《細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法》PPT課件

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1、實驗注意事項及影響試驗結(jié)果的因素分析 一、實驗注意事項 二、影響試驗結(jié)果的因素分析 三、企業(yè)產(chǎn)品優(yōu)勢,一、試驗操作注意事項 2005年版中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程P297細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法 實驗前，須用肥皂洗手，用75酒精棉球消毒。 在使用洗耳球、移液管取樣時，應(yīng)注意不要將洗耳球中的氣體吹入溶液中，以防止氣體中的內(nèi)毒素進(jìn)入供試液。 復(fù)溶0.5ml鱟試劑時，在旋渦混合器上點擊1-3秒，促進(jìn)鱟試劑的溶解。,由于凝集反應(yīng)是不可逆的，所以在反應(yīng)過程中及觀察結(jié)果時應(yīng)注意不要使試管受到振動，以免使凝膠破碎產(chǎn)生假陰性結(jié)果。 進(jìn)行干擾實驗時，標(biāo)準(zhǔn)對照系列和含內(nèi)毒素的供試品溶液系列應(yīng)同時進(jìn)行，并使用同一支細(xì)菌內(nèi)毒素

2、標(biāo)準(zhǔn)品。,在進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾實驗和供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查時，各個實驗中要求的對照應(yīng)同時進(jìn)行，并在實驗有效的情況才能進(jìn)行計算和判斷。 在進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾實驗和供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查時，各個實驗中要求的對照應(yīng)同時進(jìn)行，并在實驗有效的情況才能進(jìn)行計算和判斷。,二、試驗誤差分析及改進(jìn)措施 鱟試劑質(zhì)量及靈敏度標(biāo)示值得的影響 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品效價及使用的影響 實驗器皿的的影響 樣品成份及理化性質(zhì)的影響 實驗員的影響 環(huán)境的影響,1、鱟試劑質(zhì)量及靈敏度標(biāo)示值得的影響 鱟試劑的質(zhì)量：抗干擾能力，穩(wěn)定性； 鱟試劑靈敏度標(biāo)示值的準(zhǔn)確性 。,1）、鱟試劑靈敏度的誤差 是否用細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)

3、定？ 標(biāo)示值是否準(zhǔn)確？ 不同廠家的鱟試劑雖然標(biāo)示值（）相同，但仍然存在較大的誤差。比如，標(biāo)示值為0.5EU/ml的鱟試劑，有的真實靈敏度可能是0.65EU/ml；而另一個廠家的鱟試劑可能是0.30EU/ml時，按0.5-2誤差標(biāo)準(zhǔn)都是合格產(chǎn)品，但對同一檢品在相同的稀釋倍數(shù)下，這兩個廠家的鱟試劑產(chǎn)品對內(nèi)毒素的檢出水平卻不同。,我本公司對鱟試劑質(zhì)量得控制： 原料；工藝用水；生產(chǎn)環(huán)節(jié)；靈敏度標(biāo)定。,鱟試劑的活性只能控制在某一個范圍內(nèi)，不可能控制在一個點，我們要求允許波動的范圍盡可能的小減少批間誤差。,2、細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品引起的誤差 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品種類 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品效價誤差 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品操作

4、誤差 細(xì)菌內(nèi)毒素單位表示誤差 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的錯誤使用,1）、細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品種類 細(xì)菌內(nèi)毒素國際標(biāo)準(zhǔn)品 細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品 細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品系自大腸埃希菌提取精制而成，用于標(biāo)定、復(fù)核、仲裁鱟試劑靈敏度和標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價。 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品系以細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定其效價，用于試驗中鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗及各種陽性對照。 2005年版中國藥典,2）、細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品效價誤差 細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品與細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品之間或細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品與細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品之間的生物效價存在一定的誤差，用不同細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)核同一批鱟試劑靈

5、敏度時可能存在一定的誤差。中國藥典要求“當(dāng)c在0.5-2(包括0.5和2)時，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度為該批鱟試劑的靈敏度?！痹囼灲Y(jié)果只要在這合格范圍內(nèi)表示鱟試劑標(biāo)示靈敏度準(zhǔn)確。,3）、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品操作誤差,取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)一支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，用75%酒精棉球擦拭后啟開，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。,,,正確,（易折點）錯誤,注意：只能在安瓿的易折點上部開啟內(nèi)毒素，不能沿易折點開啟，防止振蕩過程中內(nèi)毒素粘在封口膜上。 只能取1ml的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品。 若使用的為細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品，可按其使用說明書中的方法將其稀釋

6、至規(guī)定濃度后分裝保存。若為細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，為一次性使用。,4）、錯誤使用 有部分客戶使用廠家生產(chǎn)的細(xì)菌內(nèi)毒素來復(fù)核鱟試劑的靈敏度，這是一種錯誤行為，更有甚者使用廠家生產(chǎn)的細(xì)菌內(nèi)毒素來交叉復(fù)核鱟試劑的靈敏度，這是一種嚴(yán)重錯誤行為。,3、實驗器皿的影響 器皿的計量管理（校正） 器皿的選擇標(biāo)準(zhǔn) 器皿的正確處理,1）、器皿的選擇標(biāo)準(zhǔn) 鱟試驗對器皿的要求：刻度準(zhǔn)確；內(nèi)表面光滑；易于清理。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查實驗不宜選用注射器，最好使用經(jīng)過校正的刻度玻璃吸管或吸嘴。注射器刻度不精確，內(nèi)壁磨沙面吸附內(nèi)毒素，而且要特別注意注射器針頭引入的鐵離子對試驗結(jié)果的干擾，故不宜選用注射器。,如果用量不大，使用頻率不高，

7、建議大家選用本公司提供的一次性耗材。無熱原耗材是一種在此行業(yè)中被鑒定為無內(nèi)毒素和-葡聚糖污染的產(chǎn)品，其中包括, 無熱原試管、無熱原移液器吸頭。這些產(chǎn)品可以給您的工作帶來很大方便,另外，當(dāng)實驗出現(xiàn)誤差時可首先排除器皿方面的因素,很快分析判斷出誤差原因。,2）、器皿的正確處理 2005年版中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范278頁細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法“實驗準(zhǔn)備”規(guī)定：“將被洗滌的玻璃器皿用洗滌劑和自來水洗凈并烘干水分后，置洗液中浸泡4小時，取出將洗液瀝干，用自來水將殘余的洗液洗凈，再用蒸,餾水沖洗干燥后置適宜的密閉金屬容器中，迅速置烤箱中，除去玻璃器皿表面可能存在的外源性內(nèi)毒素。” 應(yīng)該特別注意，該規(guī)程明確規(guī)定

8、最后沖洗玻璃器皿必須“用蒸餾水沖洗，禁用純化水沖洗?！庇械目蛻羰褂梅礉B透制備的純化水沖洗試驗用玻璃器皿，結(jié)果試驗中所有的陽性對,照都為陰性，復(fù)核鱟試劑靈敏度時試驗結(jié)果誤差較大，這主要是由于純化水和蒸餾水的質(zhì)量不同所造成的。因純化水中存在的陰陽離子經(jīng)250高溫干烤不能完全被破壞，這時不同的離子就產(chǎn)生對鱟試劑酶反應(yīng)抑制或增強的反應(yīng)，為了保證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和檢驗報告的權(quán)威性，我們應(yīng)該嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，用多效蒸餾水沖洗鱟試驗用玻璃器皿。,移液管浸泡洗液時，應(yīng)如何放置？ A、正 B、反 反放（尖端向上）的優(yōu)點？ 1、保護(hù)移液管刻度的準(zhǔn)確性； 2、防止標(biāo)本缸底部結(jié)晶體堵塞移液管。,4、樣品成份及理

9、化性質(zhì)的影響 -葡聚糖樣物質(zhì)的影響 PH值的影響 金屬離子和弱酸陰離子的影響 藥物濃度的影響,1）、 -葡聚糖樣物質(zhì)的影響 常見現(xiàn)象：假陽性。 鱟試劑的特異性系指在藥品、生物制品和血液制品中鱟試劑能準(zhǔn)確測出被測物質(zhì)內(nèi)毒素的能力，既不能造成樣品內(nèi)毒素的漏檢，也不能將其它物質(zhì)錯判為內(nèi)毒素。,目前我公司研究證明，已知能與鱟試劑發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)有細(xì)菌內(nèi)毒素和-葡聚糖，而內(nèi)毒素反應(yīng)曲線為S型特征曲線，-葡聚糖反應(yīng)曲線為經(jīng)過0點的斜線。鱟試劑的特異性差的另一種表現(xiàn)，是將其它物質(zhì)（如-葡聚糖）判定為內(nèi)毒素，錯誤將合格藥品判為不合格，造成制藥廠直接經(jīng)濟(jì)損失。,鱟試劑反應(yīng)機(jī)理圖,判斷假陽性的方法： 1、特異性鱟試

10、劑法； 2、定量反應(yīng)曲線分析法； 3、家兔模擬試驗法。,假陽性事件： 1、2003年山東省青州某制藥廠，5%葡萄糖注射液（規(guī)格：100ml 產(chǎn)品批號：0307040101）； 2、2004年廣東省湛江某制藥公司，Vc注射液（產(chǎn)品批號：）； 3、2006年上海市某制藥公司，塑瓶裝5%葡萄糖注射液（產(chǎn)品批號：0501142）；,2）、PH值對反應(yīng)速度的影響 常見現(xiàn)象：樣品陽性不成立。 鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)的最適宜pH在6.5-8.0；pH 3 或10時，酶活性受到抑制。,,,,,相對活力,PH,7.0,PH對反應(yīng)速度的影響: 影響酶原的激活； 影響酶分子的構(gòu)象，過高過低的PH會改變酶的活性中心的構(gòu)象

11、，或甚至改變整個酶分子的機(jī)構(gòu)使其變性失活。,故鱟試驗時，供試品 pH 最好應(yīng)預(yù)調(diào)和6.5-8.0 為好，必要時可用無內(nèi)毒素的 HCl 或NaOH 稀溶液調(diào)節(jié) pH 值。美國、日本藥局方以及中國藥典故2005版規(guī)定檢品必須調(diào)節(jié)PH值6.0-8.0。,成功案例： 1、頭孢吡肟 2、鹽酸土霉素、土霉素 3、喹諾酮類輸液 4、血液保存液、紅細(xì)胞保存液,3）、金屬離子和弱酸陰離子 離子對細(xì)菌內(nèi)毒素測定結(jié)果影響較大，一方面陽離子如Fe3+、Al3+強度較大會引起內(nèi)毒素的聚集造成內(nèi)毒素局部濃度過高，同時還必須注意高價陽離子（如Fe3+）的氧化性對鱟試劑酶反應(yīng)具有強抑制作用；重金屬離子如Ag+、Cu2+、P

12、b2+可以使蛋白質(zhì)變性而使酶失活；另一方面鱟試劑必須在二價陽離子Ca2+、Mg2+的參與下才能被激活形成凝膠反應(yīng)。,許多藥物因PH值10時，其中的陰離子會吸收鱟試劑中的 Ca2+、Mg2+離子，使實驗呈假陰性。,成功案例： 1、碳酸氫鈉注射液 2、乙肝疫苗 3、注射用果糖二磷酸鈉,4）、藥物濃度 1、10%葡萄糖注射液 2、白蛋白、小牛血清 3、醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉 4、中藥類注射液,5、實驗員的影響 操作時嚴(yán)格按操作規(guī)程進(jìn)行，安瓿開啟前應(yīng)先用酒精棉球擦拭曲頸部，用將頸部折斷，防止碎玻屑掉入安瓿內(nèi)。在鱟試劑的溶解、樣品的稀釋及加樣時，取樣均應(yīng)準(zhǔn)確。如果一人獨立完成試驗，可先稀釋配制好內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液和

13、樣品溶液，然后開啟復(fù)溶鱟試劑，最后加樣，盡可能縮短鱟試劑溶液暴露在空氣中的時間（最好控制在15分鐘內(nèi)）。,6、環(huán)境的影響 保溫時間 保溫溫度 1）、保溫溫度 將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成2，進(jìn)行鱟試驗，然后分別放置于25、28、31、34、37、41、43、46、49水浴保溫。實驗中觀察到凝膠形成的速度隨著溫度的升高而加快，但到達(dá)49保溫90min也未出現(xiàn)凝膠。,從實驗可以看出，溫度對鱟試劑的靈敏度影響很大，保溫溫度在2541之間，隨著溫度的升高，反應(yīng)速度也升高，41尚未達(dá)到反應(yīng)速度峰值，25 時反應(yīng)速度已相當(dāng)快；在4146之間，溫度對鱟試劑的靈敏度無明顯影響；達(dá)到49或更

14、高溫度時，隨溫度升高而使酶蛋白逐漸變性，則鱟試劑被破壞，反應(yīng)速度反而降低。,2）、保溫時間 將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成2，進(jìn)行鱟試驗，37保溫，分別在10、20、30、40、50、70min時觀察，發(fā)現(xiàn)凝膠的形成狀態(tài)隨著時間的延長而堅固。,因此夏天室溫較高，如果試驗操作時間太長，細(xì)菌內(nèi)毒素與鱟試劑混合液不等進(jìn)入反應(yīng)儀器反應(yīng)已開始，實際反應(yīng)時間超過1小時。由于室溫不同，冬夏季節(jié)、南北地區(qū)之間的操作誤差將會很大。即使在25準(zhǔn)室溫下操作，操作時間拖得過長，細(xì)菌內(nèi)毒素含量較高時，測定誤差也不會小。,三、企業(yè)產(chǎn)品優(yōu)勢 1、能準(zhǔn)確判斷假陽性 用本企業(yè)研制生產(chǎn)的定量鱟試劑第一家準(zhǔn)確無

15、誤地檢測出了內(nèi)毒素與葡聚糖二者之間的區(qū)別，并公布了內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素反應(yīng)曲線。截止目前，還沒有第二個品牌的鱟試劑將假陽性區(qū)別出來，其他國內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)也未公布同類型曲線。 對于假陽性的鑒別已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)走在了世界同行業(yè)的前面。,2、對外交流歷史悠久，全面掌握中美兩國鱟試劑的區(qū)別 1）對外交流我公司歷史最悠久、交流技術(shù)最全面； 2）我公司掌握了中國和美國鱟試劑的全面區(qū)別； 3）用美國和中國的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，我公司鱟試劑標(biāo)示靈敏度都相當(dāng)準(zhǔn)確。 4）通過十多年的技術(shù)交流結(jié)果顯示，本公司的鱟試劑與美國同類產(chǎn)品質(zhì)量相比沒有任何差別，而且個別項目要優(yōu)于美國產(chǎn)品。,三、售后技術(shù)服務(wù)專業(yè)，技術(shù)優(yōu)勢明顯 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法

16、在我國已開展了十多年，經(jīng)過許許多多專家學(xué)者的努力，目前該行業(yè)已經(jīng)取得了非常重要的成果，但是該領(lǐng)域仍然有許多我們無法解決問題的存在，它并不想我們想象的那么簡單，這些問題的存在嚴(yán)重阻礙了該行業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展，我們將與客戶的交流以及客戶咨詢的相關(guān)問題，進(jìn)行一次歸納總結(jié)。通過工作中出現(xiàn)的問題有必要對以下情況進(jìn)行交流，以加強對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的正確理解，同時糾正一些錯誤的觀念。,如何全面理解細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中污染物對試驗結(jié)果的影響？ 如何正確認(rèn)識器皿洗滌的重要性？ 如何正確理解鱟試劑的抗干擾能力和鱟試劑的特異性？,許多客戶對污染的認(rèn)識是不全面或錯誤的，他們認(rèn)為在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查過程中，器皿被污染的結(jié)果必然導(dǎo)

17、致陽性結(jié)果的出現(xiàn)，但試驗結(jié)果正好與他們的認(rèn)識有時正好相反，可能陽性對照全為陰性，對此亦有百思不得其解。要正確理解這個問題，首先要正確理解鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)機(jī)理，鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)為一系列酶反應(yīng)，生物酶反應(yīng)受許多因素的干擾。在日常工作中，我們要特別注意一些因素對試驗結(jié)果的影響，如PH值、器皿的潔凈度以及環(huán)境因素等。,解決這些問題需要非常豐富的專業(yè)知識，我們公司在專業(yè)知識方面具有得天獨厚的優(yōu)勢，其他鱟試劑生產(chǎn)企業(yè)望塵莫及。 下面我們將客戶遇到的困難，其他鱟試劑生產(chǎn)企業(yè)無法解決的技術(shù)問題，最終由我們幫助解決了的案例列舉如下：,1、輸液塑瓶溶出物聚丙烯添加劑假陽性反應(yīng)鑒別方法； 2、鹽酸土霉素細(xì)菌內(nèi)毒素定量分析回收率偏低的技術(shù)問題； 3、陽性對照為陰性結(jié)果的問題； 4、頭孢類抗生素細(xì)菌內(nèi)毒素檢測假陽性問題； 5、乙肝疫苗細(xì)菌內(nèi)毒素檢測樣品陽性對照為陰性問題。,通過解決以上技術(shù)問題，我們展示了企業(yè)的技術(shù)實力，加強了與客戶之間的溝通，贏得了客戶的信任，贏得了市場。,