《蛋白質(zhì)相互作用》PPT課件

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1、 Protein-protein Interaction 蛋 白 質(zhì) -蛋 白 質(zhì) 相 互 作 用 03/27/2009 Protein-Protein Interactions- A Common Theme in Cell Biology 蛋 白 質(zhì) -蛋 白 質(zhì) 相 互 作 用 細(xì) 胞 生 物 學(xué) 領(lǐng) 域 的 普 遍 主 題 * DNA * RNA * ProteinCell assembly and function/細(xì) 胞 組 裝 與 功 能MessengerHeadquarterExecutor Stable, DNA mutationStable/Versatile, rRNA,

2、 tRNA, mRNAVersatile, Protein modificationProtein-Protein interactionProtein-Other component interaction Protein-Protein Interactions Single protein Protein complex Protein complex interaction Protein complex network Cell, Versatile, Dynamic, Accurate regulationCell assembly and functionProtein-Prot

3、ein Interactions Interaction Domain - Structural basis for protein interaction 相 互 作 用 區(qū) 域 是 蛋 白 質(zhì) 相 互 作 用 的 結(jié) 構(gòu) 基 礎(chǔ)* 信 號(hào) 蛋 白 ， 調(diào) 節(jié) 蛋 白 以 及 大 多 數(shù) 其 他 的 蛋 白 質(zhì)都 具 有 包 括 相 互 作 用 區(qū) 域 在 內(nèi) 的 好 幾 個(gè) 結(jié) 構(gòu) 域 ； * 有 些 多 肽 僅 由 相 互 作 用 區(qū) 域 組 成 ， 從 而 充 當(dāng) 蛋白 質(zhì) 復(fù) 合 物 的 核 心 。 Interaction Domain - Structural basis for

4、protein interaction 相 互 作 用 區(qū) 域 是 蛋 白 質(zhì) 相 互 作 用 的 結(jié) 構(gòu) 基 礎(chǔ)*SH2 domain: phosphotyrosine-containing peptides recognition domain。SH2 分 布 最 為 廣 泛 ， 識(shí) 別 特 定 的 含 有 磷 酸 化 Tyr的 多 肽 模塊 。 SH3 SH2 Y kinase SH3 SH2 SH3pYEEI pYVNVSrc SH2 domain: Grb2 SH2 domain: Interaction domain and Protein interactionSignaling

5、 transduction pathway Physiological functions of protein interactions Localization 蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位 *蛋 白 質(zhì) 的 亞 細(xì) 胞 定 位 與 其 功 能 密 切 相 關(guān) ；* 涉 及 ： 蛋 白 質(zhì) -蛋 白 質(zhì) 相 互 作 用 ； 蛋 白 質(zhì) 與 磷 脂 的 相 互 作 用 ；* 蛋 白 質(zhì) 的 組 織 特 異 性 與 亞 細(xì) 胞 定 位 的 研 究 是 蛋 白 質(zhì) 功 能 研 究 的 起 始 步 驟 Protein-protein interaction can be used to build comp

6、lex biological systems. 蛋 白 質(zhì) -蛋 白 質(zhì) 相 互 作 用 是 功 能 復(fù) 合 物 形 成 的 基 礎(chǔ) 。 （ 如 線 粒 體 內(nèi) 膜 呼 吸 鏈 ）Physiological functions of protein interactionsLocalization and Trafficking Aberrant interactions can contribute to pathogenesis; 錯(cuò) 誤 的 相 互 作 用 可 能 導(dǎo) 致 病 理 形 象 的 出 現(xiàn) 。 如 Alzheimers disease, beta-淀 粉 樣 結(jié) 構(gòu) 的 堆 積

7、 ； Physiological functions of protein interactionsLocalization and Trafficking Inducible protein interaction 細(xì) 胞 面 對(duì) 不 斷 改 變 的 環(huán) 境 表 現(xiàn) 出 來 的 動(dòng) 態(tài) 行 為 有賴 于 蛋 白 質(zhì) 的 翻 譯 后 修 飾 以 及 它 帶 來 的 蛋 白 質(zhì) 相互 作 用 的 變 化 。 Techniques and computationElucidation of Protein-Protein InteractionsBiophysical TechniquesMass

8、 SpectrometrySurface Plasmon Resonance Atomic Force MicroscopyNMRX-ray Crystallography High Throughput TechniquesLibrary ScreeningDegenerate Peptide LibrariesSpot BlotsCo-IPsGST-pulldownsYeast 2-HybridPhage DisplayStandard TechniquesCo-IPsGST-pull downsYeast 2-HybridPhage Display In vivo ImagingFRET

9、BRETProtein Interaction Networks Techniques：Principle, Process, Advantage and DisadvantageGST-Pull downPrinciple: Affinity purification Affinity between Interaction motif /polypeptide and its interaction proteins;Advantage: Direct interaction / In vitroProcess: Interaction motifGST Immobilized onGlu

10、tathione beads Affinity column Making Affinity purificationfrom tissue or cell lysate Techniques： 免 疫 沉 淀 質(zhì) 量 作 用 定 律 決 定 IP的 成 功 度 Techniques： 免 疫 沉 淀 （ 非 變 性 ） 免 疫 沉 淀 的 靈 敏 度 取 決 于 Protein A (or G) 與 IgG的 Kd、 IgG與抗 原 的 Kd值 。 所 以 增 加 抗 原 或 抗 體 的 濃 度 、 使 用 與 抗 體 直 接 共價(jià) 偶 聯(lián) 的 珠 子 進(jìn) 行 免 疫 沉 淀 可 以 提 高

11、 靈 敏 度 ； Protein A Bead IgG AntigenKd Kd* IgG Kd Antigen Co-Immunoprecipitation /共 免 疫 沉 淀Principle: Affinity purification/ 親 和 純 化Advantage: In vivo (Physiological status) / 代 表 生 理 狀 態(tài) 下 的 相 互 作 用X Y X YCell Cell Lysis andImmunoprecipitation of protein X Z Z細(xì) 胞 裂 解 與 蛋 白 質(zhì)X的 免 疫 沉 淀 Techniques： 免疫

12、沉淀（非變性）1.生理活性的保持： a. 全程低溫操作； b. 裂解液中加入蛋白酶抑制劑；2. 免疫沉淀的靈敏度取決于Protein A(or G) 與 IgG的Kd、IgG與抗原的Kd值。 所以增加抗原或抗體的濃度、使用與抗體直接共價(jià)偶聯(lián)的珠子進(jìn)行免疫沉 淀可以提高靈敏度； Protein A Bead IgG XKd Kd* IgG XKd Techniques： 免疫沉淀（非變性） 免疫沉淀的產(chǎn)物如用于SDS-PAGE及及免疫印跡進(jìn)一步分析時(shí)， * 需要去除鹽的干擾，PBS 或其它洗滌緩沖液應(yīng)可能去除； 大量IgG摻入也影響電泳的效果，如脫尾和擴(kuò)散。 檢測(cè)信號(hào)十分微弱時(shí)，這種條帶的擴(kuò)散可

13、能導(dǎo)致根本無法獲得 信息； Techniques： 免疫沉淀（非變性）免 疫 沉 淀 的 產(chǎn) 物 如 用 于 SDS-PAGE及 及 免 疫 印 跡 進(jìn) 一 步 分 析 時(shí) ，大 量 的 IgG摻 入 樣 品 后 導(dǎo) 致 免 疫 印 跡 時(shí) 出 現(xiàn) 非 特 異 性 條 帶 ；對(duì) 免 疫 共 沉 淀 的 結(jié) 果 分 析 影 響 尤 其 大 ； IgG目 的 蛋 白 用 目 的 蛋 白 的 抗 體 進(jìn) 行 免 疫 沉 淀 ， 再 用 免 疫 印 跡 法 進(jìn) 行 檢 測(cè) ； GFP WT YF Mut(6) - + - + - + IP: GFPIB: 4G10 (pTyr) MTSS1-GFPGF

14、P PDGF115 93 49.8 35.8 29.2198 - + - + - + Reblot: GFP MTSS1-GFP GFP WT YF Mut(6) Techniques： 免疫共沉淀（非變性）操 作 同 非 變 性 免 疫 沉 淀 ， 只 是 檢 測(cè) 的 是 相 互 作 用 蛋 白 ；其 效 率 還 涉 及 復(fù) 合 物 中 蛋 白 質(zhì) X， Y， Z的 Kd 值 。 Protein A Bead IgG X Y Z Protein A IgG Protein X* Protein Y Protein ZKdKdKdKd Techniques： 免 疫 共 沉 淀 （ 非 變 性

15、 ）1. 免 疫 復(fù) 合 物 中 蛋 白 質(zhì) X， Y， Z的 Kd 值 越 小 ， 即 越 穩(wěn) 定 ， 有 利 于 免 疫 共 沉 淀 的 進(jìn) 行 ;2. 免 疫 沉 淀 中 提 高 靈 敏 度 的 方 法 同 樣 適 用 于 免 疫 共 沉 淀 ； X Y Z Protein A IgG Protein X* Protein Y Protein ZKdKdKdKd Techniques： 免 疫 共 沉 淀 （ 非 變 性 ） 細(xì) 胞 裂 解 液 的 幾 點(diǎn) 考 慮 ：1. 復(fù) 合 物 的 穩(wěn) 定 ， 提 高 靈 敏 度 ， 但 會(huì) 降 低 特 異 性 ；2. 針 對(duì) 特 定 的 復(fù) 合

16、物 ， 細(xì) 胞 裂 解 液 中 可 能 加 入 磷 酸 酯 酶 抑 制 劑 或 者 ATP及 一 些 金 屬 離 子 以 維 持 復(fù) 合 物 的 穩(wěn) 定 ； Techniques： 免 疫 共 沉 淀免 疫 共 沉 淀 中 的 非 特 異 性 ：BAx Y 細(xì) 胞 裂 解蛋 白 質(zhì) X的 抗 體進(jìn) 行 免 疫 沉 淀 X YX YB A X Techniques： 免 疫 共 沉 淀 ： 基 于 免 疫 共 沉 淀 中 非 特 異 性 的 實(shí) 驗(yàn) 設(shè) 計(jì) 考 慮 （ 類型 I） BAx Y 細(xì) 胞 裂 解蛋 白 質(zhì) X的 抗 體進(jìn) 行 免 疫 沉 淀 A X原 因 ： 抗 體 的 非 特 異

17、性 Techniques： 免 疫 共 沉 淀 ： 基 于 免 疫 共 沉 淀 中 非 特 異 性 的 實(shí) 驗(yàn) 設(shè) 計(jì) 考 慮 （ 類 型 I）1.抗 體 的 質(zhì) 量 ： 抗 體 的 特 異 性 ；2.盡 可 能 的 設(shè) 置 多 種 陰 性 對(duì) 照 ； 一 般 采 用 兔 子 免 疫 前 的 血 清 (pre-immune serum) 同 時(shí) 進(jìn) 行 免 疫 沉 淀 及 后 續(xù) 分 析 ;3.使 用 目 標(biāo) 蛋 白 的 多 種 抗 體 進(jìn) 行 免 疫 沉 淀 并 比 較 ；4.采 用 不 表 達(dá) 目 標(biāo) 蛋 白 的 細(xì) 胞 裂 解 物 同 時(shí) 進(jìn) 行 免 疫 沉 淀 并 比 較 ；5.增 強(qiáng)

18、 細(xì) 胞 裂 解 液 的 嚴(yán) 謹(jǐn) 性 ， 降 低 非 特 異 性 ；6.檢 測(cè) 兩 種 蛋 白 質(zhì) 的 相 互 作 用 時(shí) ， 同 時(shí) 用 兩 個(gè) 蛋 白 質(zhì) 的 抗 體 進(jìn) 行 實(shí) 驗(yàn) ； BAx Y 細(xì) 胞 裂 解蛋 白 質(zhì) X的 抗 體進(jìn) 行 免 疫 沉 淀 X YX YB XTechniques： 免 疫 共 沉 淀 ： 基 于 免 疫 共 沉 淀 中 非 特 異 性 的 實(shí) 驗(yàn) 設(shè) 計(jì) 考 慮（ 類 型 II）抗 原 復(fù) 合 物 與 其 它 蛋 白 質(zhì) 的 非 特 異 性 相 互 作 用 ；抗 原 復(fù) 合 物 解 離 X Techniques： 免疫共沉淀： 基于免疫共沉淀中非特異性

19、的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考慮（類型 II） * 當(dāng) X-Y 的復(fù)合物不很穩(wěn)定或解離常數(shù)大時(shí)，可以考慮使用細(xì)胞 可滲透的交聯(lián)劑(Cross-linker) X NH2 YNH2 活性基團(tuán)活性基團(tuán)A BAx Y 細(xì) 胞 裂 解蛋 白 質(zhì) X的 抗 體進(jìn) 行 免 疫 沉 淀 Techniques： 免 疫 共 沉 淀 ： 基 于 免 疫 共 沉 淀 中 非 特 異 性 的 實(shí) 驗(yàn) 設(shè) 計(jì) 考 慮（ 類 型 II） * 當(dāng) X-Y 的 復(fù) 合 物 是 瞬 間 形 成 的 或 解 離 常 數(shù) 大 時(shí) ， 可 以 考 慮 使 用 細(xì) 胞 可 滲 透 的 交 聯(lián) 劑 (Cross-linker) X NH 2 YNH2活

20、性基團(tuán)活性基團(tuán)A BAx Y 細(xì) 胞 裂 解蛋 白 質(zhì) X的 抗 體進(jìn) 行 免 疫 沉 淀 X YTechniques： 免 疫 共 沉 淀 ： 基 于 免 疫 共 沉 淀 中 非 特 異 性 的 實(shí) 驗(yàn) 設(shè) 計(jì) 考 慮（ 類 型 II） 研 究 方 案 :Affinity purification Step: (1) F-actin 親 和 純 化 ； (2) MS 數(shù) 據(jù) 搜 索 和 初 步 分 析 ； (3) 按 鑒 定 到 的 蛋 白 質(zhì) 與 F-actin結(jié) 合 的 屬 性 分 類 ; (4) 按 MS鑒 定 到 的 蛋 白 質(zhì) 的 生 物 學(xué) 功 能 分 類 ； (5) 生 物 學(xué)

21、 功 能 相 同 或 相 近 的 蛋 白 質(zhì) 聚 類 , 分 析 復(fù) 合 物 組 成 ； (6) 根 據(jù) 這 些 蛋 白 質(zhì) 在 小 腦 不 同 發(fā) 育 時(shí) 期 的 表 達(dá) 模 式 聚 類 ； (7) 由 此 將 與 小 腦 發(fā) 育 相 關(guān) 的 F-actin 結(jié) 合 蛋 白 與 小 腦 特 定 發(fā) 育 時(shí) 期 的 功 能 相 聯(lián) 系 。 部 分 鑒 定 到 的 F-actin 結(jié) 合 蛋 白 的功 能 歸 屬 Proliferation Mattila et al, J Biol Chem, 278, 8452,2003; Bompard et al, J Cell Sci, 118, 53

22、93, 2005.Lin et al, Oncogene,24, 2059,2005. 利 用 亞 細(xì) 胞 定 位 及 蛋 白 質(zhì) 相 互 作 用 等 信 息 進(jìn)行 蛋 白 質(zhì) 功 能 歸 屬例 1：從免疫共沉淀中得到的蛋白質(zhì)中篩選重要功能相關(guān)蛋白：利用免疫共沉淀方法找到的9個(gè)p53(胞漿和核定位） 結(jié)合蛋白 1. GRP-94 GRP-94 2. Alpha-actinin 1 GRP-78 分子伴侶 * 3. MCM3 GRP-75 4. GRP-78 5. GRP-75 2 MCM3 DNA復(fù)制準(zhǔn)許因子* 6. Lamin A/C 7. Ezrin/Cytovillin Alpha-ac

23、tinin 胞漿 8. CD98 antigen 3 Lamin A/C 核纖層 細(xì)胞骨架 ？ 9. Protein kinase C Ezrin/cytovilin 胞漿 4 Protein Kinase C 激酶 ？ 5 CD98 antigen 跨膜糖蛋白 X 例3 Sra1與Nap1參與Rac誘導(dǎo)的片狀偽足形成 從牛腦中用傳統(tǒng)的柱層析分離到的蛋白質(zhì)復(fù)合物，組分 經(jīng)質(zhì)譜鑒定，包括Nap1,Sra-1 homologue，PIR121, WAVE1 and Abi等組分。 免 疫 共 沉 淀 與 GST-Pull down驗(yàn) 證Rac活 化 時(shí) 復(fù) 合 物 的 存 在 Rac活化時(shí)Sra-1與Nap1在細(xì)胞中的重新定位 1. Sra-1 與Nap1定位于片狀偽足頂部 （免疫熒光） RNA 干擾Nap1，Sra1 的表達(dá)對(duì)Rac功能的影響 RNA 干擾Nap1，Sra1 的表達(dá)對(duì)Rac功能的影響 謝謝！