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1、
實驗十四 血清膽固醇測定
（膽固醇氧化酶法）
膽固醇的測定方法很多；通?？煞譃榛瘜W(xué)試劑比色法、酶法、氣相色譜法、高效液相色譜法、核素稀釋質(zhì)譜法五大類?；瘜W(xué)試劑比色法中有直接法和間接法；前者可用血清直接測定，后者是用溶劑或其它方法提取膽固醇后再作定量。酶法由于操作簡便、結(jié)果準確，試劑無腐蝕性，而且因使用特異性酶，大大減少了血液中其它成分的干擾，目前已成為測定膽固醇的主要方法。
【目的】
1．了解膽固醇氧化酶法測定血清膽固醇的原理，能進行血清膽固醇測定的操作。
2.掌握血清膽固醇測定的臨床意義。
【原理】
血清中總膽固醇（TC）包括膽固醇酯(CE)和游離型膽固醇(FC),酯型占
2、70%，游離型占30%。膽固醇酯酶（CEH）先將膽固醇酯水解為膽固醇和游離脂肪酸（FFA），膽固醇在膽固醇氧化酶（COD）的作用下氧化生成Δ 4 -膽甾烯酮和過氧化氫。后者經(jīng)過氧化物酶（POD）催化氫與4-氨基安替比林（4-AAP）和酚反應(yīng)，生成紅色的醌亞胺，其顏色深淺與膽固醇的含量呈正比，在500nm波長處測定吸光度，與標準管比較可計算出血清膽固醇的含量。反應(yīng)式如下：
【器材】
試管、吸管、試管架、微量加樣器、恒溫水浴箱、分光光度計。
【試劑】
酶法測定膽固醇多采用市售試劑盒。
1. 酶應(yīng)用液 膽固醇酶試劑的組成為：
pH6.7磷酸鹽緩沖液 50mmol/L
3、
膽固醇酯酶 ≥200U/L
膽固醇氧化酶 ≥100U/L
過氧化物酶 ≥3 000U/L
1 / 3
4-氨基安替比林 0.3 mmol/L
苯酚 5 mmol/L
此外還含有膽酸鈉和Triton X-100，膽酸鈉是膽固醇酯酶的激活劑，表面活性劑Triton X-100能促進脂蛋白釋放膽固醇和膽固醇酯，有利于膽固醇酯的水解。
2． 5.17 mmol/L（200mg /dl）膽固醇標準液
精確稱取膽固醇 200mg溶于無水乙醇，移入100ml容量瓶
4、中，用無水乙醇稀釋至刻度(也可用異丙醇等配制)。
【操作】
取試管3支，編號，按下操作。
表3-15 酶法測定血清膽固醇操作步驟
加入物（ml）
測定管
標準管
空白管
血清
0.02
－
－
膽固醇標準液
－
0.02
－
蒸餾水
－
－
0.02
酶應(yīng)用液
2.00
2.00
2.00
混勻后，37℃水浴保溫15分鐘，在500nm波長處比色，以空白管調(diào)零，讀取各管吸光度。
【計算】
【注意事項】
1. 黃疸血清過高的膽紅素可還原—部分反應(yīng)中的H2O2，降低顯色反應(yīng)，使結(jié)果偏低。但測定膽固醇，膽紅素對酶法的干擾比化學(xué)法小。
2.
5、用膽固醇標準液引起的誤差較大，故目前提倡采用膽固醇定值血清為標準。
3. 輕度溶血對測定結(jié)果無影響，但明顯溶血可使結(jié)果增高，此時可用一個不加COD的空白管從結(jié)果中減去后糾正。
4. 其它影響因素，如維生素C、谷胱甘肽、氟化物引起負偏差。
【正常參考范圍】
3.10～5.70mmol/L
【臨床意義】
1. 血清膽固醇增高 常見于動脈粥樣硬化、原發(fā)性高脂血癥、糖尿病、腎病綜合征、膽管阻塞、甲狀腺功能減退。
2. 血清膽固醇降低 常見嚴重貧血、甲狀腺功能亢進、長期營養(yǎng)不良等。
【結(jié)果及分析】
【思考題】
1．膽固醇有哪些重要的生理功能，血清膽固醇升高對機體最嚴重的危害是什么？
2．膽固醇在體內(nèi)可轉(zhuǎn)變?yōu)槟男┪镔|(zhì)，如何排泄？
3．實驗中需要哪幾種酶參加，各有什么作用？
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實驗十四血清膽固醇測定(膽固醇氧化酶法)
