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1、一、學習目標一、學習目標 簡述基因工程原理及基本操作過程簡述基因工程原理及基本操作過程二、學習重點和難點二、學習重點和難點1 1、基因工程基本操作程序的四個步驟（重點）、基因工程基本操作程序的四個步驟（重點）2 2、從基因文庫中獲取目的基因（難點）、從基因文庫中獲取目的基因（難點）3 3、利用、利用PCRPCR技術擴增目的基因（難點）技術擴增目的基因（難點）1.21.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1講課課件啟動子啟動子終止子終止子2講課課件非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)與與RNARNA聚合酶聚合酶結合位點結合位點外顯子外顯子內含子內含子1 12 23 34 45
2、5轉轉 錄錄mRNAmRNA前體前體成熟成熟mRNAmRNA加加 工工切除內含子轉錄部分切除內含子轉錄部分3講課課件原核細胞的基因結構原核細胞的基因結構非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 與與RNARNA聚合酶結合位點聚合酶結合位點啟動子啟動子終止子終止子能轉錄相應的信使能轉錄相應的信使RNARNA，能編碼蛋白質，能編碼蛋白質4講課課件基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞目的基因的檢測與鑒定5講課課件一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取 用用3 3分鐘閱讀分鐘閱讀P8-11P8-1
3、1，并思考下列問題，然后用，并思考下列問題，然后用2 2分鐘與同桌交流、討論。分鐘與同桌交流、討論。1 1、獲取目的基因的常用方法有哪些、獲取目的基因的常用方法有哪些?2 2、何謂基因文庫？其類型有哪幾種？、何謂基因文庫？其類型有哪幾種？3 3、如何構建基因文庫？、如何構建基因文庫？4 4、何謂、何謂PCRPCR技術？其原理、條件和過程是怎樣的？技術？其原理、條件和過程是怎樣的？6講課課件一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取7講課課件3 3、基因文庫、基因文庫 又稱又稱DNADNA文庫，將含有某種生物不同基因的許多文庫，將含有某種生物不同基因的許多DNADNA片段，片段，導入受體菌的群體中儲存
4、，各個受體菌分別含有這種生物的不導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，所有受體菌的集合即為該生物的基因文庫。同的基因，所有受體菌的集合即為該生物的基因文庫?；蛭膸煊苫蛭膸煊赏庠赐庠碊NADNA片段、載體片段、載體和和宿主宿主組成。組成。按外源按外源DNADNA片段的來源分基因文庫分為：片段的來源分基因文庫分為：基因組基因組DNADNA文庫：包含了某物種的所有的基因文庫：包含了某物種的所有的基因部分基因文庫：只包含了部分基因文庫（如部分基因文庫：只包含了部分基因文庫（如cDNAcDNA文庫）文庫）8講課課件9講課課件1 1）載體）載體DNADNA片段的制備片段的制備
5、 DNADNA分離純化分離純化限制酶切限制酶切2 2）供體）供體DNADNA片段的制備片段的制備總總DNADNA分離純化分離純化酶切法酶切法分離特定大小分離特定大小DNADNA片段片段3 3）載體與基因組）載體與基因組DNADNA片段的連接片段的連接4 4）重組）重組DNADNA轉化受體細胞轉化受體細胞4.4.基因文庫的構建基因文庫的構建10講課課件基因組文庫的構建基因組文庫的構建通過對受體菌通過對受體菌的培養(yǎng)而儲存的培養(yǎng)而儲存基因基因11講課課件 cDNAcDNA文庫的構建文庫的構建 （反轉錄法）反轉錄法）目的基因的目的基因的mRNAmRNA單鏈單鏈DNADNA反轉錄酶反轉錄酶DNADNA聚
6、合酶聚合酶雙鏈雙鏈DNA(DNA(目的基因目的基因)接到載體接到載體12講課課件小小大大無無有有無無有有某種生物的部分基因某種生物的部分基因 某種生物的全部基因某種生物的全部基因可以可以部分基因可以部分基因可以13講課課件思考：思考：怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因？因？根據(jù)基因的有關信息如根據(jù)基因的有關信息如根據(jù)基因的轉錄根據(jù)基因的轉錄產物產物mRNAmRNA、基因的核苷酸序列、基因翻譯產、基因的核苷酸序列、基因翻譯產物蛋白質物蛋白質等來獲取目的基因。等來獲取目的基因。14講課課件2 2、利用、利用PCRPCR技術擴增目的基因技術擴增目的基因PCRP
7、CR15講課課件 概念概念：PCRPCR全稱為全稱為_，是一項在生物，是一項在生物_復制復制_的核酸合成技術的核酸合成技術 條件：條件：_ _ _、_ _、_原理：原理：_方式：方式：以以_方式擴增，即方式擴增，即_（n n為擴增循環(huán)的次數(shù)）為擴增循環(huán)的次數(shù)）結果：結果：聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應體外體外特定特定DNADNA片段片段DNADNA雙鏈復制雙鏈復制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列(前提條件前提條件)四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸成對引物成對引物DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）指數(shù)指數(shù)2 2n n使目的基因的片段在短時間內成百萬使目的基因的片段在短時間內成百萬
8、倍地擴增倍地擴增16講課課件過程：過程：a a、DNADNA變性（變性（90-9590-95）：雙鏈）：雙鏈DNADNA模板模板 在熱作用下，在熱作用下，_斷裂，形成斷裂，形成_b b、退火（、退火（復性復性55-6555-65）：系統(tǒng)溫度降低，引）：系統(tǒng)溫度降低，引物與物與DNADNA模板結合，形成局部模板結合，形成局部_。c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，酶的作用下，合成與模板互補的合成與模板互補的_。氫鍵氫鍵單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈DNADNA鏈鏈17講課課件PCRPCR的基本反應步驟的基本反應步驟變性變性90-9590-95C C延伸延伸
9、70-7570-75C C退火退火55-6055-60C CPCRPCR總結：總結：18講課課件 基因比較小基因比較小,已知核苷酸序列，直接利已知核苷酸序列，直接利用用DNADNA合成儀用化學方法合成，不需要模板。合成儀用化學方法合成，不需要模板。19講課課件從基因文庫中獲取從基因文庫中獲取利用利用PCRPCR技術擴增技術擴增利用化學方法人工合成利用化學方法人工合成歸納：獲取目的基因的方法歸納：獲取目的基因的方法20講課課件二、基因表達載體的構建二、基因表達載體的構建 核心核心21講課課件質粒質粒DNADNA分子分子一個切口一個切口兩個黏性末端兩個黏性末端兩個切口兩個切口獲得目的基因獲得目的基
10、因DNA DNA 連接酶連接酶重組重組DNADNA分子（重組質粒）分子（重組質粒）同一種同一種 限制酶限制酶1 1、基因表達載體的構建方法、基因表達載體的構建方法22講課課件2.2.基因表達載體的目的基因表達載體的目的（1 1）使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在）使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并可以遺傳給下一代并可以遺傳給下一代（2 2）使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。）使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。23講課課件b b、思考：它們有什么作用？24講課課件 表達載體為什么一定要有啟動子？表達載體為什么一定要有啟動子？（1 1）生物之間進行基因交流，只有使）生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因
11、的啟動子才能有用受體生物自身基因的啟動子才能有利于基因的表達。利于基因的表達。（2 2）通過）通過cDNAcDNA文庫獲得的目的基因沒文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導入受體細有啟動子，只將編碼序列導入受體細胞無法轉錄。胞無法轉錄。25講課課件終止子的作用是什么？終止子的作用是什么？終止子是位于基因尾端的一段特殊終止子是位于基因尾端的一段特殊的的DNADNA片斷，能終止片斷，能終止mRNAmRNA的轉錄。的轉錄。是為了鑒別受體細胞中是否含有目是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來。出來。標記基因有什么作用？標記基因有什么
12、作用？26講課課件三、將目的基因導入受體細胞三、將目的基因導入受體細胞2 2、方法、方法將目的基因導入將目的基因導入植物細胞植物細胞將目的基因導入將目的基因導入動物細胞動物細胞將目的基因導入將目的基因導入微生物細胞微生物細胞農桿菌轉化法農桿菌轉化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注射法顯微注射法感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞27講課課件（1）農桿菌轉化法特點：特點：易感染雙子葉植物和裸子植物，易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力力原理：原理：TiTi質粒上的質粒上的T-DNAT-DNA可以轉移到受體細胞，并整可以轉移到受體細胞，并整合到受體細
13、胞染色體的合到受體細胞染色體的DNADNA上。上。28講課課件轉化過程:TiTi質粒質粒目的基因目的基因構建表達載體導入植物細胞插入植物細胞染色DNA表達新性狀轉入農桿菌29講課課件 基因槍法又稱微彈轟基因槍法又稱微彈轟擊法，是擊法，是利用壓縮氣體利用壓縮氣體產生的動力產生的動力，將包裹在，將包裹在金屬顆粒表面的表達載金屬顆粒表面的表達載體體DNADNA打入受體細胞中打入受體細胞中，使目的基因與其整合并使目的基因與其整合并表達的方法。表達的方法。（2）基因槍法30講課課件（3）花粉通道法 植物花粉在柱頭上萌植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ㄖ蓖?/p>
14、胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加剪去柱頭，然后，滴加DNADNA（含目的基因），使（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道目的基因借助花粉管通道進入受體細胞。進入受體細胞。31講課課件胚珠花藥花絲柱頭花柱子房壁子房雄蕊雌蕊32講課課件2 2、將目的基因導入動物細胞、將目的基因導入動物細胞目的基因表達載體提純目的基因表達載體提純 取卵（受精卵）取卵（受精卵）顯微注射顯微注射 受精卵受精卵 新性狀動物新性狀動物33講課課件微生物作受體細胞原因：微生物作受體細胞原因：繁殖快、多為單細胞、繁殖快、多為單細
15、胞、遺傳物質相對少遺傳物質相對少過程：過程：CaCa2+2+處理大處理大腸桿菌腸桿菌感受態(tài)感受態(tài)細胞細胞表達載體表達載體與感受態(tài)與感受態(tài)細胞混合細胞混合感受態(tài)感受態(tài)細胞吸細胞吸收收DNADNA3.3.將目的基因導入微生物細胞將目的基因導入微生物細胞34講課課件四、目的基因的檢測與鑒定四、目的基因的檢測與鑒定 分子水平檢測分子水平檢測:是否插入目的基因是否插入目的基因 是否轉錄是否轉錄 是否翻譯是否翻譯 個體生物學水平鑒定個體生物學水平鑒定35講課課件1 1、檢測轉基因生物染色體的、檢測轉基因生物染色體的DNADNA上是否插入上是否插入了目的基因了目的基因 首先取出轉基因生物的基因組首先取出轉基
16、因生物的基因組DNADNA；（1 1）方法）方法:DNADNA分子雜交分子雜交（2 2）過程）過程:將含目的基因的將含目的基因的DNADNA片段用放射性同位素等片段用放射性同位素等作標記作標記,以此做探針；以此做探針；使探針和轉基因生物的基因組雜交使探針和轉基因生物的基因組雜交,若顯示若顯示出雜交帶出雜交帶,表明染色體已插入染色體表明染色體已插入染色體DNADNA中。中。（一）檢測（一）檢測36講課課件37講課課件（二）鑒定（個體生物學水平）抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法:分分 子子 雜雜 交交方法:抗原-抗體雜交（蛋白質是抗原）（蛋白質是抗原）過程:用上述探針和轉基因生物的用上述探針和轉基因生物的mRNAmRNA雜交雜交,若出現(xiàn)雜交帶若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉錄出了表明目的基因轉錄出了mRNAmRNA。38講課課件
基因工程步驟50860【行業(yè)特制】
