過紫外吸收檢測(cè)，由于丙烯酰胺中的雙鍵在260nm有吸收，聚合后雙鍵消失，光吸收減低。將凝膠溶液倒入石英比色杯中，可觀察到2030 min后光吸收讀數(shù)開始下降，至80 min以后趨于穩(wěn)定，說明聚合完成。,電泳,將聚合好的凝膠板安置于電泳槽中，上樣，選擇適當(dāng)?shù)碾妷哼M(jìn)行電泳。,垂直板電泳裝置,加樣,樣品遷移
6、方向,水平式電泳裝置,電泳緩沖液,凝膠,電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分子滯后。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過濾中的一個(gè)帶孔膠粒。,混合樣品,帶孔膠,按分子大小分離,電泳方向,電泳,小分子,大分子,染色和脫色,電泳完畢需通過染色和脫色評(píng)定其結(jié)果的優(yōu)劣，此外根據(jù)不同的研究目的，也可將凝膠直接進(jìn)行放射自顯影及電印跡。,電泳后的凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后的凝膠照片,.結(jié)果處理,測(cè)量并計(jì)算分子量 蛋白質(zhì)的分子量與它的電泳遷移有一定關(guān)系式，經(jīng)37種蛋白的測(cè)定得到以下的關(guān)系式 Mw K(10bm) (1) lgMw = lgKbm = K1bm (2) 其中MW是蛋白質(zhì)分子量；K和K1為常數(shù) b為斜
7、率，m是電泳遷移率，實(shí)際使用的是相對(duì)遷移率mR。 mR=dpr/dBPB,夾在兩塊玻璃板之間的凝膠,電泳緩沖液,電泳緩沖液,加在槽中的經(jīng)SDS處理的樣品,分子量小,分子量大,電源,標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量,未知蛋白,在一定的凝膠濃度下，多肽鏈分子量的對(duì)數(shù)與多肽鏈的相對(duì)遷移率成線性關(guān)系，所以可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求未知多肽鏈分子量。,相對(duì)遷移率,實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng),1. 形成凝膠的試劑要有足夠的純度：丙烯酰胺是形成凝膠溶液中的最主要成份，其純度的好壞將直接影響凝膠的質(zhì)量，丙烯酰胺可能混有的影響凝膠形成的雜質(zhì)有：丙烯酰胺、線性多聚丙烯酰胺、金屬離子等。 2. 注意不能隨便傾倒單體溶液，應(yīng)加入過量的催化劑使其完全聚合成無
8、毒性的聚丙烯酰胺后再棄置。,3. TEMED中混有氧化試劑后其自身極易被氧化而失去催化能力，另外TEMED的氧化產(chǎn)物呈黃色，以此可以鑒定TEMED的質(zhì)量。如果無法獲得無色透明的TEMED，只能適當(dāng)增加用量以保證聚膠速度。,4. 過硫酸銨容易吸潮，由于它溶解于水后很快降解失去催化能力，因此潮解后的過硫酸銨會(huì)漸漸失去活性。保存固體過硫酸銨應(yīng)密閉干燥。過硫酸銨溶液宜制膠當(dāng)天配制。另外在配制凝膠溶液時(shí)過硫酸銨不易過量，否則會(huì)使蛋白質(zhì)在電泳過程中被氧化(主要指天然無變性劑凝膠)。,5. 激活劑的用量: 激活劑的濃度適當(dāng)與否不僅可以決定凝膠聚合的速度，也將影響凝膠的質(zhì)量。增加過硫酸銨或TEMED的用量，將
9、使丙烯酰胺聚合鏈長度縮短，凝膠會(huì)變得脆弱而失去應(yīng)有的柔性。二者多至一定程度時(shí)，聚合鏈長度過短，將不會(huì)形成肉眼可見的凝膠，這些短鏈多聚物呈溶液狀，只是其粘度較聚合前高一些。,6. 溫度的影響聚膠的最佳溫度為2325 ，需要注意灌膠前單體溶液(通常置于4冰箱)及玻璃板或管(有時(shí)從烘箱取出)也要平衡至此溫度。由于溶液在抽真空時(shí)仍維持較低溫度，需待其升至室溫后再脫氣，另外升溫后脫去氧氣的速度較低溫時(shí)快。,7. 氧氣的影響氧氣會(huì)與被激活的單體自由基作用抑制聚合過程，因此需在加激活劑前對(duì)單體溶液脫氣。如果省去這一步驟，凝膠仍能聚合但需更多的激活劑，并且不能保證很好的重復(fù)性，充分去除氧氣可以用盡量少的激活劑
10、得到最佳聚合效果。通常在較好的真空度(125torr)脫氣至少15 min 。,8. 凝膠添加劑：凝膠中常常加入SDS、尿素、Triton X-100等添加劑。SDS加入后不會(huì)對(duì)凝膠的聚合產(chǎn)生影響，但尿素會(huì)使凝膠孔徑變小，這一特性可用來分離小分子蛋白質(zhì)或多肽。,9. 聚膠時(shí)間：雖然應(yīng)用過硫酸銨TEMED催化后灌膠1520 min即可觀察到凝膠的形成，但至少需90 min才能保證95以上的單鏈聚合成長短以及具有合適的孔徑大小。采用核黃素時(shí)聚膠時(shí)間需更長，但它一般用于等電聚焦即根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)進(jìn)行分離，對(duì)孔徑大小要求不高，因此不必等很長時(shí)間(完全聚合需8 h)。,10. 單體的濃度：是指單體總
11、重量(丙烯酰胺+bis)在溶液中的百分比(wv)，可選擇的范圍為330，單體濃度增加后聚合速度將加快，因此可適當(dāng)減少催化劑的用量。 11. SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合按質(zhì)量成比例（即：1.4g SDS/g蛋白質(zhì)），蛋白質(zhì)含量不可以超標(biāo)，否則SDS結(jié)合量不足。,12. 用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子量時(shí)，必須同時(shí)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。不能利用這次的標(biāo)準(zhǔn)曲線作為下次用。并且SDS-PAGE測(cè)定分子量有10誤差，不可完全信任。 13. 有的蛋白質(zhì)（如：電荷異?；蚪Y(jié)構(gòu)異常的蛋白質(zhì)；帶有較大輔基的蛋白質(zhì)）不能采用該法測(cè)相對(duì)分子量。,14. 有些蛋白質(zhì)由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（-胰凝乳蛋白酶）
12、組成的，它們?cè)趲€基乙醇和SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈。因此，對(duì)于這一類蛋白質(zhì)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定的只是它們的亞基或是單條肽鏈的相對(duì)分子量。 15. 如果該電泳中出現(xiàn)拖尾、染色帶的背景不清晰等現(xiàn)象，可能是SDS不純引起。,常見問題及處理辦法,紋理和拖尾現(xiàn)象由于樣品溶解不佳引起的，克服的方法可以在加樣前離心，增加一些增溶輔助試劑如尿素。 蛋白帶過寬，與鄰近泳道的蛋白帶相連是由于加樣量太多，可以減少上樣量。,電泳時(shí)間比正常要長 可能由于凝膠緩沖系統(tǒng)和電極緩沖系統(tǒng)的pH選擇錯(cuò)誤。 指示劑成微笑符號(hào)（指示劑前沿呈現(xiàn)向上的曲線形）：說明凝膠的不均勻冷卻，中間部分冷卻不好，導(dǎo)致分子有不
13、同的遷移率。,.指示劑成微笑符號(hào)（指示劑前沿呈現(xiàn)向下的曲線形），由于電泳槽的裝置不合適，尤其是凝膠和玻璃板組成的“三明治”底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全 .凝膠時(shí)間不對(duì)通常膠在30min內(nèi)凝聚如果凝聚得太慢，可能是TEMED，AP試劑不夠或者失效,7.出現(xiàn)“皺眉”（兩邊向下中間鼓起） 主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。,8.出現(xiàn)“鬼帶” 如何處理？ “鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)在泳道頂端（有時(shí)在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而
14、失去活性，致使原來被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標(biāo)條帶大，有時(shí)不能進(jìn)入分離膠。但它卻于目標(biāo)條帶有相同的免疫學(xué)活性，在WB反應(yīng)中可見其能與目標(biāo)條帶對(duì)應(yīng)的抗體作用。處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補(bǔ)充不足的還原劑；或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。,9.為什么溴酚藍(lán)不能起到指示作用？ 在實(shí)驗(yàn)中常會(huì)遇到溴酚藍(lán)已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來的現(xiàn)象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。處理辦法：更換正確pH值的Buffer；降低分離膠的濃度。,SDS-PAGE的優(yōu)點(diǎn),設(shè)備簡單 快速 分辨率和靈敏度高 特別適用于寡聚蛋白及其亞基
15、的分析鑒定和分子量的測(cè)定,SDS-PAGE的缺點(diǎn),1. 有許多蛋白質(zhì)是由亞基或兩條以上肽鏈組成的（如血紅蛋白、胰凝乳蛋白酶等），他們?cè)谧冃詣┖蛷?qiáng)還原劑的作用下，解離成亞基或單條肽鏈。因此，對(duì)于這一類的蛋白質(zhì)，SDS-PAGE測(cè)定的只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量，而不是完整蛋白質(zhì)的分子量。,SDS-PAGE的缺點(diǎn),2. 還有一些電荷異常和構(gòu)象特殊的蛋白質(zhì)（如組蛋白F1），含有較大輔基的糖蛋白和含有二硫鍵較多的蛋白質(zhì)，以及一些結(jié)構(gòu)蛋白（如膠原蛋白）等，它們?cè)赟DS-凝膠系統(tǒng)中，電泳的遷移率與分子量的對(duì)數(shù)不呈線性關(guān)系。因此，為了測(cè)得真實(shí)和完整的蛋白質(zhì)分子量，通?？刹捎枚喾N方法進(jìn)行測(cè)定和相互驗(yàn)證。,
16、小技巧,1： 電泳緩沖液的使用： 電泳緩沖液是完全可以回收再用的，但前提是每次的內(nèi)層緩沖液必須是新配的。每次在電泳完成后內(nèi)外層緩沖液一起回收到一個(gè)瓶里，作為下次的外層緩沖液使用。就是配制新的緩沖液只作為內(nèi)層使用（配制1L可以用很久的），每次都用回收的緩沖液作外層，效果一點(diǎn)都不差，即節(jié)省了試劑，又節(jié)省了時(shí)間。,2： 電泳條件的選則 電泳不采用先低壓再高壓的常用方法，每次都是上樣后直接采用200V恒壓電泳，一般BioRad的膠板，39min即可跑到頭，電泳結(jié)果一點(diǎn)都沒有影響。,3： 染色與脫色 分子克隆上介紹的方法耗時(shí)太長，現(xiàn)在用Crystal的方法已經(jīng)相當(dāng)快了，稍做改動(dòng)：染色時(shí)加入染液后，在微波爐中煮沸一次即可，切記不要噴了，這個(gè)過程大約2030秒，在搖床上染色，這時(shí)可以去處理膠板，電泳槽，臺(tái)面，待收拾干凈后染色也就結(jié)束了（不要覺得染色時(shí)間太短了，已經(jīng)足夠了，太長了脫色也麻煩），此過程大約需要35min；回收染液，用自來水清洗幾次膠，再加入適量自來水，放入微波爐中煮沸，條件與染色時(shí)一致，搖床脫色，此時(shí)你就可以做其他試驗(yàn)了， 35min后可以再換一次清水，煮沸脫色，我的經(jīng)驗(yàn)是一次用水脫色就可以看到Marker條帶了，兩次以后就可以清析的看到你的結(jié)果了，如果覺得結(jié)果不錯(cuò)可以留存?zhèn)溆茫偌尤朊撋?，脫干凈了就行了?Thanks For Your Attention!,
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