臨床醫(yī)學(xué)專業(yè) 多西紫杉醇誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究

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1、 多西紫杉醇誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究 目錄 摘要 I Abstract II 1.1 材料和試劑 2 1.2 儀器 2 2.1細(xì)胞培養(yǎng) 3 2.2 細(xì)胞的維持和培養(yǎng) 4 2.2.1 細(xì)胞的復(fù)蘇 4 2.2.2 A549細(xì)胞更換新的培養(yǎng)液 4 2.2.3 A549細(xì)胞的傳代 5 2.3 分組給藥 5 2.4 MTT溶液的配置與檢測 5 2.4.1配制 6 第 3 章 實(shí)驗(yàn)計(jì)算以及結(jié)果 7 3.1 計(jì)算IC50 7 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 7 參考文獻(xiàn) 10 1 摘要 目的 觀察多西紫杉醇誘導(dǎo)hepg2 PC3 MD-231 A549

2、 四種腫瘤細(xì)胞凋零并對其作用機(jī)制進(jìn)行探討。 方法 培養(yǎng)4種細(xì)胞，取對數(shù)生長期細(xì)胞分為五組，空白對照組、模型組、蜂膠黃酮高、中、低劑量組，劑量分別為200mg/L、100 mg/L、50 mg/L.藥物預(yù)處理2h后，做MTT檢測。通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算IC50. 結(jié)果 各組細(xì)胞IC50值 結(jié)論 多西紫杉醇對腫瘤細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡作用 關(guān)鍵詞 多西紫杉醇；hepg2；A549；PC3；M-231；；細(xì)胞凋亡 Abstract Study on the effect of docetaxel on tumor cell proliferation inhi

3、bition and in tumor chemotherapy, take the cell count, morphologic observation, flow cytometry method for the detection and observation respectively and combined with docetaxel on proliferation of human tumor cell lines in nude mice bearing human tumor inhibition; to establish animal model, to treat

4、 separately and combined with docetaxel, and blank control. Observation of growth and pathological characteristics of the tumor body. Through the experiments of MTT detection test of docetaxel on tumor cell proliferation inhibition. Using different concentrations of tumor cell suppression test, the

5、influence of the concentration on the survival of tumor cells.The experiment is divided into two parts, respectively, and MTT detection of cell culture. Keywords: Docetaxe l Stem cells Research Application 前言 紫杉類藥物屬于紅豆杉的樹皮或針葉中提取或半合成的新抗腫瘤藥物，作用在微管以及微管蛋白系統(tǒng)，紫杉類藥物與其他植物堿不同，紫杉類藥物通過促進(jìn)微管雙聚體

6、裝配成微管通過防止去多聚化過程而使微管穩(wěn)定，阻滯細(xì)胞于 G 和 M 期，從而抑制癌細(xì)胞的有絲分裂和增殖。目前該類藥物臨床上有紫杉醇和多西紫杉醇docetaxe1等。采用多西紫杉醇治療法具有來源廣泛、容易獲取、可迅速擴(kuò)增、自體移植無免疫排斥等諸多優(yōu)勢，使其在細(xì)胞治療及組織工程方面具有重要的研究價(jià)值及廣闊的應(yīng)用前景。 第 1 章 儀器與試劑 1.1 材料和試劑 多西紫杉醇；A549細(xì)胞（肺腫瘤細(xì)胞） M-231 （乳腺腫瘤細(xì)胞） hepg2（肝腫瘤細(xì)胞） PC3（前列腺腫瘤細(xì)胞） ；二甲基亞砜（DMSO）、胰蛋白酶、PBS,購自于索萊寶；完全RPMI1640 培養(yǎng)基、新

7、生牛血清(NBS)，購自于南京凱基生物技術(shù)有限公司；TUNEL細(xì)胞原位凋亡測定試劑盒、活性氧試劑盒及細(xì)胞周期檢測試劑盒（購自于南京凱基生物技術(shù)有限公司）、ELISA試劑盒、Western blot檢測試劑盒。其它試劑均為分析純。 1.2 儀器 二氧化碳孵箱（Thermo）；單人雙面超凈工作臺（SW-CJ）；倒置式生物顯微鏡（XDS-1B）；酶標(biāo)儀（Infinite f200）；流式細(xì)胞儀（FACSCalibur）；高速離心機(jī)（TGL-16G）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-600DB）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52A 上海亞榮生化儀器廠）、恒溫干燥箱（施都寶Bao-80A）、恒溫水浴鍋(HW.SY21

8、-K)、超低溫冰箱（thermo）。 第 2 章 實(shí)驗(yàn)方法 2.1細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞的培養(yǎng) A549細(xì)胞為人肺腺癌細(xì)胞，屬于傳代細(xì)胞系，可穩(wěn)定地傳代培養(yǎng)。一般用胰酶消化后，加入生長液稀釋，以1：2～1：3傳代培養(yǎng)都是可行的。 一、 [所需溶液] 1， 細(xì)胞沖洗液：磷酸鹽緩沖液(PBS)——無Ca、Mg 名稱 用量 NACL 8.00g KCL 0.20 KH2PO4 0.20 Na2HPO4 .。12H2O 1.15 加水至 1 000mL,將PH調(diào)至7.4，高壓滅菌。 2， 消化液 （1） 胰酶-PBS 名稱 用量 結(jié)晶胰酶 2.5g 高

9、壓滅菌后的PBS 1000ml 用磁力攪拌器攪拌均勻，使其完全溶解，通過0.22μm的濾膜過濾除菌，分裝備用，放置—20℃保存。 （2） 胰酶—EDTA: 名稱 用量 結(jié)晶胰酶 0.5g EDTA鹽溶液 0.2g 無Ca、Mg PBS 1000ml 用磁力攪拌器攪拌均勻，使其完全溶解，通過0.22μm的濾膜過濾除菌，分裝備用，放置—20℃保存。 3， 細(xì)胞培養(yǎng)液：RPMI 1640培養(yǎng)液 配制方法： （1） 將一袋干粉型RPMI 1640培養(yǎng)基溶于900ml三蒸水中，沖洗包裝袋兩至三次倒入培養(yǎng)液中。 （2） 加入丙酮酸鈉 0.1g，NaHCO2 2g以及雙抗，加

10、入磁力攪棒并置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?。雙抗的配置濃度為 100U/ML 青霉素和100U/ML鏈霉素。(一般市售的青霉素為80 萬 U/瓶，將其溶解于4ml三蒸水中，每升培養(yǎng)液中加入0.5ml；市售的鏈霉素為100 萬 U/瓶，將其溶解于5ml三蒸水中，每升培養(yǎng)液中加入0.5ml)。 （3） 調(diào)整培養(yǎng)液的ＰＨ值，用ＰＨ精密試紙觀察?。校龋?２～７.４即可。 （4） 過濾法除菌，所使用的濾器為Ｏ２加壓過濾，０.２２μｍ濾膜，濾膜事先采用高壓滅菌消毒。 （5） 分裝，加蓋瓶塞，加封紗布報(bào)紙，用繩固定，放置—20℃保存。 2.2 細(xì)胞的維持和培養(yǎng) 2.2.1 細(xì)胞的復(fù)蘇 （1）準(zhǔn)備37℃

11、恒溫水浴鍋，從液氮罐中取出存有Ａ５４９細(xì)胞的凍存管，迅速放于37℃溫水中，用鑷子夾住輕輕搖動(dòng)使其迅速融化。 （2） 800 r，10min離心。 （3）在無菌操作臺中采用75%的乙醇徹底擦拭凍存管，然后打開凍存管，注意動(dòng)作要輕柔。 （4）用1ml槍頭將上清液去除，加入1ml預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞吹散開，轉(zhuǎn)移至25cm2培養(yǎng)瓶中。 （5）補(bǔ)充4ml的RPMI 1640培養(yǎng)基，并且添加10%的胎牛血清。(培養(yǎng)基中含有牛血清則不用添加） （6 ）倒置顯微鏡下觀察，37℃、5%CO2培養(yǎng)。 （7）24h后，更換新的培養(yǎng)液。 （8）常規(guī)傳代培養(yǎng)。 2.2.2 A549細(xì)胞更換新的培養(yǎng)液

12、 （1）無菌操作打開培養(yǎng)瓶瓶蓋，倒掉培養(yǎng)液。 （2）用PBS反復(fù)沖洗細(xì)胞2～3遍。 （3）加入新鮮的預(yù)熱好的培養(yǎng)液及10%的胎牛血清。 各種液體需要量（ml） 表面積 25cm2 75cm2 150cm2 洗滌 3 5 10 胰酶 1～2 1～3 2～5 培養(yǎng)液 5 10 20 （１） 倒置顯微鏡下觀察，37℃、5%CO2培養(yǎng)。 2.2.3 A549細(xì)胞的傳代 無菌操作打開培養(yǎng)瓶瓶蓋，倒掉培養(yǎng)液。 向已經(jīng)長滿的細(xì)胞中加入消化液1ml，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有的細(xì)胞表面，吸棄或倒掉，輕輕沖洗細(xì)胞表面2～３遍，以盡可能去除原培

13、養(yǎng)液中的牛血清。 加入1ml消化液，在37℃培養(yǎng)箱中孵育5～８min后把培養(yǎng)瓶放置在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的胞質(zhì)回縮、胞間質(zhì)增大后，立即終止消化。 加入5ml預(yù)熱至37℃的培養(yǎng)液，用玻璃吸管反復(fù)吹打以分散細(xì)胞。吹打過程按順序進(jìn)行，從培養(yǎng)瓶底部一邊開始到另一邊結(jié)束，以確保所有的底部都被吹到。 吸取一半的細(xì)胞懸液，接種到新的25cm2培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)液，并且添加10%～20%的胎牛血清。通常每瓶液體量為5～10ml。 倒置顯微鏡下觀察，37℃、5%CO2培養(yǎng)。 2.3 分組給藥 在37℃，恒濕的5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)A549細(xì)胞，完全培養(yǎng)基為高糖DMEM培養(yǎng)基中含10%新生

14、小牛血清，加入100 μg/ml鏈霉素和100 μg/ml氨芐青霉素。細(xì)胞為上皮樣貼壁生長，每2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為五組：空白對照組、模型組、多西紫杉醇高、中、低劑量組。加藥前先將多西紫杉醇溶于DMSO中，再用完全培養(yǎng)基稀釋，使藥物終濃度為200 mg/L、100 mg/L、50mg/L，DMSO終體積為1‰，空白對照組及模型組加入含1‰DMSO完全培養(yǎng)基。藥物預(yù)處理4h后，24h后檢測各項(xiàng)指標(biāo)。 2.4 MTT溶液的配置與檢測 MTT全稱為3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromi

15、de，漢語化學(xué)名為 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)。是一種黃顏色的染料。又稱MTT比色法，是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)

16、濟(jì)。 2.4.1配制 稱取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4C避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。配制MTT時(shí)用用PBS溶解,也有人用生理鹽水配，60℃水浴助溶。 2.4.2 貼壁細(xì)胞 1、收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無

17、菌PBS填充）。 2.、5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個(gè)梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔. 3.、5%CO2，37℃孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。 4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。 5、終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。 6、每孔加入150ul二甲基亞砜，低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。

18、7、同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜） 第 3 章 實(shí)驗(yàn)計(jì)算以及結(jié)果 3.1 計(jì)算IC50 (1)改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4) Xm:lg 最大劑量 I:lg(最大劑量/相臨劑量) P:陽性反應(yīng)率之和 Pm:最大陽性反應(yīng)率 Pn:最小陽性反應(yīng)率 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 PC3人前列腺細(xì)胞 原料藥 脂質(zhì)體 N 10微克/毫升 1 0.1 0.01 lipo0.01微克/毫升 li

19、po0.1 lipo1 lipo10 0.72 0.224 0.267 0.357 0.374 0.381 0.433 0.334 0.231 0.598 0.251 0.268 0.352 0.387 0.58 0.338 0.272 0.223 0.538 0.231 0.286 0.327 0.346 0.521 0.383 0.274 0.243 0.547 0.302 0.267 0.305 0.381 0.41 0.426 0.31 0.271 0.523 0.316 0.292 0.304 0.

20、393 0.409 0.4 0.312 0.202 0.582 0.314 0.351 0.311 0.385 0.475 0.33 0.337 0.232 0.5846 0.273 02885 0.326 0.37766 0.462666667 0.385 0.3065 0.233666667 6667 6667 0.5330672 75 0.5065564 42 0.442417 332 0.3540 47891 0.208665906 0.3415051 31 0.47576 966

21、9 0.600342075 IC50=1.82微克/毫升 IC50=3.2微克/毫升 由于多西紫杉醇脂質(zhì)體的載藥量為10%，故脂質(zhì)體的IC50折合成原料藥的話，應(yīng)在現(xiàn)有IC50的基礎(chǔ)上*10%. 原料藥 脂質(zhì)體 0.01 0.1 1 10 lipo 10 lipo 1 lipo 0.1 lipo 0.01 0.921 0.794 0.608 0.598 0.607 0.588 0.618 0.63 0.602 0.765 0.644 0.649 0.566 0.

22、595 0.472 0.581 0.645 0.551 0.648 0.663 0.636 0.608 0.603 0.594 0.578 0.622 0.754 0.614 0.677 0.668 0.652 0.613 0.542 0.519 0.641 0.699 0.689 0.648 0.666 0.656 0.586 0.578 0.652 0.614 0.729 0.753 0.718 0.694 0.671 0.548 0.577 0.636 0.651 0.759 0.731666 667

23、0.690666667 0.6535 0.6251666 67 0.592 0.5585 0.597333333 0.63383333 3 0.682333333 0.05603644 6 0.1068 33713 0.14555 8087 0.19088838 3 0.23667426 0.183599089 0.133712 984 0.067425968 IC50=41.3微克/毫升 IC50=3.7微克/毫升 A549肺腫瘤細(xì)胞 結(jié)語 綜合全文內(nèi)容可總結(jié)出多西紫杉醇可能通

24、過兩種方式殺傷腫瘤細(xì)胞：（1）直接殺傷作用：多西紫杉醇通過靶細(xì)胞受體，或不同于TCR復(fù)合體的識別機(jī)構(gòu)，識別靶細(xì)胞。并與其結(jié)合，多西紫杉醇與靶細(xì)胞的結(jié)合。啟動(dòng)細(xì)胞溶解反應(yīng)，釋放一些細(xì)胞毒顆?；蛞蜃樱瑥亩芙獍屑?xì)胞；（2）間接殺傷作用：多西紫杉醇除自身直接溶解靶細(xì)胞外，還能分泌IL-2，腫瘤壞死因子(TNF)，r-干擾素(r-TFN)等多種細(xì)胞因子對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生間接殺傷作用，此類因子對腫瘤細(xì)胞均有直接的細(xì)胞毒活性或抑制作用。多西紫杉醇和LAK細(xì)胞一樣具有廣譜的非MHC限制的殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，但兩者的殺瘤譜有所不同。多西紫杉醇有比LAK細(xì)胞和TIL更強(qiáng)的擴(kuò)增及抗腫瘤能力，體外抗腫瘤能力比常規(guī)LAK

25、高6～20倍，對NK細(xì)胞敏感和LAK細(xì)胞敏感的腫瘤細(xì)胞，如K562。YAC-1，Raji，P805等均有不同程度的殺傷效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)表明多西紫杉醇的體內(nèi)抗腫瘤活性和體外平行，小鼠接種P815細(xì)胞后，腹腔注射5106個(gè)多西紫杉醇即可治愈全部動(dòng)物。而同樣量的LAK細(xì)胞對照組則動(dòng)物全部死亡。多西紫杉醇能夠有選擇地直接或間接殺傷腫瘤細(xì)胞，但對自體或異體轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞。對正常組織細(xì)胞沒有殺傷活性。因此就多西紫杉醇而言。對人體沒有毒副作用。多西紫杉醇可以調(diào)整人體的免疫狀態(tài)，能夠糾正患者的免疫功能。 參考文獻(xiàn) [1];吳玉榮 注射劑家兔體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)行為的比較[J];南京大學(xué);2011年03期

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