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1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一 DNA重組實(shí)驗(yàn) 要 求1、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)禁止飲食、勿高聲談話、隨意走動(dòng)。2、課前預(yù)習(xí)、課中認(rèn)真操作和課后的實(shí)驗(yàn)報(bào)告。3、妥善保管好每組的實(shí)驗(yàn)器具。4、實(shí)驗(yàn)操作要求人人動(dòng)手。5、每次實(shí)驗(yàn)完畢要驗(yàn)加樣槍的準(zhǔn)確性，然后做好值日衛(wèi)生工作。第3周DNA重組實(shí)驗(yàn) 第4周原核表達(dá)蛋白的SDS-PAGE電泳分析 第5周Western Blotting I 第6周Western Blotting II 時(shí)間分配實(shí)驗(yàn)內(nèi)容10:00-10:30酶切加樣10:30-12:3037酶切；原理講述12:30-13:30回收13:30-14:00連接加樣14:00-16:0025連接；休息16:0-16:3
2、0轉(zhuǎn)化16:30-17:3037孵育培養(yǎng)；倒平皿17:30-18:00涂布 學(xué)習(xí)DNA的酶切、純化及外源片段與載體的連接，將T載體上所攜帶的外源DNA酶切片段亞克隆到表達(dá)載體上。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?、?shí)驗(yàn)原理 限制性內(nèi)切酶可識(shí)別特定位點(diǎn)并切割DNA產(chǎn)生粘性末端或平端的外源片段，經(jīng)DNA的純化處理后用于連接反應(yīng)；選擇表達(dá)載體pET28a多克隆位點(diǎn)上相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切割；在連接酶的作用下將外源片段連接到載體上，實(shí)現(xiàn)外源片段的克隆。實(shí)驗(yàn)材料：外源片段DNACHY基因的PCR產(chǎn)物；載體pET28a-egfp（含有綠色熒光蛋白DNA片段）；BL21感受態(tài)細(xì)胞（鼎國(guó)公司）；培養(yǎng)皿；37搖床及培養(yǎng)箱。實(shí)驗(yàn)試劑：
3、限制性內(nèi)切酶(EcoRI;XhoI)（TaKaRa公司）；T4 DNA連接酶；LB液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基；卡那霉素（kana）:工作濃度100g/mL；氯仿/異戊醇（24:1）；無水乙醇；3M NaAc；70%乙醇；ddH2O。三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑凝乳酶四、實(shí)驗(yàn)步驟 1載體pET28a-egfp和外源DNA片段的限制性酶切：（50l反應(yīng)體系，用1.5ml tube，冰上操作）試劑加樣量DNA5lEcoRI1lXhoI1l10buffer5lddH2O38l37反應(yīng)1hr。分別取8l外源片段酶切產(chǎn)物和5l pET28a-egfp酶切產(chǎn)物于1.0%凝膠檢測(cè)酶切是否完全；按2-5步純化、回收DNA。2
4、加入ddH2O 200l（擴(kuò)大體積），加入等體積氯仿/異戊醇（24:1），顛倒混勻，12000 g離心10 min；3吸取上清200l，加3M NaAc 15l和無水乙醇4 00l，-20放置15分鐘以上；413000rpm 離心10分鐘；5倒去上清，用75乙醇浸洗沉淀，風(fēng)干后外源DNA溶于10l ddH2O（1.5 ml tube中），pET28a-egfp溶于10l ddH2O（1.5 ml tube中）；6連接反應(yīng)（15l體系）：試劑加樣量CHY10 lpET28a-egfp2.5 l10buffer1.5 lT4 Ligase1 l25 30min7.取1只滅菌的EP離心管，a.每管加
5、入感受態(tài)懸液50 ul及連接產(chǎn)物或質(zhì)粒50-100ng 15ul（無菌操作）；b.混勻（不可以振蕩），冰浴 30 min；c.取出放入42C水浴中熱休克90秒，不要搖動(dòng)試管，迅速放入冰中，冰浴5min。d.向每管中加入無抗生素的LB液體培養(yǎng)基400ul，該溶液稱為轉(zhuǎn)化反應(yīng)液。混勻后，于37C（100150rpm）溫和搖振培養(yǎng) 60min，使細(xì)胞恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因（kanar）。8.制備含有適當(dāng)抗生素的LB培養(yǎng)基平板。9.篩選培養(yǎng)：a.取轉(zhuǎn)化反應(yīng)液200 l，均勻涂布于含有Amp抗性的LB培養(yǎng)基平板上。b.將涂布好的平皿置37C平放20 min，然后倒置培養(yǎng)12-1
6、6 h。c.（期間應(yīng)注意觀察，當(dāng)菌落生長(zhǎng)良好，而相鄰菌落尚未相互重疊時(shí)，即停止培養(yǎng)。若發(fā)現(xiàn)菌落太多或太少時(shí)，應(yīng)改變轉(zhuǎn)化反應(yīng)液的用量，重新涂布培養(yǎng)。）1.使用酶時(shí)應(yīng)盡量減少其離開冰箱的時(shí)間，以免活性降低。酶通常保存在50%的甘油中，實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)將反應(yīng)液中甘油濃度控制在1/10以下，否則，酶活性將受影響。2.吸頭、離心管應(yīng)高壓滅菌，每次吸頭用畢應(yīng)更換，不要互相污染試劑。3.加試劑前，應(yīng)短促離心10秒鐘，然后再打開管蓋，以防手套污染試劑及管壁上的試劑污染吸頭側(cè)面。4.防止雜菌和雜DNA的污染。整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等應(yīng)是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理。5.離心操作一定要
7、在低溫下進(jìn)行，所用的水、Eppendorf管都要在冰上預(yù)冷，不能離開冰浴，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)化率將會(huì)降低。6.37振蕩培養(yǎng)時(shí)間不宜過長(zhǎng)，否則會(huì)出現(xiàn)很多的衛(wèi)星菌落和輕微的菌膜干擾。7.平板涂布重組體時(shí)，應(yīng)避免反復(fù)來回涂布，因?yàn)楦惺軕B(tài)細(xì)胞的細(xì)胞壁有了變化，過多的機(jī)械擠壓涂布會(huì)使細(xì)胞破裂、死亡，影響轉(zhuǎn)化效率。8.涂布后培養(yǎng)時(shí)間不宜超過24h，否則會(huì)出現(xiàn)衛(wèi)星菌落。五、注意事項(xiàng)試驗(yàn)設(shè)定二組，1、宿主菌涂布；2、轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物的受體菌涂布。最后比較培養(yǎng)好的平皿，可以看到：含抗菌素培養(yǎng)皿上的受體對(duì)照組并沒有長(zhǎng)出菌落，證明受體菌對(duì)抗菌素是敏感的，并證明在本實(shí)驗(yàn)中沒有發(fā)生抗藥性突變。轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物的受體菌在含抗菌素的培養(yǎng)皿
8、中也長(zhǎng)出了菌落，這不是受體菌的抗藥性的自發(fā)突變株，肯定是質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入細(xì)菌后的轉(zhuǎn)化體，這是因?yàn)閹Э顾幮缘馁|(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入細(xì)菌后，使轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生抗藥性這一遺傳特性的結(jié)果。六、結(jié)果觀察及分析的原則 由于此實(shí)驗(yàn)過程涉及多個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，如酶切、連接、感受態(tài)細(xì)胞、轉(zhuǎn)化等各方面的效率，因此在實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)一些問題。如：1.酶切時(shí)所加的DNA溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成分會(huì)干擾酶反應(yīng)。2.DNA濃度過低時(shí)可適當(dāng)濃縮后再酶切，濃度過高可能酶切不完全可以適當(dāng)稀釋酶切。3.反應(yīng)液中加入過量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質(zhì)可能干擾隨后的反應(yīng)，如果底物DNA較多可以延長(zhǎng)酶反應(yīng)時(shí)間。七、常見問題分析及處理1.限制性酶切反應(yīng)及DNA連接反應(yīng)要注意哪些要點(diǎn)？2.如果一個(gè)DNA酶解液在電泳后發(fā)現(xiàn)DNA未被切動(dòng)，你認(rèn)為可能是什么原因？3.轉(zhuǎn)化后，涂布之前為何要在400L LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)1h？4.如何制備平板？重組體涂布時(shí)應(yīng)注意哪些操作？5.影響轉(zhuǎn)化的主要因素有哪些？八、思考題
XXXX年 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(1)
