第四章 DNA復制 王赟

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1、DNADNA復制復制DNA復制可能的三種方式復制可能的三種方式由Meselson和Stahl設計證明半保留復制的實驗的被譽為生物學最美麗的實驗半保留復制實驗親代DNA；15N標記在15N標記培養(yǎng)基中培養(yǎng)：15N標記DNA移到14N標記DNA培養(yǎng)基中氯化銫密度梯度超離心15N DNA在14N DNA培養(yǎng)基中培養(yǎng)第1.n代親代F1F2FnMeselson 和Stahl的證明DNA半保留復制的實驗流程 Meselson 和和Stahl的實驗結果的實驗結果MeselsonMeselson與與StalhStalh在在4242年以后在年以后在最初他們相最初他們相遇的一顆樹遇的一顆樹下重逢時的下重逢時的合影

2、合影半保留復制的實驗結果15N DNA顯示為一條重密度帶位于離心管的管底。15N DNA和14N-DNA的雜交分子中密度帶。第二代有中密度帶及低密度帶兩個區(qū)帶，這表明它們分別為15N 14N DNA和14N-DNA。在14N培養(yǎng)基中培養(yǎng)代數(shù)的增加，低密度帶增強，而中密度帶逐漸減弱。半保留復制進一步的實驗證椐15N DNA、14N DNA雜交分子經(jīng)加熱變性，對于變性前后的DNA分別進行CsCl密度梯度離心。結果變性前的雜交分子為一條中密度帶，變性后則分為兩條區(qū)帶，即重密度帶(15N DNA)及低密度帶(14N DNA)。15N DNA第一代變性前后超離心15N DNA第一代：變性前變性后排除了彌

3、散復制排除了彌散復制Taylor以蠶豆根尖細胞為材料、使用放射性同位以蠶豆根尖細胞為材料、使用放射性同位素證明真核細胞素證明真核細胞DNA也是半保留復制也是半保留復制的實驗。的實驗。DNA的半保留復制兩條鏈分別做模板各自合成一條新的DNA鏈，子代DNA 分子中一條鏈來自親代DNA，另一條鏈是新合成的，這種復制方式稱為半保留復制。某些生物DNA復制的引物序列 證明證明DNA復制的方向始終是復制的方向始終是53的末端終止實驗的末端終止實驗 DNA復制起始區(qū)的特征復制起始區(qū)的特征由多個短的重復序列組成；能夠被多亞基的復制起始區(qū)結合蛋白識別；通常富含AT堿基對，這有利于DNA復制起動時的解鏈，因為AT

4、堿基對含有的氫鍵數(shù)目低于GC堿基對。DNA復制起始區(qū)的特征復制起始區(qū)的特征電鏡下真核生物電鏡下真核生物DNA的多個復制叉結構的多個復制叉結構復制叉的結構復制叉的結構當當DNADNA復制從起復制從起始區(qū)起動的時候，始區(qū)起動的時候，起始區(qū)的起始區(qū)的DNADNA雙雙鏈因發(fā)生解鏈而鏈因發(fā)生解鏈而形成叉狀結構，形成叉狀結構，這樣的結構被稱這樣的結構被稱為復制叉為復制叉 真核生物真核生物DNA復制子復制子 復制開始時，將大腸桿菌放在含低劑量的復制開始時，將大腸桿菌放在含低劑量的3H-dT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾分鐘；隨后，將細菌轉移到含高劑量的幾分鐘；隨后，將細菌轉移到含高劑量的3H-dT的培養(yǎng)基中

5、繼續(xù)的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)一段時間；最后，收集細胞，小心地裂解以抽取其中的染色培養(yǎng)一段時間；最后，收集細胞，小心地裂解以抽取其中的染色體體DNA進行放射自顯影。如果是單向復制，自顯影圖譜上銀顆粒進行放射自顯影。如果是單向復制，自顯影圖譜上銀顆粒的密度應該是一端高、一端低；如果是雙向復制，則應該中間是的密度應該是一端高、一端低；如果是雙向復制，則應該中間是一段低密度的銀顆粒，兩側是高密度的銀顆粒。低密度銀顆粒意一段低密度的銀顆粒，兩側是高密度的銀顆粒。低密度銀顆粒意味著這一段味著這一段DNA屬于復制起始區(qū)，高密度顆粒代表的是后來合成屬于復制起始區(qū)，高密度顆粒代表的是后來合成的。的。Cairns證明大

6、腸桿菌證明大腸桿菌DNA雙向復制的實驗雙向復制的實驗脈沖標記目的在于即時標記在特定時段內(nèi)合成的DNA。和脈沖追蹤目的則是要弄清那些被標記上的DNA片段后來的去向。Okazaki的脈沖標記和脈沖追蹤的實驗的脈沖標記和脈沖追蹤的實驗脈沖標記 在培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中加入同位素在培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中加入同位素3H標記的標記的dTTP，經(jīng)經(jīng)30秒后，秒后，DNA剛開始復制，分離剛開始復制，分離DNA，然后在，然后在堿中沉淀，變性，讓新合成的單鏈和模板鏈分開，堿中沉淀，變性，讓新合成的單鏈和模板鏈分開，再用再用CsCl密度梯度離心密度梯度離心，以沉降的快慢來確定片，以沉降的快慢來確定片段的大小，再檢測放射標記，結

7、果表明被段的大小，再檢測放射標記，結果表明被3H標記標記的片段，也就是新合成的片段，沉淀系數(shù)為的片段，也就是新合成的片段，沉淀系數(shù)為20S左左右，即都是長右，即都是長10002000Nt的的DNA片段，而親本鏈片段，而親本鏈要比它大要比它大2050倍；倍；脈沖追蹤 這個實驗是先進行標記培養(yǎng)這個實驗是先進行標記培養(yǎng)30秒，以后除秒，以后除去同位素繼續(xù)培養(yǎng)幾分鐘，再分離去同位素繼續(xù)培養(yǎng)幾分鐘，再分離DNA在在堿中沉淀，檢測結果。先合成的（帶標記）堿中沉淀，檢測結果。先合成的（帶標記）的的DNA不再是短片段，而和總不再是短片段，而和總DNA的情況相的情況相似，沉淀系數(shù)為似，沉淀系數(shù)為70S120S較

8、長的片段，這較長的片段，這意味著剛開始合成的片段都是短片段，以意味著剛開始合成的片段都是短片段，以后再連接成長片段，人們就把最初合成的后再連接成長片段，人們就把最初合成的短片段稱為岡崎片段（短片段稱為岡崎片段（Okazakifragment）Okazaki的脈沖標記和脈沖追蹤的實驗結果分析的脈沖標記和脈沖追蹤的實驗結果分析不連續(xù)復制不連續(xù)復制由于這個實驗的結果使得人們普遍認為：由于這個實驗的結果使得人們普遍認為：無論是前導鏈還是后滯鏈都是先合成小片段，無論是前導鏈還是后滯鏈都是先合成小片段，然后在連成大片段，稱為然后在連成大片段，稱為“不連續(xù)復制不連續(xù)復制“（discontinuousrepl

9、icationdiscontinuousreplication）在復制叉中不連續(xù)合成的DNA片段稱為岡崎片段，連續(xù)合成的DNA子鏈被稱為前導鏈，不連續(xù)合成的DNA子鏈被稱為后隨鏈或滯后鏈。19781978年年OliveraOlivera提出了半不連續(xù)（提出了半不連續(xù)（semidiscontinuoussemidiscontinuous）復制模型，）復制模型，也就是說前導鏈上的合成是連續(xù)的，只有后滯鏈上的合成才是半連續(xù)的。也就是說前導鏈上的合成是連續(xù)的，只有后滯鏈上的合成才是半連續(xù)的。由于細胞內(nèi)都存在有dTTP和dUTP，而DNApol卻并不能區(qū)分它們，因此也會將dUTP加入到DNA中，形成AU

10、對。那么在DNA中為什么沒有U的存在呢？這是因為E.coli細胞里有雙重“保險”，防止了U的“混入”。第一道關是細胞里的dUTPase，它能使dUTP變成dUMP，dUMP是不能作為DNA合成的底物，這樣它就不再能加入DNA中。但總還有些漏網(wǎng)之“魚”，它們還是逃過此關，混入DNA中，這就靠第二道關來清除“異己”，這道關的主角是尿嘧啶N-糖苷酶（uracilN-glycosylase），它可以切斷混合尿苷的糖苷鍵，形成無Pu和Py位點（apurinicorapyrimidinic，AP），再由AP內(nèi)切酶在AP位點切出一個缺口，進一步進行切除修復。在細胞內(nèi)尿嘧啶N-糖苷酶作用較快，而AP酶作用較慢

11、，在新鏈合成之初約1200bp就有可能摻進一個U，但很快就被尿嘧啶N-糖苷酶切斷糖苷鍵，在AP酶未作用前在脈沖標記實驗中就提取了，用NaOH沉淀時，AP位點十分易斷裂，所以前導鏈也成了小片段。復制的速度和方向復制的速度和方向DNA復制過程的三個階段 DNA復制的起始階段，包括起始點，復制方向以及引發(fā)體的形成。DNA鏈的延長，包括前導鏈及隨從鏈的形成和切除RNA引物后填補空缺及連接崗崎片段。DNA復制的終止階段。（一）DNA復制的起始階段 復制是從DNA分子上的特定部位開始的，復制起始點(originof replication)常用ori或o表示，稱為復制子或復制單元(replicon)。在原

12、核細胞中只有一個復制起始點，一個復制子。在真核生物中復制是從許多起始點同時開始的，即有多個復制子。1、DNA復制起始點的結構特性 大腸桿菌Ori由422個核苷酸組成，是一系列對稱排列的反向重復序列，即回文結構(palindrome)。有些生物復制起始點Ori是富含AT的區(qū)段。這些特殊的結構對于在DNA復制起始過程中參與的酶和許多蛋白質分子的識別和結合都是必須的。2、DNA復制的方向性 定點開始雙向復制：定點開始單向復制：兩點開始單向復制：ori3、DNA復制的起始 DNA雙螺旋的解旋由多種酶來完成的 DNA解鏈酶：水解ATP獲能解開雙鏈DNA 單鏈結合蛋白（SSB蛋白）：保持單鏈結構 RNA聚

13、合酶：合成RNA引物 對于隨從鏈是由引發(fā)體來完成的，引發(fā)體由6種蛋白組成：n、n/、n/、DnaB、C、I（二）DNA鏈的延長 DNA的復制實際上就是以DNA為模板在DNA聚合酶作用下，將四種dNTP聚合成DNA的過程。需要許多種酶和蛋白質參與。1、DNA聚合酶 1957年，Arthur kornberg首次在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶簡寫DNA pol，后來又相繼發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶和DNA聚合酶。大腸桿菌中DNA復制的主要過程靠DNA pol起作用，而DNA pol和DNA pol在DNA錯配的校正和修復中起作用。真核生物DNA聚合酶 真核生物DNA聚合酶有、及。復制中起主要作用的是DNA

14、pol。與DNA修復有關。在線粒體DNA的復制中起作用。前導鏈合成靠催化，還需要調(diào)節(jié)因子參與。隨從鏈的合成靠和引發(fā)酶配合作用完成。DNA聚合酶的性質 需要DNA模板 需要RNA做為引物 催化dNTP加到引物的3-OH末端 DNA聚合酶都屬于多功能酶，它們在DNA復制和修復過程的不同階段發(fā)揮作用。2、與超螺旋松馳有關的酶 拓撲異構酶(topoisomerase)改變DNA拓撲性質的酶，松馳超螺旋，有利于復制叉的前進合成。拓撲異構酶有型和型，原核、真核中均有。（三）DNA復制的終止階段 大腸桿菌DNA具有復制終止位點，此處可以結合一種特異的蛋白質分子叫做Tus，通過阻止解鏈酶(Helicase)的

15、解鏈活性而終止復制。某些噬菌體（如M13和X174）DNA和一些小的質粒（如枯草桿菌內(nèi)的pIM13質粒）在宿主細胞內(nèi)通過滾環(huán)復制方式擴增DNA。真核細胞的某些基因，如某些兩棲動物卵母細胞內(nèi)的rRNA基因和哺乳動物細胞內(nèi)的二氫葉酸還原酶基因，在特定的情況下會通過滾環(huán)復制在較短的時間內(nèi)迅速增加目標基因的拷貝數(shù)。滾環(huán)復制滾環(huán)復制 D-環(huán)復制環(huán)復制線粒體和葉綠體DNA通常以D-環(huán)的方式進行復制。少數(shù)病毒，如腺病毒，也進行D-環(huán)復制。催化線粒體DNA復制的酶是DNA聚合酶，兩條鏈的合成都需要先合成RNA引物，但都不形成岡崎片段，因此都是連續(xù)合成。兩條子鏈的合成在時間上的不同步。D D環(huán)復制環(huán)復制 干細胞

16、的分裂是不對稱的，而分裂的不對稱性使以后的干細胞能夠選擇性得到含有最老的DNA模板的染色體。這樣的假設是合乎邏輯的，因為如果一個干細胞在分裂中抓住最老的DNA，就等于將復制可能產(chǎn)生的錯誤“拒之門外”，從而大大降低了細胞癌變的可能性，而將來分化成體細胞的子細胞得到易錯的新DNA也沒有什么危險，因為它們很快停止分裂或者死亡，特別是在高度更新的組織?！安恍噫溂僬f不朽鏈假說”圖解圖解 原核生物原核生物DNA復制的特點復制的特點過程復雜；需要多種酶和蛋白質參與（包括拓撲異構酶、解旋酶、單鏈DNA結合蛋白、引物合成酶、DNA聚合酶及連接酶等）。原核生物DNA復制的特點1.DNA復制的起始復制的起始 復制起

17、始原點復制起始原點 DNA雙螺旋的解旋雙螺旋的解旋 復制的引發(fā)復制的引發(fā) 大腸桿菌大腸桿菌(E.coli)的的 OriC 復制原復制原點點大腸桿菌基因組的復制原點位于天冬酰胺合大腸桿菌基因組的復制原點位于天冬酰胺合酶和酶和ATP合酶操縱子之間，全長合酶操縱子之間，全長245 bp,稱為稱為oriC。參與參與DNA復制起始和引發(fā)的蛋白質復制起始和引發(fā)的蛋白質 DNA解旋酶解旋酶(DNA helicase)催化催化DNA雙鏈的解鏈過程。雙鏈的解鏈過程。單鏈單鏈DNA結合蛋白結合蛋白(single strand DNA binding protein)：以四聚體形式存在于復制叉處，只保持單鏈的存在，

18、以四聚體形式存在于復制叉處，只保持單鏈的存在，并不能起解鏈作用。并不能起解鏈作用。DNA拓撲異構酶拓撲異構酶(DNA topoisomerase)消除消除DNA雙鏈的超螺旋堆積。雙鏈的超螺旋堆積。引物酶引物酶(primase)合成一小段合成一小段RNA引物，為引物，為DNA新鏈的合成提供新鏈的合成提供3-OH末端。末端。1.1 1.1 解旋酶解旋酶（helicase)DNADNA復制時，解旋酶利用復制時，解旋酶利用ATP的能量啟動的能量啟動DNADNA解旋，使雙連分開形成單鏈。解旋，使雙連分開形成單鏈。1.DNA雙螺旋的解旋雙螺旋的解旋在在EcoliEcoli中，解旋酶中，解旋酶DnaBDna

19、B作為引發(fā)體的成員，參與復制叉作為引發(fā)體的成員，參與復制叉形成，并結合于一個復制叉，利用形成，并結合于一個復制叉，利用ATP水解的能量解水解的能量解開雙螺旋，開雙螺旋，推動復制叉向前延伸推動復制叉向前延伸;大部分大部分DNADNA解鏈酶可沿后隨鏈的解鏈酶可沿后隨鏈的5 5-3-3方向隨著復制叉的前方向隨著復制叉的前進而移動，進而移動，RepRep蛋白則沿前導鏈模板的蛋白則沿前導鏈模板的3 3-5-5方向移動。方向移動。生物體內(nèi)的解旋酶有多種，有些解旋酶還參與生物體內(nèi)的解旋酶有多種，有些解旋酶還參與DNA修復，修復，重組等非復制過程。重組等非復制過程。1.2 1.2 拓撲異構酶（拓撲異構酶（to

20、poisomerasetopoisomerase)可以使可以使DNADNA的兩種拓撲異構體互變的酶。的兩種拓撲異構體互變的酶。DNADNA分子在細胞內(nèi)以超螺旋形式存在，分子在細胞內(nèi)以超螺旋形式存在，DNADNA拓拓撲異構酶催化同一撲異構酶催化同一DNADNA分子不同超螺旋狀態(tài)之分子不同超螺旋狀態(tài)之間轉變。間轉變。Action of topoisomerase at the replication forkTopoisomerase rapidly remove the positive supercoils accumulate in front of the replication fork

21、.功能：功能：與與DNA形成共價結合中間體，使形成共價結合中間體，使DNA磷磷酸二酯鍵斷裂，酸二酯鍵斷裂，形成形成DNA nick，DNA的一的一條鏈進行解旋旋轉而改變條鏈進行解旋旋轉而改變DNA分子的拓撲分子的拓撲狀態(tài)。狀態(tài)。v 參與復制、轉錄、重組。參與復制、轉錄、重組。效應：效應：拓撲異構酶可使拓撲異構酶可使DNA發(fā)生：發(fā)生：連環(huán)化（連環(huán)化（catenate)脫連環(huán)化脫連環(huán)化(decatenate)打結（打結（knot)解結（解結（unknot)拓撲異構酶類別拓撲異構酶拓撲異構酶I DNA拓撲異構酶拓撲異構酶I對單鏈對單鏈DNA的親和力要比雙鏈高得多，這正是它識別的親和力要比雙鏈高得多，

22、這正是它識別負超螺旋負超螺旋DNA的分子基礎，因為負超螺旋的分子基礎，因為負超螺旋DNA常常會有一定程度的單鏈區(qū)。負超螺常常會有一定程度的單鏈區(qū)。負超螺旋越高，旋越高，DNA拓撲異構酶拓撲異構酶I作用越快作用越快 生物體內(nèi)負超螺旋穩(wěn)定在生物體內(nèi)負超螺旋穩(wěn)定在5%左右，低了不行，高了也不行。生物體通過拓撲異構酶左右，低了不行，高了也不行。生物體通過拓撲異構酶1和和II的相反作用而使負超螺旋達到一個穩(wěn)定狀態(tài)。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，編碼的相反作用而使負超螺旋達到一個穩(wěn)定狀態(tài)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，編碼Ecoli拓撲異構拓撲異構酶酶I的基因的基因topA發(fā)生突變，則會引起旋轉酶基因的代償性突變；否則，負超螺旋增高，發(fā)生突變，

23、則會引起旋轉酶基因的代償性突變；否則，負超螺旋增高，細胞生活能力降低。細胞生活能力降低。拓撲異構酶拓撲異構酶II II類拓撲異構酶沒有堿基序列特異性，它們可以和任何相交的兩對雙鏈類拓撲異構酶沒有堿基序列特異性，它們可以和任何相交的兩對雙鏈DNA結合。結合。通過切斷通過切斷DNA的一條或兩條鏈中的磷酸二酯鍵，的一條或兩條鏈中的磷酸二酯鍵，然后重新纏繞和封口來更正然后重新纏繞和封口來更正DNA連環(huán)數(shù)的酶。連環(huán)數(shù)的酶。解旋酶沿著復制叉向前延伸產(chǎn)生了一段解旋酶沿著復制叉向前延伸產(chǎn)生了一段單鏈，細胞內(nèi)大量單鏈，細胞內(nèi)大量的單鏈結合蛋白能和單的單鏈結合蛋白能和單鏈鏈DNA結合，防止其重新配對形成雙鏈。結合

24、，防止其重新配對形成雙鏈。1.3 1.3 單鏈結合蛋白單鏈結合蛋白（SSB）SSB SSB的作用：的作用：v 使使DNADNA單鏈保持一種伸展構象，它們與磷酸骨單鏈保持一種伸展構象，它們與磷酸骨架結合，離開暴露的堿基，此次那些堿基能作架結合，離開暴露的堿基，此次那些堿基能作為為DNADNA合成的模板；合成的模板；v 使解開的單鏈不形成發(fā)卡結構；使解開的單鏈不形成發(fā)卡結構；v 保護保護DNADNA單鏈不受單鏈不受DnaseDnase水解。水解。2 DNA復制的引發(fā)復制的引發(fā)oriC(84min)（dnaA結合位點）此序列在所有細菌復制起始位點中此序列在所有細菌復制起始位點中都是保守的。都是保守的

25、。oriC在不同原核生物中有同源性，很多細菌的在不同原核生物中有同源性，很多細菌的oriC區(qū)區(qū)在結構上相似的，在序列上有相當?shù)谋Ｊ匦裕诮Y構上相似的，在序列上有相當?shù)谋Ｊ匦裕以诜诸惿显浇咏募毦渫葱栽礁?，表明且在分類上越接近的細菌其同源性越高，表明DNA復制起點的重要性。復制起點的重要性。將將DNA分子的復制起始位點（復制器）分子的復制起始位點（復制器）連接到任何一個連接到任何一個DNA分子上，都能分子上，都能起始其復制。起始其復制。v起始蛋白與特異序列結合、起始蛋白與特異序列結合、促進解旋和引發(fā)體組裝促進解旋和引發(fā)體組裝引發(fā)體是由很多蛋白質因子參與形成的。引發(fā)體是由很多蛋白質因子參

26、與形成的。引發(fā)體primosome引發(fā)前體preprimosome引發(fā)酶Primase(DnaG)DnaB helicaseDnaC helicase assistantDnaInnn只有當引發(fā)前體把這只有當引發(fā)前體把這6種蛋白質合在一起種蛋白質合在一起并與引發(fā)酶進一步組并與引發(fā)酶進一步組裝后形成引發(fā)體，才裝后形成引發(fā)體，才能發(fā)揮其功效。能發(fā)揮其功效。4.3.4 4.3.4 引發(fā)酶（引發(fā)酶（Primase，或引物酶，或引物酶)DNA DNA 合成時需要一段大約合成時需要一段大約6-106-10個核苷酸長的個核苷酸長的RNARNA，作為，作為DNA DNA 合成的引物；這段引物是由引物酶合成的。

27、合成的引物；這段引物是由引物酶合成的。是在特定環(huán)境下發(fā)揮作用的是在特定環(huán)境下發(fā)揮作用的RNARNA聚合酶，僅用于合成聚合酶，僅用于合成DNADNA復制所需的一小段復制所需的一小段RNARNA。引物酶以單鏈引物酶以單鏈DNADNA為模板，利用核糖核苷酸直接從頭合成為模板，利用核糖核苷酸直接從頭合成RNARNA引物（引物（6-10nt)6-10nt)。減少致死突變。減少致死突變。DNADNA合成中最初幾個核苷酸正確性遠合成中最初幾個核苷酸正確性遠比其后的低。引物比其后的低。引物RNA RNA 隨后被降解，從隨后被降解，從而減少了復制錯誤。而減少了復制錯誤。引物的意義：引物酶催化引物引物酶催化引物R

28、NARNA的合成，但它不同于的合成，但它不同于RNARNA聚合酶聚合酶。引物酶只在復制起點處合成引物酶只在復制起點處合成RNARNA引物以引發(fā)引物以引發(fā)DNADNA復制，復制，而而RNARNA聚合酶則是啟動聚合酶則是啟動DNADNA轉錄合成轉錄合成RNA RNA，從而將，從而將遺傳信息由遺傳信息由DNADNA傳遞到傳遞到RNARNA。E.coliE.coli的引物酶由一條肽鏈組成，分子量為的引物酶由一條肽鏈組成，分子量為60KD,DnaG60KD,DnaG基因編碼。基因編碼。DnaA protein molecules binds to the four 9 bp repeats in the

29、 origin，then recognizes and successively denatures the DNA in the region of the three 13 bp repeats,which are rich in A=T pairsThis process requires ATP and the bacterial histonelike protein HU.HU prevents nonspecific initiation at sites other than oriCThe DnaA protein then mediates the separation o

30、f the strands of the DNA duplex by acting on three AT-rich tandem repeats located at the 5-end of the sequence defining oriCFormation of this 45-bp“open complex”by DnaA protein is ATP-dependent.DnaB protein(a hexamer of 50-kD subunits)binds to the“open”oriC.DnaB protein is delivered to oriC by DnaC

31、protein assisted by DnaT protein.The addition of DnaB protein completes assembly of the pre-priming complex（引發(fā)前體）（引發(fā)前體）.ATP hydrolysis drives the formation of this complex.DnaB protein has helicase activity and it further unwinds the DNA in the pre-priming complex in both directionsSSB tetramers coa

32、t singlestranded regions as they arise.引物酶（引物酶（）結合到引發(fā)前體上結合到引發(fā)前體上組裝成了引發(fā)體組裝成了引發(fā)體（primosomeprimosome ）。）。在在SSBSSB和拓撲異構和拓撲異構酶的參與下，引發(fā)酶的參與下，引發(fā)體可在單鏈體可在單鏈上移動，在上移動，在的幫助下，識別的幫助下，識別復制的起始起點位復制的起始起點位置。置。引發(fā)體在復制叉先合成先引發(fā)體在復制叉先合成先導鏈的導鏈的RNARNA引物，再合成后引物，再合成后滯鏈的引物（滯鏈的引物（Primase association with DnaB is transient;once a

33、primer has been synthesized,primase dissociates until another round of primer synthesis is necessary.)在復制叉在復制叉DNA polymerase DNA polymerase III III 組裝成組裝成非對稱的二聚體非對稱的二聚體，它催化第一個按堿它催化第一個按堿基互補配對原則加在基互補配對原則加在引物的引物的端，而進端，而進入鏈的延伸階段入鏈的延伸階段.DNA鏈的延伸需要的蛋白質鏈的延伸需要的蛋白質:DNA聚合酶聚合酶 滑動夾（滑動夾（Sliding DNA clamp）RNA酶酶(RN

34、ase H 等等)在復制完成后切除在復制完成后切除RNA引物。引物。DNA連接酶連接酶(DNA ligase)通過生成通過生成35-磷酸二酯鍵連接兩條磷酸二酯鍵連接兩條DNA鏈。鏈。2.DNA鏈的延伸鏈的延伸DNA polymerase use a single active site to catalyze DNA synthesisDNA polymerase bound to a primer:template junctionpalmProcessivity(持續(xù)合成能力持續(xù)合成能力)Processivity is a characteristic of enzymes that op

35、erate on polymeric substrates.For DNA polymerase,the degree of processivity is defined as the average number of nucleotides added each time the enzyme binds a primer:template junction (a few50,000).Structure of a sliding DNA clampSliding DNA clamps encircle the newly replicated DNA produced by an as

36、sociated DNA polymerase.Sliding clamps dramatically increase DNA polymerase processivity(持續(xù)合成能力持續(xù)合成能力)The composition of the DNA Pol III holoenzyme Three enzymes:Two copies of the DNA Pol III core enzyme One copy of the-complexThe“trombone”model for coordinating replication by two DNA polymerase at

37、the E.coli replication fork岡崎片段與半不連續(xù)復制岡崎片段與半不連續(xù)復制岡崎片段(Okazaki fragment)一般長約1000-2000個堿基，原核比真核長。前導鏈Leading strand后隨鏈Lagging strand然后，RNaseH降解RNA引物，DNA聚合酶I補齊缺口，再由DNA連接酶連接兩個岡崎片段。Steps in the synthesis of the lagging strandRemoval of RNA primers from newly synthesized DNARNAse H removes all of the RNA p

38、rimer except the ribonucleotide directly linked to the DNA end.An exonuclease removes the final ribonucleotide.DNA polymerase fills the gap,leaving a a break in the backbone between the 3OH and 5 phosphate of the repaired strand.DNA ligase repaires this“nick”.當復制叉前移，遇到當復制叉前移，遇到20bp重復性終止子序列重復性終止子序列(T

39、er)時，時，Ter-Tus復合物能阻擋復制叉的繼續(xù)復合物能阻擋復制叉的繼續(xù)前移，等到相反方向的復制叉到達后在前移，等到相反方向的復制叉到達后在DNA拓拓撲異構酶撲異構酶IV的作用下使復制叉解體，釋放子鏈的作用下使復制叉解體，釋放子鏈DNA。ter3.復制的終止復制的終止復制的終止位點復制的終止位點在在E.coli DNA上存在著復制的終止位點上存在著復制的終止位點;終止位點的序列終止位點的序列Ter():A A T T A G T A T G T T G T A A C T A A A G TT T A A T C A T A C A A C A T T G A T T T C A 終止序列

40、可被終止序列可被tus蛋白（蛋白（tus基因編碼）識別，基因編碼）識別，并結合于其上；并結合于其上；Ter-Tus復合物能使復合物能使DnaB不再將不再將DNA解鏈，使解鏈，使復制叉停止前移；復制叉停止前移；E.coli兩個復制叉在相距兩個復制叉在相距100kb時，復制速度時，復制速度減慢從而協(xié)調(diào)兩個復制叉到達時間。減慢從而協(xié)調(diào)兩個復制叉到達時間。Tus protein只讓一側復制叉通過，使只讓一側復制叉通過，使DNA的的復制在終點位置終止。復制在終點位置終止。復制終止的協(xié)調(diào)：復制終止的協(xié)調(diào)：在在Forks meet 兩側各兩側各有幾個段序列有幾個段序列如：如：terE.D.A.terC.B。

41、當一側復制叉前進的當一側復制叉前進的快，而另一側前進的快，而另一側前進的慢時，快側復制酶則慢時，快側復制酶則會在會在ter位點停止，等位點停止，等待直到慢側跟上。待直到慢側跟上。以上似乎構成一個以上似乎構成一個“replication fork trap”E.coli DNA復制到最復制到最后，子代后，子代DNA鏈套在一起鏈套在一起,由由DNA拓撲異構酶拓撲異構酶II切開切開雙鏈將兩個雙鏈將兩個DNA分子分開分子分開成為兩個完整地與親代成為兩個完整地與親代DNA分子完全一樣的子代分子完全一樣的子代DNA分子。分子。DNA聚合酶聚合酶I(coded by polA)不是復制大腸桿菌染色體不是復制

42、大腸桿菌染色體的主要聚合酶，它有的主要聚合酶，它有 3 5核酸外切酶活性核酸外切酶活性,與與DNA聚合聚合酶的校正功能有關，酶的校正功能有關，保證了保證了DNA復制的準確性復制的準確性。DNA Polymerase I它的它的5 3核酸外切酶活性也可用來除去岡崎片段核酸外切酶活性也可用來除去岡崎片段5端端RNA引物，使岡崎片段間缺口消失，引物，使岡崎片段間缺口消失，保證連接酶將片段保證連接酶將片段連接起來連接起來。DNA聚合酶聚合酶II(coded by polB)的活性很的活性很低，只有低，只有DNA聚合酶聚合酶I的的5%，所以也不，所以也不是復制中主要的酶。是復制中主要的酶。生理功能主要是

43、生理功能主要是起修復起修復DNA的作用的作用。DNA Polymerase II DNA聚合酶聚合酶III(coded by polC)包含有包含有7種種不同的亞單位和不同的亞單位和9個個亞基，其生物活性形亞基，其生物活性形式為式為二聚體二聚體。Core enzyme&Core enzyme&holoenzymeholoenzymeDNA Polymerase III 它的它的聚合活性較強聚合活性較強，為，為DNA聚合酶聚合酶I的的15倍，聚合酶倍，聚合酶II的的300倍。倍。它能在引物的它能在引物的3OH上以每分鐘約上以每分鐘約5萬個萬個核苷酸的速率延長新生的核苷酸的速率延長新生的DNA鏈，

44、是大腸桿鏈，是大腸桿菌菌DNA復制中鏈延長反應的復制中鏈延長反應的主導聚合酶主導聚合酶。全酶DNA Polymerase IIIThe holoenzyme consists of:The core enzyme ,The sliding clamp-The clamp loader complex A processivity switch-DNA聚合酶聚合酶I(DNA損傷的修復）損傷的修復）DNA聚合酶聚合酶I、II、III(a proofreading activity)DNA聚合酶聚合酶III DNA聚合酶聚合酶IV和和V分別由分別由dinB和和umuD2C基因編碼，基因編碼，主要在主

45、要在SOS修復過程修復過程中發(fā)揮功能。中發(fā)揮功能。DNA Polymerase IV&V1 1、都以、都以dNTP為底物為底物。2、都需要、都需要Mg2+激活激活。3、聚合時必須有、聚合時必須有模板鏈模板鏈和具有和具有 3-OH末端的末端的引物鏈引物鏈。4、鏈的延伸都方向為、鏈的延伸都方向為53。DNA聚合酶的共同點：聚合酶的共同點：6 DNA6 DNA連接酶（連接酶（ligaseligase)催化雙鏈DNA切口處的5-磷酸和3-羥基生成磷酸二酯鍵;連接反應需要供給能量。大腸桿菌和其它細菌的DNA連接酶以NAD作為能量來源;動物細胞和噬菌體的連接酶則以ATP作為能量來源。DNA 滯滯后鏈上的復

46、制是不連續(xù)的，各合成的后鏈上的復制是不連續(xù)的，各合成的片段需要連接酶連接，連接酶的反應條件：片段需要連接酶連接，連接酶的反應條件：v 被連接的兩鏈必須與另一鏈（模板鏈）被連接的兩鏈必須與另一鏈（模板鏈）互補；互補；v 兩鏈相鄰；兩鏈相鄰；v 每次只能連接一個缺口；每次只能連接一個缺口；v 使一條鏈的使一條鏈的5-P 與另一鏈的與另一鏈的3-OH形形成磷酸二酯鍵；成磷酸二酯鍵；v 缺口缺失核苷酸不連接。缺口缺失核苷酸不連接。T4 T4 LigaseLigase 特性：特性：v可連接可連接DNA與與DNA，也可連接，也可連接RNA與與RNA。v可連接可連接DNA中的單鏈切口，也可連接粘性末端切中的

47、單鏈切口，也可連接粘性末端切口和齊末端切口。口和齊末端切口。v T4 Ligase 可作為重組工具酶?？勺鳛橹亟M工具酶。T4連接酶T4連接酶真核生物真核生物DNA的復制的復制真核生物真核生物DNA的復制特點的復制特點 有有多處復制起始點多處復制起始點；在全部完成復制之前，各個起始點上在全部完成復制之前，各個起始點上DNA的復制不能再開始；的復制不能再開始；原核生物起始點上可連續(xù)開始新的DNA復制。DNA復制復制只在只在S期進行期進行。復制子相對較小復制子相對較小，為，為40-100kb。E.coli?真核生物的復制起始位點被稱為自主復制序列真核生物的復制起始位點被稱為自主復制序列(autono

48、mous replicating sequence,ARS)這個序列是這個序列是染色體正常起始復制染色體正常起始復制所必需的。所必需的。所有的所有的ARS的的DNA均有一段保守序列：均有一段保守序列：（A區(qū)）區(qū)）-A(T)TTTAT(C)A(G)TTTA(T)-起始點識別復合物起始點識別復合物(origin recognition complex,ORC)DNA的復制起始需要的復制起始需要ORC的參與的參與ORC結合于結合于ARS，形成復制叉。，形成復制叉。ORC它是由它是由6種蛋白質組成的啟動。種蛋白質組成的啟動。酵母的復制起始位點：酵母的復制起始位點：長約長約150bp左右，左右，包括數(shù)個

49、復制起始必需的保守區(qū)。包括數(shù)個復制起始必需的保守區(qū)。酵母染色體酵母染色體的著絲粒附近為的著絲粒附近為ARS1序列序列起始點識別復合物起始點識別復合物ARS1分為A,B,C三個功能區(qū),A,B起主要作用,C起次要作用。A區(qū)為15bp,其中11個保守，稱ACS(ARS consensus sequence)。有復制起始子的功能B區(qū)約為80bp,含B1,B2,B3三個功能區(qū)。B3是ABF1（ARS-binding factor 1）結合區(qū)，ARS1序列特征序列特征 真核生物真核生物DNA復制叉的移動速度大復制叉的移動速度大約只有約只有50bp/秒。秒。因此，人類因此，人類DNA中每隔中每隔30,000

50、-300,000bp就有一個復制起始位點。就有一個復制起始位點。已發(fā)現(xiàn)的真核生物已發(fā)現(xiàn)的真核生物DNA聚合酶有聚合酶有15種以上。種以上。在哺乳動物細胞中主要有在哺乳動物細胞中主要有5種種DNA聚合酶聚合酶，分別稱為，分別稱為DNA聚合聚合酶酶、和和。真核生物真核生物DNA聚合酶的特性比較聚合酶的特性比較性質性質DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶亞基數(shù)亞基數(shù)4122-31在細胞內(nèi)在細胞內(nèi)分布分布核內(nèi)核內(nèi)核內(nèi)核內(nèi)線粒體線粒體核內(nèi)核內(nèi)核內(nèi)核內(nèi)(?)功能功能DNA引物合引物合成成損傷修損傷修復復線粒體線粒體DNA復制復制主要主要DNA復復制酶制

51、酶DNA復復制制(?)35外外切切無無無無有有有有有有53外外切切無無無無無無無無無無 DNA聚合酶聚合酶主要參與主要參與引物合成引物合成。DNA聚合酶聚合酶活性水平穩(wěn)定，主要在活性水平穩(wěn)定，主要在DNA損損傷的修復傷的修復中起作用。高忠實性修復酶中起作用。高忠實性修復酶DNA聚合酶聚合酶主要負責主要負責DNA的復制。的復制。DNA聚合酶聚合酶與與后隨鏈后隨鏈合成有關，在合成有關，在DNA合合成過程中核苷切除以及堿基的切除修復中成過程中核苷切除以及堿基的切除修復中起著重要的作用。起著重要的作用。DNA聚合酶聚合酶 在線粒體在線粒體DNA的復制中發(fā)揮的復制中發(fā)揮作用。作用。真核生物中還存在真核生

52、物中還存在、和和 等等幾種幾種DNA聚合酶，它們承擔著聚合酶，它們承擔著修修復損傷復損傷的功能，但這些修復酶的的功能，但這些修復酶的忠實性都很低。忠實性都很低。真核生物DNA聚合酶特征dNTP Mg2+3-OH5-3真核生物真核生物DNA聚合酶一般聚合酶一般不具有外切酶活性不具有外切酶活性。Key Concepts A replication fork has 1 complex of DNA polymerase/primase and 2 complexes of DNA polymerase and /or.The DNA polymerase /primase complex init

53、iates the synthesis of both DNA strands.DNA polymerase elongates the leading strand and a second DNA polymerase or DNA polymerase elongates the lagging strand.去除岡崎片段：分兩步去除岡崎片段：分兩步RNA酶酶H1切斷切斷DNA-RNA，F(xiàn)EN1蛋白降解蛋白降解RNA片段。片段。真核生物的聚合酶沒有5-3外切酶活性，需要一種叫FEN1的蛋白切除5端引物 DNA連接酶連接酶I將相鄰的岡崎片段連接起來將相鄰的岡崎片段連接起來DNA末端復制端粒

54、端粒(telomere)真核生物染色體線性真核生物染色體線性DNA分子末分子末 端的結構。端的結構。結構特點：結構特點：1.由末端單鏈由末端單鏈DNA序列和蛋白質構成序列和蛋白質構成2.末端末端DNA序列是多次重復的富含序列是多次重復的富含G、C 堿基的短序列堿基的短序列 功能：功能：1.維持染色體的穩(wěn)定性維持染色體的穩(wěn)定性 2.維持維持DNA復制的完整性復制的完整性端粒酶端粒酶(telomerase)特點：特點：1.由由RNA和蛋白質構成的復合物和蛋白質構成的復合物2.為特殊的逆轉錄酶，能以自身的為特殊的逆轉錄酶，能以自身的RNA為為模板逆轉錄合成端粒模板逆轉錄合成端粒DNA 功能：功能：合

55、成端粒合成端粒DNA，維持端粒的長度，維持端粒的長度 爬行模型：爬行模型：5 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG 3 AACCCC GGGGTTGGGG圖 11-68 端粒3延伸，末端回折形成發(fā)夾結構離開離開RNA模板的端粒模板的端粒DNA3端可反折為雙鏈，并常出現(xiàn)兩個端可反折為雙鏈，并常出現(xiàn)兩個G之間的配對，以有利于之間的配對，以有利于DNA-RNA雜交鏈之間的相對滑動。雜交鏈之間的相對滑動。端粒及端粒酶的意義：端粒及端粒酶的意義：端粒特別是端粒酶的活性與細胞的生長、繁殖、衰老凋亡以及腫瘤的發(fā)生密切相關。端粒的平均長度隨細胞分裂次數(shù)的增多及年齡的增長而逐漸變短至消失，可導致染色

56、體穩(wěn)定性下降，導致細胞衰老凋亡。體細胞幾乎沒有端粒酶活性，隨多次細胞分裂端粒逐漸縮短，細胞失去增殖能力。而端粒酶活性較高的胚原細胞，端粒長度未縮短。腫瘤細胞端粒酶重新獲得活性，以維持端粒結構致使染色體穩(wěn)定而成為永生細胞。腫瘤細胞的端粒比正常人同類細胞顯著縮短。DNA復制的調(diào)控 大腸桿菌染色體大腸桿菌染色體DNA的復制調(diào)控的復制調(diào)控 ColEI 質粒質粒DNA的復制調(diào)控的復制調(diào)控 真核細胞中真核細胞中DNA的復制調(diào)控的復制調(diào)控復制的調(diào)控復制的調(diào)控許多現(xiàn)象表明，許多現(xiàn)象表明，DNA的復制是受到調(diào)控的。的復制是受到調(diào)控的。比如原核細胞在不同的生長條件下細胞的分裂比如原核細胞在不同的生長條件下細胞的分

57、裂速度是不同的，速度是不同的，舉個例子：舉個例子：大腸桿菌細胞在大腸桿菌細胞在37碳源充足的時候，分裂一碳源充足的時候，分裂一次需要次需要46分鐘；而在碳源不充足的時候，分裂分鐘；而在碳源不充足的時候，分裂一次需要一次需要10個小時，但是在兩種情況下，個小時，但是在兩種情況下，DNA復制的速度都是復制的速度都是40分鐘左右分鐘左右大腸桿菌的復制調(diào)控大腸桿菌的復制調(diào)控 調(diào)節(jié)蛋白通過與復制復合物的相互作用確調(diào)節(jié)蛋白通過與復制復合物的相互作用確定復制起始的頻率定復制起始的頻率和復制方式。和復制方式。復制子由起始物位點和復制起點兩部分。復制子由起始物位點和復制起點兩部分。大腸桿菌染色體DNA的復制調(diào)控

58、復制起始不依賴于細胞分裂，復制終止則能引發(fā)細 胞分裂。復制調(diào)控主要發(fā)生在起始階段。dnaA-ADP復合物；DNA復制的調(diào)控機制之一 細菌細菌(E.coli)DNA每個細胞周期復制每個細胞周期復制一次可能受一次可能受OriC甲基化的控制甲基化的控制甲基化-活化半甲基化-失活 對dam-E.Coli 的研究表明，半甲基化的OriC不能發(fā)動一輪新的復制 在復制過程中，OriC的半甲基化狀態(tài)約保留13 min。而在基因組其它區(qū)域的GATC位點，在復制后1.5 min內(nèi)即被甲基化。6646bp的小質粒宿主細胞的拷貝數(shù)為20-30個拷貝ColEI 質粒 ColE1 DNA復制不依賴于本身編碼的蛋白質，而是

59、完全依靠宿主DNA聚合酶。質粒DNA編碼兩個負調(diào)控因子Rop蛋白和反義RNA（RNA1),它們控制了起始DNA復制必須的引物合成。ColEI 質粒DNA的復制調(diào)控ColE1質粒DNA的復制調(diào)控前導鏈的合成oriV引物RNA前體的轉錄起始于復制起點上游555個核苷酸處，需經(jīng)RNaseH加工后產(chǎn)生有555個核苷酸的引物，然后由DNA聚合酶I在引物的3末端起始DNA合成。RNA1的編碼區(qū)在引物RNA編碼區(qū)的5末端，轉錄方向與引物RNA相反，因此與引物RNA的5末端互補。RNA1通過氫鍵配對與引物RNA前體相互作用，阻止了RNaseH加工引物前體，使其不能轉化為有活性的引物而對復制起負調(diào)控作用。當不存

60、在RNA1時，RNA引物前體形成自身的發(fā)夾結構，起類似終止子的作用 當前體RNA與RNA1互補配對時，類終止子效應消失，引物前體的轉錄被繼續(xù)，阻止了RNase H加工引物前體 Rop蛋白能夠提高前體RNA與RNA1的相互作用，加強負調(diào)控作用質粒質粒Col 1的復制調(diào)控的復制調(diào)控負調(diào)控因子負調(diào)控因子Rop蛋白和反義蛋白和反義RNA共同控制了共同控制了復制起始所必須的復制起始所必須的RNA引物的合成，從而來引物的合成，從而來控制控制DNA復制的起始復制的起始 真核細胞的復制調(diào)控（1）細胞生活周期水平調(diào)控）細胞生活周期水平調(diào)控（2）染色體水平調(diào)控）染色體水平調(diào)控（3）復制子水平調(diào)控）復制子水平調(diào)控

61、真核細胞中真核細胞中DNA復制復制3個水平的調(diào)控個水平的調(diào)控（1）細胞生活周期水平的調(diào)控也稱限制點調(diào)控即決定細胞停留在G1期還是S期，許多外部因素和細胞因子參與限制點的調(diào)控。促細胞分裂劑、致癌劑、外科手術切除四磷酸二腺苷、聚ADP-核糖染色體水平調(diào)控決定不同染色體或同一染色體不同部位的復制子按一定的順序在S期起始復制與染色體是否處于活化狀態(tài)有關與染色體是否處于活化狀態(tài)有關（3）復制子水平調(diào)控決定復制的起始與否，高度保守復制子參與的多種因子均可參與調(diào)節(jié)，主要是復制起始調(diào)控，如酵母復制起始受時序調(diào)控。復制起始的許可因子復制起始的許可因子（licensing factor）調(diào)控調(diào)控 激活狀態(tài)的，為下

62、一次復制提供起始信號激活狀態(tài)的，為下一次復制提供起始信號復制完成后，核內(nèi)的復制完成后，核內(nèi)的licensing factor失活失活細胞質中合成新的細胞質中合成新的licensing factor核膜的裂解，核膜的裂解，licensing factor才有機會才有機會與核物質一起進入與核物質一起進入進入細胞核，進入細胞核，licensing factor就會活化就會活化不同點不同點原核生物原核生物真核生物真核生物起始位點起始位點一個一個多個多個(多至千個多至千個)前導鏈合成前導鏈合成DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶隨后鏈合成隨后鏈合成DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶或或引物長短引物長短50100個核苷酸個核苷酸10個核苷酸個核苷酸岡崎片段長短岡崎片段長短10002000個核苷酸個核苷酸100200個核苷酸個核苷酸RNA引物水解引物水解DNA聚合酶聚合酶核酸酶核酸酶H修補缺口修補缺口DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶復制速度復制速度快快慢慢原核生物與真核生物DNA復制的不同點