硬葉兜蘭居群水平的ITS基因擴增與信息分析研究園林藝術(shù)專業(yè)

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1、硬葉兜蘭居群水平的ITS基因擴增與信息分析 摘要 為優(yōu)化兜蘭ITS-PCR反應(yīng)體系，以硬葉兜蘭為試材，用改良的2×CTAB提取總的DNA，以10×PCR buffer1ul、Mg2+1.25ul、dNTP1.2ul、引物0.25ul、Taq酶0.3ul、ddH2O3.45ul為基礎(chǔ)，模板DNA為2ul (50ng/ul)，通過實驗摸索PCR的最佳退火溫度，優(yōu)化反應(yīng)體系，對硬葉兜蘭進行核基因ITS間隔子擴增，通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳在Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)篩選可行反應(yīng)產(chǎn)物。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)測序分析，目的基因片段大小在793-809bp , 通過NBCI網(wǎng)上在線對比分析證實為硬葉兜蘭的ITS基因

2、，該基因與同屬植物的同源性為90%-99%。 關(guān)鍵詞：硬葉兜蘭；ITS間隔子擴增；反應(yīng)體系 目錄 1 前言 2 1.1 兜蘭屬植物的概況 2 1.2 兜蘭屬植物研究進展 4 1.2.1 兜蘭屬植物的繁殖方法 4 1.2.2 ITS技術(shù)在蘭科植物中的運用 6 1.3 研究的目的及意義 7 2材料與方法 9 2.1 材料收集與處理 9 2.2 DNA的提取 9 2.3 ITS-PCR反應(yīng)體系的建立及確定引物退火溫度 10 2.3.1 ITS-PCR反應(yīng)

3、體系的建立 10 2.3.2確定引物退火溫度 11 2.4 產(chǎn)物的檢測與數(shù)據(jù)分析 11 2.5 試劑與儀器 11 3 結(jié)果與分析 12 3.1 DNA質(zhì)量檢測結(jié)果 12 3.2 ITS-PCR反應(yīng)體系 13 3.3退火溫度的確定 13 3.4 目的基因生物學信息 13 3.5 四個居群DNA序列變異情況 16 結(jié)論與討論 21 參考文獻 22 指導(dǎo)老師簡介 24 致謝 25 1 前言 1.1 兜蘭屬植物的概況 兜蘭,也稱“女士拖鞋蘭”、“仙履蘭”,是蘭科（Orchidaceae）兜蘭屬(Paphiopedilum)

4、植物的統(tǒng)稱。在拉丁語中，兜蘭屬名Paphiopedilum由愛神Paphos和鞋Pedilon組成。世界上大約有66種兜蘭屬植物。近年來，已發(fā)現(xiàn)10多個新物種，總數(shù)超過80種[1]。兜蘭屬于亞熱帶植物，主要分布于東南亞至喜馬拉雅低地至中國西南部，僅有少數(shù)物種分布在新幾內(nèi)亞和所羅門群島。中國是兜蘭屬植物的主產(chǎn)區(qū)之一，有18種，主要生長在西南各省和地區(qū)，華南地區(qū)分布很少[2]。大多數(shù)種類的分布范圍很窄，并具有一定的區(qū)域特征。例如杏黃兜蘭（Paphiopedilum armeniacum）、硬葉兜蘭（P. micranthum）、麻栗坡兜蘭（P. malipoense）僅分布在熱帶過渡區(qū)的石灰?guī)r山

5、地中，而紫色兜蘭具有更廣泛的分布區(qū)域。陳心啟等人認為，已知品種的最原始的代表品種可能是麻栗坡兜蘭，是一個從杓蘭屬向兜蘭屬演化的中間類型或過渡類型。在我國各省的分布情況：（1）云南有14種，占全國的77.8％，占世界的21.5％。其中：紫紋兜蘭（P. purpuratum）、同色兜蘭（P. concolor）、帶葉兜蘭（P. hirsutissimum）在云南全境都有分布； 享利兜蘭（P. henryanum）、巨瓣兜蘭（P. bellatulum）、紫毛兜蘭（P. villosum）主要分布于云南的東南部；飄帶兜蘭（P. parishii）、長瓣兜蘭（P. dianthum）、硬葉兜蘭（P.

6、micranthum）主要分布在云南南部； 杏黃兜蘭（P. armeniacum）和虎斑兜蘭（P. markianum）主要分布于云南的西部；彩云兜蘭（P. wardii）、波瓣兜蘭（P. insigne）則分別分布于云南的西南部和西北部（2）貴州有7種，占全國的38．9％，主要有小葉兜蘭（P. barbigerum）、帶葉兜蘭、白花兜蘭（P. emersonii）、同色兜蘭、麻栗坡兜蘭、硬葉兜蘭。（3）廣西有9種，占全國的50％，主要有紫紋兜蘭、卷萼兜蘭、白花兜蘭、紫毛兜蘭、硬葉兜蘭、帶葉兜蘭、同色兜蘭、小葉兜蘭。（4）西藏、廣東和海南各有1種，分別為秀麗兜蘭（P. venustum）、卷萼

7、兜蘭、紫紋兜蘭[3]。外國兜蘭種類德氏兜蘭(P. delenatii)、菲律賓兜蘭(P. philippinense) 、蘇氏兜蘭(P. sukhakulii)、韓氏兜蘭(P. hangianum)等數(shù)十種兜蘭屬植物主要分布在馬來西亞、印度尼西亞、泰國、越南等國家的石灰?guī)r山地的石隙或林下的腐殖土中。其中韓氏兜蘭和德氏兜蘭未來在花卉育種上具有很大的潛力[4]。 兜蘭屬花的形狀非常奇特，唇瓣呈兜狀，類似于一位歐洲少女的拖鞋; 花萼背后特別發(fā)達，具有艷麗的花紋圖案。兜蘭和其他蘭花之間的區(qū)別在于兩個可育雄蕊著生在蕊柱的兩側(cè); 背側(cè)花萼扁圓形或倒心形，最顯著的是在每個瓣中。 因此，以其獨特的魅力和許多

8、優(yōu)美的特征而受到世界花卉愛好者喜愛。杏黃兜蘭和白花兜蘭自從傳入歐美后,獲得近百個有關(guān)美國蘭展的獎項,追捧至今未衰。硬葉兜蘭更是曾勇奪世界蘭展全場總冠軍,驚艷蘭壇。杏黃兜蘭和硬葉兜蘭被譽為“金童玉女”，是蘭花中的瑰寶，備受世人的喜愛[5]。 硬葉兜蘭地生或半附生植物，地下具細長而橫走的根狀莖；根狀莖直徑2-3mm , 具少數(shù)稍肉質(zhì)而被毛的纖維根。葉基生，4-5枚；葉片長圓形或舌狀，革質(zhì)堅硬，長5-15cm , 寬1.5-2cm , 先端鈍，上面深綠色網(wǎng)狀，背面具有密生的紫色斑點和龍骨狀突起，基部收狹成葉柄狀并相互重疊?；ㄝ阒绷ⅲL10-26cm ，紫紅色且具有深色斑點，被長柔毛，頂端具1花；花

9、苞卵形或?qū)捖研危G色而具有紫色斑點，長1-1.4cm ，背面疏被長柔毛；花梗和子房長3.5-4.5cm ，被長柔毛；花大，艷麗，中萼片與花瓣通常白色而有黃色暈和淡紫紅色粗脈紋，唇瓣白色至淺粉紅色，退化雄蕊黃色，具淡紫色斑點和短紋；中萼片卵形或?qū)捖研?，長2-3cm ，寬1.8-2.5cm ，先端銳尖，背面被長柔毛，具龍骨狀突起；合萼片卵形或?qū)捖研?，長2-2.8cm ，寬1.8-2.8cm ，先端鈍或尖，背面被長柔毛，具2條稍鈍的龍骨狀突起；花瓣寬卵形，寬橢圓形或近圓形，長2.8-3.2cm ，寬2.6-3.5 cm，鈍或渾圓形的先端，白色長柔毛在內(nèi)表面的基部，背面多少短柔毛；唇瓣深囊狀，卵狀橢圓

10、形近球形，長4.5-6.5cm ，寬4.5-5.5cm ，基部具短爪，囊口近圓形，整個邊緣內(nèi)折，囊底有白色長柔毛；退化雄蕊橢圓形，長1-1.5cm ，寬7-8mm，先端急尖，兩側(cè)邊緣尤其中部邊緣近直立并多少內(nèi)彎，使中央貌似具縱槽；2枚能育雄蕊由于退化雄蕊邊緣的內(nèi)卷而清晰可辨，甚為美觀?；ㄆ?-5月[6]。 兜蘭屬是蘭科植物群體中非常具有特色的蘭花，也是最奇特的觀賞蘭花。具有“金童玉女”之稱的杏黃兜蘭、硬葉兜蘭和享有“玉兜”美稱的麻栗坡兜蘭都是非常珍貴的種類[5]。另外原產(chǎn)于我國還有同色兜蘭、亨利兜蘭、帶葉兜蘭、彩云兜蘭、長瓣兜蘭……都極具的觀賞性。兜蘭屬植物本身觀賞價值很高,受到各國蘭花愛好

11、者青睞[7]。種植中心和消費市場主要分布在歐美。該品種已有100多年的栽培歷史，注冊品種數(shù)以萬計。我國有豐富的野生兜蘭種質(zhì)資源，但我國兜蘭屬植物栽培歷史較短。到目前為止，還沒有進入真正意義上的品種繁育階段[8]。為了滿足市場的消費需求，世界上的現(xiàn)代兜蘭雜交品種層出不窮。根據(jù)它們的花色，可以分為紅花系、斑點花系、黃花系、白花系和綠花系。其中具有代表性的優(yōu)良品種是斑點花系品種,富凱(P.Andy Yamamoto‘Fuki')；紅色花系品種,蘇瓦達(P. Keyeshill‘Suwada')；綠色花系品種,白花兜蘭(P.Gowerianum‘Album')；白色花系品種,蘇柵的花邊(P.Susan

12、‘Tucker')；黃色花系品種,石灰光(P.Green Moon‘Lime Light')等。根據(jù)花朵數(shù)量，即多華系和單花系來劃分品種是一種更實用的方法。單花系品種陰森峽谷(P.Colorade‘Deep Dark Canyon')、白胡椒(P.Skip Bartlett‘White Pepper')、閃光(P.Maudiae‘Bank House'),多花系品種珍寶(P.SaintSwithin‘Jumbo Jamboree')、蘇柵棚屋(P. Susan‘Booth')和米奇(P.Mike Roccaforte‘Mike')等[9]。然而在備受人們青的同時，蘭屬植物也在減少，近年來，由于

13、生態(tài)環(huán)境的破壞和人們對它們的過度挖掘，兜蘭現(xiàn)已成為世界瀕危植物之一，許多物種瀕臨滅絕。因此，對兜蘭屬植物的保護越來越受到人們的重視。所有野生兜蘭屬物種都被列入《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》而禁止貿(mào)易。近年來，許多學者從不同的角度對兜蘭屬植物的保育學進行了研究。其中，兜蘭的育種生物學是目前研究的熱點[10-11]。鑒于此，蘭科植物可以通過播種、無菌播種、植物繁殖、分子育種、組織培養(yǎng)等技術(shù)進行繁殖[12]。 1.2 兜蘭屬植物研究進展 1.2.1 兜蘭屬植物的繁殖方法 大多數(shù)兜蘭屬植物都分布在熱帶地區(qū)，它們的根部生長在石隙積聚的腐殖質(zhì)土中或在小溪旁的樹皮和潮濕的石頭上，并與苔

14、蘚和蕨類植物一起生長[7]。由于缺乏許多蘭科植物所具有的用來儲藏養(yǎng)料和水分的假鱗莖，氣候適應(yīng)性差。因此兜蘭在栽培管理上較為特殊,在土壤施肥和澆水等方面均與其他熱帶蘭種類有所不同[13]。另外蘭科植物種子非常小,且不具備胚乳,每個茹果中通常含有數(shù)萬粒,萌發(fā)時需要和某些真菌共生,因此在野外的自然萌發(fā)率極低。人們開始運用各種方法對兜蘭屬植物進行繁殖。 組織培養(yǎng) 組織培養(yǎng)技術(shù)在兜蘭屬植物大規(guī)模繁殖中的應(yīng)用，對瀕危野生種兜蘭具有重要意義。然而，兜蘭屬植物的組織培養(yǎng)技術(shù)難度很大，在這一領(lǐng)域的成功報道很少，組織培養(yǎng)技術(shù)還無法實現(xiàn)兜蘭屬植物的規(guī)?；a(chǎn)。目前，對兜蘭組織培養(yǎng)的研究主要集中在外植體類型、不同

15、階段培養(yǎng)基的優(yōu)化和激素的選擇等方面。目前，兜蘭組織培養(yǎng)一般以莖尖、葉片、幼蟲根等為外植體，莖尖是最常用的外植體部位，成功率較高。但是，兜蘭屬植物莖非常短，取材比較困難，易受細菌污染。目前只有少數(shù)幾種，如杏黃兜蘭、硬葉兜蘭等，其側(cè)芽可像根狀莖一樣伸長，便用于莖段培養(yǎng)[14]。楊燕平[15]等人以亨利兜蘭的側(cè)芽為外植體，研究了基本培養(yǎng)基類型和激素濃度對繼代增殖的影響。結(jié)果表明：莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基以Heller培養(yǎng)基＋6-BA 2.0mg/L＋NAA 0.2mg/L＋活性炭0.5g/L最佳。在繼代培養(yǎng)中，培養(yǎng)基1/2MS＋6-BA0.2mg/L＋NAA2.0mg/L＋椰汁100ml/L＋活性炭2.0g/

16、L的叢生芽增殖效果最好，增殖倍數(shù)達到3.50。壯苗生根以1/2MS＋NAA1.0mg/L＋土豆汁100ml/L＋活性碳2.0ｇ/Ｌ培養(yǎng)基為優(yōu)。　 有菌播種 兜蘭的種子沒有胚乳，自然條件下需要與真菌共生獲得營養(yǎng)才能萌發(fā)。兜蘭的雜交種子一般需要在含有共生真菌的兜蘭原生地土壤或播種在兜蘭母株的基質(zhì)中才能萌發(fā)，但萌發(fā)率低[12]。目前，此方面的研究還處于起步階段，研究重點主要集中于不同兜蘭種共生真菌的分離及其對兜蘭生長的影響。李明等采用根組織切片法從杏黃兜蘭根內(nèi)分離到13株真菌，鐮刀菌和組絲核菌為優(yōu)勢菌。將組絲核菌JF74、JF75、JF80制成菌劑，施入杏黃兜蘭根部，對杏黃兜蘭產(chǎn)生了一定的促進生

17、長的效果。朱鑫敏[12]等從硬葉兜蘭和杏黃兜蘭根中分別分離得到瘤菌根菌屬真菌PM-１和美孢膠膜菌PA-１，并觀察在不同的培養(yǎng)基上２種真菌對硬葉兜蘭和杏黃兜蘭生長的影響，結(jié)果表明，基養(yǎng)分水平能顯著影響內(nèi)生真菌與杏黃兜蘭的共生關(guān)系，營養(yǎng)相對貧瘠的 ＤＥ培養(yǎng)基有利于兩者共生，而營養(yǎng)豐富的 Ｈarvais培養(yǎng)基不利于共生?，F(xiàn)在已經(jīng)分離得到許多與兜蘭共生的真菌，研究表明這些真菌對兜蘭的生長有明顯的促進作用。而共生真菌促進兜蘭種子萌發(fā)的相關(guān)研究較少。 分株繁殖 兜蘭屬植物在生長狀態(tài)良好條件下下,每年都能從基部發(fā)出新的萌糵,一般情況下，2-3年便可以和母株分開,進行繁殖。通過分株與換盆相結(jié)合,在早春或花后

18、皆可進行。分株繁殖前要停水3天,使基質(zhì)內(nèi)的水分排干后才可進行。分株時,把整盆植株從花盆中帶基質(zhì)一起取出,然后把基質(zhì)輕輕地去除,清理干凈。由于兜蘭屬植物的根系較少,因此在去除基質(zhì)時,要做到根系造成損傷,去除爛根和萎縮的老根即可。剪刀用酒精浸泡過后把爛根除去,然后把植株輕輕分開,有些新的植株尚未與老株完全脫離,但是根系比較發(fā)達,可以用刀片從中間分開,并在其傷口涂上抹硫磺粉,防止細菌的侵人,加快傷口愈合。一般可以把2-3株新苗在一起進行上盆[16]。 1.2.2 ITS技術(shù)在蘭科植物中的運用 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）位于18S-5.8S-26S區(qū)，由三部分組成：ITS1和ITS2以及它們之間高度

19、保守的5.8S rDNA外顯子區(qū)。在被子植物中，該區(qū)域的總長度在500?750bp之間，但在其他種子植物中可能較長，達到1500?3500bp。所有的間隔區(qū)都會被組裝成成熟的核糖體，ITS1和ITS2的轉(zhuǎn)錄物在rRNA加工的過程中會被切掉，但這兩部分在核rRNA成熟中起重要作用。現(xiàn)在可以肯定的是ITS2對于在核糖體來源理論中構(gòu)建rRNA的大亞基是必需的。所有間隔區(qū)的正確高階結(jié)構(gòu)對于找到指端核苷酸的合適切割位點很重要。雖然ITS2的序列長度在不同生物體中變化很大，但Hadjiolova等證實哺乳動物和釀酒酵母具有結(jié)構(gòu)同源域。與編碼區(qū)域相比，間隔區(qū)進化得更快。例如，內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS），在研究

20、屬內(nèi)種間和更緊密的家族間、屬間關(guān)系時都表現(xiàn)出較高的趨異率，并且已經(jīng)在不同水平的系統(tǒng)重建中被廣泛使用[17]。 在近緣種親緣關(guān)系中的應(yīng)用 Cox[17])等應(yīng)用核rDNA ITS序列研究了兜蘭屬 (Paphiopedilum)、美洲兜蘭屬(Phragmipedium)、杓蘭屬 (Cypripedium)、墨西哥蘭屬(Mexipedium)、碗蘭屬(Selenipedium) 的150～170個種之間的親緣關(guān)系，證明兜蘭屬的劃分與傳統(tǒng)分類基本一致。丁小余[18]等分別對束花石斛(Dendrobium chrysanthum ) 、曲莖石斛 (D. flexicaule )及其同屬相似種進行r

21、DNA ITS區(qū)域序列比較研究，挑選出了15個和7個堿基位點用作鑒別束花石斛及其近緣種、曲莖石斛 及其近似種的DNA證據(jù)。 在系統(tǒng)進化中的應(yīng)用 Tsai[17]根據(jù)ITS序列的差異，確定了臺灣12種石斛屬植物的親緣關(guān)系，并對12種石斛屬植物和2種非石斛屬植物的ITS序列進行了全面分析。共發(fā)現(xiàn)684個特征，并測定了它們的遺傳距離，建立了系統(tǒng)發(fā)育樹。Gravendeel等通過利用獨蒜蘭屬(Pleione)質(zhì)體DNA和rDNA ITS 序列并結(jié)合形態(tài)學的方法特點，分析了獨蒜蘭屬野生種的起源和進化趨勢。 在分子系統(tǒng)地理學中的應(yīng)用 分子系統(tǒng)地理學起源于20世紀70年代中期線粒體DNA的研究， 主

22、要研究物種內(nèi)不同物種現(xiàn)有分布格局的歷史原因和演變。 植物分子系統(tǒng)地理學通常利用植物葉綠體DNA來估計植物物種遺傳變異的空間分布格局，并確定植物在冰期的避難所和冰期后的遷移路線。估測近緣種之間的歧化時間以及確定植物物種的保護單元[18]。 近年來，分子系統(tǒng)地理學已被應(yīng)用于蘭科植物的研究。Tsai等基于核糖體DNA和質(zhì)體DNA(包括trnL、trnL-F、atpB-rbcL間隔區(qū))對來自蘇門答臘島、馬來西亞半島和明打威群島的蝴蝶蘭(Phalaenopsis violacea)進行研究，并利用核r DNA ITS 以及質(zhì)體DNA的trnL內(nèi)含子和atpB-rbc L間隔區(qū)對蝴蝶蘭屬的系統(tǒng)進化和生物地

23、理學分布進行了深入探討[17]。 1.3 研究的目的及意義 傳統(tǒng)的植物系統(tǒng)學建立是以形態(tài)解剖學、孢粉學、生理學、生物化學等性狀的表型為基礎(chǔ)的。然而，從分子遺傳學的角度來看，表型的差異是由基因型的差異引起的。因此，直接分析植物DNA序列進行分析，可以在基因組水平上為植物系統(tǒng)學提供最有力、最直接的依據(jù)，從而在分子水平上了解物種分化的內(nèi)在原因和物質(zhì)基礎(chǔ)[19]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展，分子標記技術(shù)在蘭科植物種質(zhì)資源、遺傳多樣性、系統(tǒng)進化研究中得到了廣泛的應(yīng)用。在被子植物中，rDNA ITS的核苷酸序列具有高度的變異性和長度的保守性，這表明這些間隔區(qū)的序列很容易在近緣類群間排序，而且豐富的變異

24、可在較低的分類階元上解決植物系統(tǒng)的發(fā)育問題。因此，解決植物系統(tǒng)發(fā)育問題的方法被廣泛地應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育和親緣關(guān)系的研究中[20]。ITS的諸多優(yōu)點使其成為一種重要的分子標記，廣泛應(yīng)用于植物近源分類、物種鑒定、物種進化、物種起源、分子系統(tǒng)地理學等方面。目前，利用核rDNA ITS標記對蘭科植物進行研究尚屬空白。在一些蘭科植物中，由于遺傳變異等原因，在rDNN中其區(qū)域差異很小，無法有效區(qū)分，因此，需要依靠傳統(tǒng)的細胞遺傳學、形態(tài)學鑒定及其他分子標記方法對其進行補充。隨著現(xiàn)代分子生物學的迅速發(fā)展和植物基因組測序的不斷深入，人們對ITS有了更全面、更深入的認識，探索出更好的方法用于蘭科植物種質(zhì)資源鑒定和系統(tǒng)

25、學的研究，特別是在我國藥用蘭科植物、珍稀瀕危蘭科植物的分類鑒定和種質(zhì)資源保護等方面將發(fā)揮重要作用[17]。 2材料與方法 2.1 材料收集與處理 通過隨機抽樣，個體之間距離在1m以上，選擇植株生長狀況良好，病害少，少蟲害等的四個居群，用剪刀剪下其葉，記好編號并貼上標簽，帶回實驗室。采集后放入-70℃保存，用液氮磨細后裝入離心管保存于-70℃。 表1 四種硬葉兜蘭及其來源 四種硬葉兜蘭及其來源 居群編號 物種 地點 1 山車硬葉兜蘭 馬關(guān)縣坡腳 2 硯山梅子菁硬葉兜蘭 硯山縣梅子菁 3 奢都

26、硬葉兜蘭 文山縣柳井 4 東山硬葉兜蘭 麻栗坡八里河 2.2 DNA的提取 采用改良的CTAB法提取基因組DNA，步驟如下： （1） 提前將水浴鍋加熱到65℃，同時預(yù)熱2×CTAB，異丙醇放入-70℃（2）取0.3g 在液氮中研磨過的硬葉兜蘭葉片裝入1.5ml離心管中，往離心管中加入3%PVP和2%β-巰基乙醇混合液500ul；靜置10min，中間搖晃兩次;然后在離心機中以12000r/min離心5min,倒掉上清液。（3）加入650ul預(yù)熱的2×CTAB搖勻，65℃水浴鍋中放1h。第一次搖晃間隔5min，剩下的55min每間隔10min搖一次，時間到后取出冷卻至常溫。（

27、4）冷卻后加入等體積（2×CTAB的體積650ul）的24：1（三氯甲烷：異丙醇）混勻，靜置15min；然后在離心機中以12000r/min離心10min，取出上清液于另一個1.5ml離心管中，再次加入等體積的24：1靜置10min,然后在離心機中以12000r/min離心10min，取出上清液。（5）往取出的上清液中加入2/3體積的-70℃的異丙醇，放入-70℃中30min,融化后12000r/min離心10min，倒出上清液。（6）加入75%乙醇洗滌，12000r/min離心5min，倒出乙醇。（8）將DNA置于37℃的烘箱中烘干，后加入30μlRNase酶水，輕輕彈均勻，于-20℃冰箱備

28、用。 2.3 ITS-PCR反應(yīng)體系的建立及確定引物退火溫度 2.3.1 ITS-PCR反應(yīng)體系的建立 以硬葉兜蘭基因組DNA為模板，經(jīng)初步篩選以ITS1和ITS4為本次試驗的固定引物，以10×PCR buffer 1ul、 Mg2+ 濃度2.5mol/L 、dNTP濃度0.3mmol/L 、引物濃度0.5umol/L、Taq DNA酶濃度0.6U/10ul、ddH2O 3.45ul為反應(yīng)物質(zhì)。以10×PCR buffer 1ul、Mg2+1.25ul、dNTP 1.2ul、引物 0.25ul、Taq酶0.3ul、ddH2O 3.45ul為單位用量。通過改變反應(yīng)物質(zhì)用量，模板DNA為

29、2ul (純度50ng/ul)用量不變，對硬葉兜蘭進行核基因ITS間隔子擴增進行較研究。共8組，每個DNA 3次重復(fù)。模板DNA為2ul (濃度50ng/ul)。其他各成分按照表2計算加樣。上述提到的引物、Taq酶、dNTP均由生工生物技術(shù)有限公司提供。 表2 兜蘭ITS—PCR反應(yīng)體系的因素 實驗表 因素 濃度 單位用量 Tap DNA聚合酶 0.6U/10ul 0.3ul Mg2+ 2.5mol/L 1.25ul 引物 0.5umol/L 0.25ul dNTP 0.3mmol/L 1.2ul 10×PCR buffer 1ul ddH2O

30、 3.45ul 組合 1 2 3 4 5 6 7 8 用量倍數(shù) 8 14 20 26 32 40 46 60 PCR擴增在Bio-Rad梯度PCR擴增儀上進行,反應(yīng)程序為：預(yù)變性：94℃，4min；變性：94℃，1min；退火：根據(jù)引物選擇合適的退火溫度，52.5℃,1min；延伸：72℃，90s；循環(huán)：從2到4共35個循環(huán)；72℃下最后延伸10min； 4℃放置備用。 2.3.2確定引物退火溫度 在確定最佳反應(yīng)體系后，用Bio-Rad梯度PCR擴增儀對本次試驗所用引物的退火溫度進行優(yōu)化篩選。設(shè)定退火溫度為50.

31、0～58.0℃。擴增儀自動生成8個梯度，即50.0、50.2、50.8、51.6、52.5、53.5、54.5、55.5、56.4、57.2、57.8、58.0℃，通過PCR擴增，所得產(chǎn)物用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測。 2.4 產(chǎn)物的檢測與數(shù)據(jù)分析 基因組DNA的檢測取3ul溴酚藍核酸染色劑與3uL樣品上緩沖液混勻，于0.8％瓊脂糖凝膠上220V電壓下電泳20min左右。用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)檢測并拍照存，PCR擴增產(chǎn)物的檢測，取3ul溴酚藍核酸染色劑與3ul樣品上緩沖液混勻，通過瓊脂糖凝膠電泳在220V電壓下電泳15min左右。用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)篩選可行反應(yīng)體系。

32、 2.5 試劑與儀器 藥品：液氮、CTAB、異丙醇（用前放于-20℃冰箱過夜）、75%酒精、1mol/LTris-C、0.5mol/LEDTA、99.99%β-巰基乙醇、10mg/mlRNase酶貯藏液、氯仿、異戊醇、溴酚藍、NaOH、瓊脂糖、溴化乙錠、DNAmaker、濃鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、TaqDNA聚合酶、引物、dNTPs。 器材：離心管1.5ml、電子天平、研缽，移液槍、量筒、各類槍頭、恒溫水浴鍋、4℃冰箱、-20℃冰箱、臺式高速離心機、DYY-8B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠）、DYY-33A，34A電泳槽、Gen Genius凝膠成像系統(tǒng)、Nano Vue超微量分光光

33、度計、微波爐、Gene Amp PCR system 9700（Applied Biosystems） 3 結(jié)果與分析 3.1 DNA質(zhì)量檢測結(jié)果 對4個居群提取的DNA進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳抽樣檢測，如圖1。所提取的DNA條帶清晰，無拖尾現(xiàn)象，DNA保存較完好，沒有發(fā)生降解。符合后續(xù)實驗的質(zhì)量要求。 圖1 基因組DNA的檢測 對作為PCR擴增的模板DNA進行核酸質(zhì)量測量，測量其濃度和OD值（DNA模板質(zhì)量要求：DNA純度>200ng/ul 和 1.8

34、6ng/ul-1101.8ng/ul之間，有幾個樣的濃度低于200ng/ul，如2-7（196.7ng/ul）、2-15（199.9ng/ul）、3-5（192.8ng/ul）等，但是OD值較高。所以可用作PCR擴增的DNA模板。 表3 DNA純度和OD值測定 居群1 居群2 居群3 居群4 樣本編號 濃度（ng/ul） OD值 樣本編號 濃度（ng/ul） OD值 樣本編號 濃度（ng/ul） OD值 樣本編號 濃度（ng/ul） OD值 1-1 413.1 1.81 2-2 192.4 1.88 3-3 196.6 1.86 4-

35、2 223.5 1.86 1-2 369.2 1.92 2-3 1078.2 1.80 3-4 223.7 1.91 4-4 1101.8 1.81 1-4 523.3 1.87 2-4 296.8 1.91 3-5 192.8 1.91 4-9 350.8 1.87 1-5 325.4 1.90 2-5 1096.1 1.83 3-6 181.6 1.86 4-10 187.4 1.81 1-6 744.5 1.81 2-6 476.0 1.87 3-7 430.7 1.82 4-11 342.

36、1 1.86 1-8 509.6 1.83 2-7 196.7 1.88 3-8 287.9 1.90 4-12 343.5 1.86 1-9 354.6 1.82 2-13 563.7 1.83 3-9 894.5 1.96 4-23 534.7 1.84 1-10 858.1 1.89 2-14 524.1 1.86 3-11 376.8 1.84 4-24 422.4 1.87 1-11 416.0 1.89 2-15 199.9 1.88 3-12 456.5 1.85 4-26 634.8

37、 1.83 1-13 522.7 1.83 2-18 444.8 1.82 3-14 184.7 1.83 4-27 546.8 1.91 注：1-山車居群；2-梅子菁居群；3-奢都居群；4-東山居群 3.2 ITS-PCR反應(yīng)體系 PCR擴增在Bio-Rad梯度PCR儀擴增經(jīng)過凝膠電泳，從圖2可知，8個處理組合中，都有一條單一的明亮條帶，豐度高，并且沒有拖尾現(xiàn)象，每組3次重復(fù)實驗的穩(wěn)定性較好，目的基因片段大小約為800bp ，PCR反應(yīng)產(chǎn)物基因片段高，達到了PCR反應(yīng)產(chǎn)物測序要求。因此所建立的PCR擴增體系能夠滿足硬葉兜蘭植物ITS擴增的要求。 圖

38、2 硬葉兜蘭ITS-PCR擴增結(jié)果 3.3退火溫度的確定 在硬葉兜蘭的PCR擴增中，不同的物種、不同引物最佳退火溫度有所不同。退火溫度過低會發(fā)生非特異性擴增，過高會影響到引物與模板DNA結(jié)合而降低擴增效率。經(jīng)過多次實驗操作摸索，為避免非特異擴增對試驗結(jié)果造成影響，試驗最終確定引物的最適退火溫度為52.5℃。 3.4 目的基因生物學信息 此次試驗所用材料共4個居群84個樣本，有37個樣本擴增序列成功。從表4中可知，目的基因片段大小在793-809bp之間。居群1中有6個擴增成功，目的基因大小在805-809bp之間，目的基因最大的是1-7，大小為809bp，最小的是1-2和1-5，大小

39、為805bp；居群2中有11個擴增成功，目的基因在802-809bp之間,目的基因最大的是2-14，大小為809bp，最小的是2-3，目的基因大小為802bp；居群3有8個擴增成功，目的基因在800-808bp之間，目的基因最大的是3-3，大小為808bp,最小的是3-9，目的基因大小為800bp；居群4中有12個擴增成功，目的基因在793-808bp之間，目的基因最大的是4-23，大小為808bp,目的基因最小的4-4和4-27，目的基因大小為793bp。 表4 不同居群ITS基因大小 居群1 居群2 居群3 居群4 樣本編號 基因（bp） 樣本編號 基因（bp） 樣

40、本編號 基因（bp） 樣本編號 基因（bp） 1-2 805 2-1 805 3-3 808 4-2 800 1-5 805 2-2 807 3-5 805 4-4 793 1-6 808 2-3 802 3-6 802 4-9 801 1-7 809 2-4 806 3-8 807 4-10 796 1-8 807 2-7 805 3-9 800 4-12 807 1-9 807 2-13 805 3-11 807 4-21 806 2-14 809 3-12 802 4

41、-23 805 2-15 805 3-14 806 4-24 805 2-18 808 4-26 808 2-19 806 4-27 793 2-20 807 4-30 806 4-34 806 注：居群1-山車居群；居群2-梅子菁居群；居群3-奢都居群；居群4-東山居群 選擇居群1中15-3樣本為擴增基因，通過NBCI數(shù)據(jù)庫進行網(wǎng)上在線blast 比對，如圖3和圖4。目的基因為硬葉兜蘭的 ITS 基因，該基因與兜蘭屬植物同源率及同源物種，如表5。核苷酸序列的同源性最高

42、99%，為硬葉兜蘭，同源性稍低的為杏黃兜蘭，同源性為98%；有2種同源物種的是同源性為96%的馬面兜蘭、綠葉兜蘭和同源性為93%的越南兜蘭、假白旗兜蘭。同源性最低的是紫毛兜蘭、白旗兜蘭、海倫兜蘭、紫紋兜蘭、帶葉兜蘭、亨利兜蘭、瘤瓣兜蘭、蘇式兜蘭，同源性為90%。 表5 居群1中15-3 ITS基因核苷酸序列與蘭屬植物同源率及同源物種 同源率 99% 98% 96% 95% 94% 93% 92% 91% 90% 同源物種 硬葉兜蘭 杏黃兜蘭 馬面兜蘭 德式兜蘭 菲律賓兜蘭 越南兜蘭 麻栗坡兜蘭 波瓣兜蘭 紫毛兜蘭

43、 綠葉兜蘭 硬葉兜蘭 卓別林兜蘭 假白旗兜蘭 同色兜蘭 白旗兜蘭 國王兜蘭 流放兜蘭 巨瓣兜蘭 海倫兜蘭 麻栗坡兜蘭 巖地兜蘭 紫紋兜蘭 百花兜蘭 黃花囊蘭 帶葉兜蘭 桑德兜蘭 小葉兜蘭 亨利兜蘭 格力兜蘭 瘤瓣兜蘭 蘇式兜蘭 圖3 15-3的ITS核苷酸序列 圖4 目的基因核苷酸序列與蘭屬植物同源性比較 3.5 四個居群DNA序列變異情況 通過ITS-PCR擴增

44、反應(yīng)，所獲得的目的基因片段大小在793-806bp 之間，采用DNAstar分析四個居群37樣本的ITS序列組成進行對比，結(jié)果見圖5，一共有431個堿基發(fā)生變異，平均每個樣本有12個位點變異，變異堿基占總位點的比例是1：67。分別在堿基 A、C、G、T位點上發(fā)生了變異。 Megalign 系統(tǒng)分析圖 圖5-1 圖5-2 圖5 不同樣本ITS核苷酸序列比對分析 4個居群37個樣本中有53個變異位點，如圖6，每個樣本平均有1個變異位點。由表6可知硬葉兜蘭種群植物的一些基因發(fā)生了變異，則堿基T和C、C和G、 C和T、A和G、A和T之間相互轉(zhuǎn)變 ；還有

45、一些無堿基位點增添為G和A。 表6 不同居群基因突變位點情況統(tǒng)計 項目 居群1 居群2 居群3 居群4 原堿基→變異堿基 C→T T→C C→G A→G G→T C→A A→T T→C —→G C→T T→C G→A C→G C→A G→T _→A T→A A→C G→C T→C C→T G→C C→A G→T G→A T→A A→C T→C C→T C→G G→C C→T C→A G→T A→C A→T A→G 堿基變異數(shù)目 64 46 112 209 不同居群堿基變

46、異情況由圖6所示，居群1中有含27個變異位點，6個樣本，每個樣本平均5個變異位點；居群2中有含30個變異位點，11個樣本，每個樣本平均3個變異位點；居群3中有含31個變異位點，8個樣本，每個樣本平均4個變異位點；居群4中有含44個變異位點，12個樣本，每個樣本平均4個變異位點. 圖6-1 圖6-2 圖6 居群4 不同樣本ITS核苷酸序列比對分析 ITS屬于保守序列，變異位點很少，四個居群中37個樣本ITS序列變異位點有一定的相似性，變異位點多集中在前端1至18位點之間和末端788至816位點之間，有49個位點發(fā)生變異，同時居群1、居群2、居群3在位點50、171、511、68

47、5有4個位點變異。不同樣本之間位點變異不一樣，如表7，居群1中，變異最多的是1-9，有18個位點變異，變異位點最少的是1-8，有6個變異位點；居群2中，變異最多的是2-8，有19個位點變異，變異位點最少的是2-13和2-14，有5個變異位點；居群3中，變異最多的是3-6，有24個位點變異，變異位點最少的是3-3，有8個變異位點；居群4中變異最多的是4-4和4-9，有30個位點變異，變異位點最少的是4-34，有6個變異位點。突變位點占到0.74%—3.78%。 表7 不同樣本之間的位點變異數(shù) 居群1 居群2 居群3 居群4 樣本編號 基因（bp） 位點變異數(shù)目（個） 樣

48、本編號 基因（bp） 位點變異數(shù)目（個） 樣本編號 基因（bp） 位點變異數(shù)目（個） 樣本編號 基因（bp） 位點變異數(shù)目（個） 1-2 805 8 2-1 805 8 3-3 808 8 4-2 800 19 1-5 805 10 2-2 807 10 3-5 805 22 4-4 793 30 1-6 808 10 2-3 802 7 3-6 802 24 4-9 801 30 1-7 809 11 2-4 806 10 3-8 807 9 4-10 796 27 1-8

49、807 6 2-7 805 6 3-9 800 25 4-12 807 15 1-9 807 18 2-13 805 5 3-11 807 17 4-21 806 15 2-14 809 5 3-12 802 15 4-23 805 11 2-15 805 9 3-14 806 13 4-24 805 7 2-18 808 19 4-26 808 11 2-19 806 14 4-27 793 22 2-2

50、0 807 8 4-30 806 11 4-34 806 6 結(jié)論與討論 1） 試驗通過ITS—PCR擴增研究，對硬葉兜蘭進行核基因ITS間隔子擴增。以10×PCR buffer1ul、Mg2+1.25ul、dNTP1.2ul、引物0.25ul、Taq酶0.3ul、ddH2O3.45ul為基礎(chǔ)，模板DNA為2ul (濃度50ng/ul)不變，通過實驗摸索，確定PCR最適的退火溫度為度為52.5℃，PCR擴增在Bio-Rad梯度PCR擴增儀上進行,反應(yīng)程序為：預(yù)變性：94℃

51、，4min；變性：94℃，1min；退火：根據(jù)引物選擇合適的退火溫度，52.5℃,1min；延伸：72℃，90s；循環(huán)：從2到4共35個循環(huán)；72℃下最后延伸10min； 4℃放置備用。據(jù)Baldwin B G統(tǒng)計，被子植物核rDNA的ITS區(qū)包括5.8S rDNA在內(nèi)的總長度為600-700bp，其中ITS1和ITS2的長度比較保守。此次實驗均可獲得條帶清晰、單一、無拖尾的目的基因，片段大小在700-800bp之間。利用此反應(yīng)體系可得到預(yù)期大小的ITS基因片段。 2） rDNA ITS 由ITS1、5.8S 和 ITS2 組成，5.8S為編碼序列，在進化過程中所受的壓力較大，發(fā)生變異較少，

52、序列長度和堿基組成相對保守; 而ITS1 和 ITS2 為非編碼區(qū)，在進化過程中所受的選擇壓力較小，堿基變異較多，存在著豐富的多態(tài)性，也因此在植物鑒定中得到了廣泛應(yīng)用。利用此原理可以鑒別不同種質(zhì)來源的硬葉兜蘭。通過NBCI網(wǎng)上在線對比分析證實為硬葉兜蘭的ITS基因，該基因與同屬植物的同源性最高為99%，同源物種為硬葉兜蘭，與杏黃兜蘭98%同源，與馬面兜蘭、綠葉兜蘭96%同源，與德式兜蘭、硬葉兜蘭、國王兜蘭、麻栗坡兜蘭等95%同源，與紫毛兜蘭、瘤瓣兜蘭、紫紋兜蘭等90%同源。 3） ITS序列(包括5.8S)相對于其他基因序列而言，在個體及群體甚至整個植物界都是相當保守的，變異位點較少。此實驗的ITS序列位點突變率在0.74%—3.78%之間，變異位點的堿基在C、G、A、T發(fā)生置換或缺失和無堿基位點發(fā)生增添，53個變異位點中C堿基位點占28.3%，G堿基位點占11.3%，A堿基位點占15.1%，T堿基位點占30.2%，無堿基位點發(fā)生增添占15.1%。