兔肝DNA的提取、二苯胺顯色法測

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1、單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,生物基因組序列比對分析，分子進(jìn)化,兔肝,DNA,的提取與二苯胺顯色法測定,DNA,含量,目的基因,SNP,位點的鑒定及其意義,綜合性設(shè)計性實驗-5,此實驗共包括如下三個部分,第一部分：生物基因組序列比對分析，分子進(jìn)化,第二部分：兔肝,DNA,的提取和測定,第三部分：目的基因,SNP,位點的鑒定及其意義,第一部分：生物基因組序列比對分析、分子進(jìn)化,全基因組序列數(shù)據(jù)的積累,使得不同生物之間的進(jìn)化關(guān)系可以從分子水平上進(jìn)行研究。不同于以往單純依賴于生物形態(tài)學(xué)特征,這種分析更加深刻更加本質(zhì)。利用分子序列使得我們可以研

2、究,從單細(xì)胞生物到植物、動物甚至人的進(jìn)化關(guān)系。,比較基因組學(xué),(Comparative Genomics),是基于基因組圖譜和測序基礎(chǔ)上，對已知的基因和基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，來了解基因的功能、表達(dá)機(jī)理和物種進(jìn)化的學(xué)科。利用模式生物基因組與人類基因組之間編碼順序上和結(jié)構(gòu)上的同源性，克隆人類疾病基因，揭示基因功能和疾病分子機(jī)制，闡明物種進(jìn)化關(guān)系，及基因組的內(nèi)在結(jié)構(gòu)。目前從模式生物基因組研究中得出一些規(guī)律：模式生物基因組一般比較小，但編碼基因的比例較高，重復(fù)順序和非編碼順序較少；其,GC%,比較高；內(nèi)含子和外顯子的結(jié)構(gòu)組織比較保守，剪切位點在多種生物中一致。,比較作圖就是利用共同的遺傳標(biāo)記（主要是分子

3、標(biāo)記、基因的,cDNA,克隆以及基因組克?。ο嚓P(guān)物種進(jìn)行物理或遺傳作圖，比較這些標(biāo)記在不同物種基因組中的分布情況，提示染色體或染色體片段上的同線性（,synteny,）,或共線性（,collinearity,），,從而對不同物種的基因組結(jié)構(gòu)及基因組進(jìn)化歷程進(jìn)行精確分析?；蚪M比較作圖的研究，不僅提示了同屬甚至同科物種基因組間的同源性和差異性，對不同物種在起源、演化過程中的變化的研究具有巨大的啟示作用。,比較作圖的研究意義在于：一、根據(jù)不同種的基因組基因及其排列順序的高度保守特點繪制而成的比較圖，可以研究和探明它們的進(jìn)化線索。廣泛的比較作圖可為多個種所用，建立它們之間的聯(lián)系框架或系統(tǒng)。,基因組

4、比對軟件,Mauve,http:/genome.lbl.gov/vista/index.shtml,VISTA,一個最基本的假設(shè)是地球上所有物種都有一個共同的祖先，從這個祖先開始以數(shù)狀形式發(fā)展，通常稱為生命之樹（,tree of life,）。,分子進(jìn)化研究的目的：通過序列同源性的比較，分析序列間的變化進(jìn)而了解基因的進(jìn)化以及生物系統(tǒng)發(fā)生的內(nèi)在規(guī)律。,分子進(jìn)化有兩個主要研究對象，以全基因組序列為研究對象分析物種進(jìn)化；以某基因在多個物種的同源序列為研究對象分析基因的進(jìn)化,分子進(jìn)化,末端,物種,中間枝條,根,末端分支,節(jié)點,理論上，一個,DNA,序列在物種形成或基因復(fù)制時，分裂成兩個子序列，因此系統(tǒng)

5、發(fā)育樹一般是二歧的；,如果是一棵有根樹，則樹根代表在進(jìn)化歷史上是最早的、并且與其它所有分類單元都有聯(lián)系的分類單元，反映時間順序；,如果找不到可以作為樹根的單元，則系統(tǒng)發(fā)生樹是無根樹，反映距離；,從根節(jié)點出發(fā)到任何一個節(jié)點的路徑指明進(jìn)化時間或者進(jìn)化距離。,系統(tǒng)發(fā)生樹性質(zhì)：,基因分子進(jìn)化分析步驟,（1）以目的基因為種子序列，搜索其在其它物種中的同源序列,（2）將上述同源基因的核酸或蛋白序列作序列比對，,Clustal X,（3）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹：MEGA，PHYLIP，PAUP,（4）評價所建立的樹，分析其生物學(xué)意義,實驗?zāi)康?學(xué)習(xí)從動物組織中提取,DNA,及其含量、純度測定的原理和方法,掌握離心機(jī)

6、及島津,UV-120,的使用方法,第二部分：兔肝脫氧核糖核酸（DNA）的提取和測定,利用脫氧核糖核酸蛋白和核糖核酸在電解質(zhì)中不同的溶解度使二者分離，在0.15M的氯化鈉溶液中脫氧核糖核酸蛋白的溶解度最低。相反，核糖核蛋白能在0.15M氯化鈉中溶解，因此可利用不同濃度的氯化鈉溶液將核酸核蛋白、脫氧核糖核酸蛋白解離出來，而蛋白質(zhì)變性沉淀，再用氯仿異丙醇抽提，將蛋白質(zhì)沉淀除去，而DNA則溶解。,實驗原理,實驗操作,1.棄上清留沉淀,兔肝,稱取4 g 加,8ml 1X SSC,1X SSC洗,兩次,取8ml勻漿液,離 心,勻漿、過濾,2.棄上清留,沉淀,加至8ml,1X SSC,離 心,加至 8ml

7、0.15M,NaCl-0.1M,Na,2,EDTA,離 心,3.棄上清留沉淀,（脫氧核糖核蛋白）,加約2倍,體積,95%乙醇,沉淀,加 0.15M,NaCl-0.1M,Na,2,EDTA至4ml,攪拌10min,逐滴加入0.5ml,15%SDS,加1ml,5M NaCl,去塞！離心,加塞反復(fù),倒置抽提,10min,吸取上清液,勿吸到中間層！,等體積氯仿-異丙醇混合液,DNA析出,用玻棒挑出,挑取DNA至一離,心管(小燒杯)用10ml,0.01N NaOH溶解,重復(fù),一次,輕攪,10min,注意事項,盡可能避免,DNA,的斷裂,1.,勻漿時應(yīng)保持低溫，且勻漿時間應(yīng)短；,2.,實驗中使用的吸取,D

8、NA,水溶液的滴管口應(yīng)粗短并成鈍口。,保持,DNA,活性，避免酸堿或其他變性因素使,DNA,變性。,攪動不要太大，以免使,DNA,斷裂。,整個實驗過程應(yīng)在低溫條件下進(jìn)行。,攪拌時動作要輕，反復(fù)倒置抽提，不可激烈振蕩。,加入,15%SDS,時要慢，邊攪邊滴加（兩人配合）。,SDS,的溫度不能太低，易凝固。吸過,SDS,的吸管要及時清洗。,加入,CHCl,3,/IAA,液離心后，分為三層，由上到下為：無機(jī)相,-,蛋白相,-,有機(jī)相。,DNA,溶解在無機(jī)相中，吸取無機(jī)相時動作要輕，不要吸到蛋白相。,CHCl,3,/IAA,會溶解有機(jī)玻璃，用完后不能豎直放置在試管架上，必須沖洗干凈。,離心機(jī)的使用,打

9、開電源開關(guān)；,平衡放置離心管；蓋上蓋子。,調(diào)節(jié)時間旋鈕至,10min,；,緩慢調(diào)節(jié)速度旋鈕至,9,檔，每,5-10s,上升,1,檔；,離心完畢后機(jī)器自動停止，待完全停止后，打開蓋子取出離心管。,離心管必須平衡后，才能啟動離心機(jī)；,離心機(jī)的蓋子必須蓋緊；,離心過程中不要用重物撞擊離心機(jī)；,要等離心機(jī)完全停止轉(zhuǎn)動后再打開蓋子。,二苯胺顯色法測定DNA含量,DNA,的,-,脫氧核糖在酸性條件下轉(zhuǎn)變成,-,羥基,-r,酮基戊醛，與二苯胺共熱后形成藍(lán)色化合物，該化合物在595,nm,處最大吸收。,每,ml,含,20,400,g,范圍內(nèi)光密度與,DNA,的濃度成正比。反應(yīng)液中加入少量乙醛，可提高反應(yīng)的靈敏

10、度。,實驗原理,取,8,支試管，按實驗指導(dǎo)的表格加入試劑。,加畢置沸水浴,10,分鐘，取出冷卻；以,0,號管（空白管）調(diào)零點，于,595nm,波長比色。,以光密度為縱坐標(biāo),，,DNA,含量（,g/ml,）,為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,.,將實驗中所得到的兔肝,DNA,溶液作為待測樣品，取兩只試管，分別標(biāo)“,U”,和“,B”,，,按表加入試劑。,混勻，置沸水中,10min,取出冷卻。,在,595nm,處，以,B,管調(diào)零，測得待測液的光密度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相當(dāng)于該光密度值,DNA,的含量。,實驗操作,核酸在220-320nm處呈特征性吸收，在260nm處有最大吸收，測A260/A280可得知核酸的

11、大致純度。,A260/A280,1.8 表示DNA純,1.8 RNA含量高,1.8 蛋白含量高,核酸紫外吸收光譜的測定,以0.01N NaOH 為空白管，在260nm和280nm波長處測定樣品液的吸光度，求出樣品液的A,260,/A,280,比值和DNA濃度。,實驗操作,第三部分：目的基因SNP位點的鑒定及其意義,SNP(single nucleotide,polymophism,),即單核苷酸多態(tài)，是指群體中變異頻率大于,1%,的單個核苷酸改變而導(dǎo)致的核酸序列多態(tài)，包括置換、顛換、缺失和插入。,一般來說，一個,SNP,位點只有兩種等位基因，因此又叫雙等位基因。,SNP,在人基因組中的發(fā)生頻率

12、比較高，大約平均每,1000,個堿基中就有一個多態(tài)位點。,C C,A,T T G A C.,G G,T,A A C T G.,C C,G,T T G A C.,G G,C,A A C T G.,SNP對基因功能影響,根據(jù)在基因中的位置，,SNP,可分為基因編碼區(qū),SNP(coding SNP,cSNP,),、,基因內(nèi)含子區(qū),SNP,和基因調(diào)控區(qū),SNP(regulatory SNP,rSNP,),。,其中,cSNP,根據(jù)是否改變編碼的氨基酸又可分為同義,cSNP,(synonymous,cSNP,),和非同義,cSNP,(non-synonymous,cSNP,),。,非同義,cSNP,：，,

13、蛋白激酶,PRKCH,基因內(nèi)的一個非同義,cSNP(1425G/A),，,等位位點從,G,到,A,的改變可導(dǎo)致激酶的活力增強(qiáng)，進(jìn)而激活其信號通路，使患腦梗塞的風(fēng)險增加。,同義,cSNP,：,多向性耐藥基因,1(,MDR1,),第,3435,位的一個同義,SNP(3435C/T),可改變,MDR1,基因產(chǎn)物的功能。這種機(jī)制不是通過改變,mRNA,及蛋白的產(chǎn)量水平，而是通過改變,mRNA,的構(gòu)象、蛋白的折疊及細(xì)胞定位，進(jìn)而影響基因功能的發(fā)揮。,內(nèi)含子區(qū),SNP,：,葡萄糖激酶調(diào)節(jié)蛋白,(,GCKR,),基因第,16,號內(nèi)含子中的一個,SNP(rs780094,T/C),，,相比,C,等位位點，含,

14、T,等位位點時，個體表現(xiàn)為葡萄糖水平較低、胰島素耐受較少，患,2,型糖尿病的風(fēng)險較低。,調(diào)控區(qū),rSNP,：,IFN-,基因啟動子區(qū)含一個,rSNP(-764G/C),，,相比,C,等位位點，含,G,等位位點時，,IFN-g,基因啟動子與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合增強(qiáng)，啟動子活力提高到,23,倍。,目的基因SNP的查詢,輸入基因名稱與物種名稱，,如 NGAL,homo,實驗設(shè)計,請介紹除了,NCBI,以外的,SNP,數(shù)據(jù)庫及其使用；,查詢?nèi)?Fascin,，,Ezrin,，,NGAL receptor,等基因的,SNP,位點，列出它們編碼區(qū)的,SNP,，,討論這些,SNP,對蛋白結(jié)構(gòu)與功能的影響；,請列舉檢測,SNP,的實驗技術(shù)，并評價其優(yōu)缺點；,請設(shè)計一個實驗檢測一個基因的,SNP,，,并分析這些,SNP,與某種疾病的關(guān)系；,若要判斷,SNP,與疾病有明顯關(guān)系，需要什么條件。,