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1、蛋白質(zhì)工程的研究進(jìn)展與應(yīng)用摘要：蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，是參與生物生長，發(fā)育，代謝，繁殖的重要生物大分子。隨著生物化學(xué)及分子生物學(xué)的發(fā)展，蛋白質(zhì)工程被廣泛研究，通過物理，化學(xué)，分子生物學(xué)等手段對(duì)現(xiàn)有的蛋白質(zhì)進(jìn)行改造、修飾從而優(yōu)化其性質(zhì)，或合成自然界中不存在的具有新功能的蛋白質(zhì)，可更好地滿足人們的需要。蛋白質(zhì)工程技術(shù)已在藥物研發(fā)，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，并取得了顯著成效，本文綜述了蛋白質(zhì)工程的原理，方法，研究進(jìn)展及應(yīng)用，并展望其發(fā)展前景。旨在強(qiáng)調(diào)其在生物科學(xué)領(lǐng)域深遠(yuǎn)的研究意義及重要的應(yīng)用價(jià)值。關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)工程，分子生物學(xué)，定點(diǎn)突變，定向演化Research progress and ap
2、plication of protein engineeringAbstract: Protein is the main undertaker of life activities and an important biological macromolecule involved in biological growth, development, metabolism and reproduction. With the development of biochemistry and molecular biology, protein engineering has been wide
3、ly studied. It can better meet the needs of people through physical, chemical, molecular biology and other means to modify and modify the existing proteins to optimize their properties, or to synthesize proteins with new functions that do not exist in nature. Protein engineering technology has been
4、widely used in drug research and development, agricultural production and other fields, and achieved remarkable results. In this paper, the principle, method, research progress and application of protein engineering were reviewed, and its development prospect was prospected. The purpose was to empha
5、size its profound research significance and important application value in the field of biological science.Keywords: Protein engineering; molecular biology; site-directed mutation; directed evolution引言蛋白質(zhì)工程是以蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)與生物功能的關(guān)系為基礎(chǔ)，利用物理，化學(xué)及分子生物學(xué)等手段進(jìn)行基因修飾或基因合成，從而獲得經(jīng)改造后功能更加完善的蛋白質(zhì)，或自然中原本不存在的新功能的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程操作
6、基于基因工程技術(shù)，故被廣泛稱為第二代基因工程。該技術(shù)的發(fā)展依賴于基因組測(cè)序的順利進(jìn)展及對(duì)蛋白質(zhì)的化學(xué)組成、空間結(jié)構(gòu)及生物功能關(guān)系研究的理論突破。蛋白質(zhì)工程的基本研究策略是：在現(xiàn)有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能信息的基礎(chǔ)上，從預(yù)期蛋白質(zhì)的功能出發(fā)，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾，改造及分子設(shè)計(jì)，從而表達(dá)人類需要的功能蛋白質(zhì)分子，既實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)工程的目標(biāo)。1 蛋白質(zhì)工程原理蛋白質(zhì)工程技術(shù)的核心操作即為對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行改造，這種改造可以在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行，也可以在基因水平上進(jìn)行。在蛋白質(zhì)水平上對(duì)其進(jìn)行改造，涉及到了對(duì)蛋白質(zhì)分子的加工和修飾等操作，如：磷酸化，糖基化，泛素化等，需用到生物化學(xué)原理及方法，但由于該類修飾結(jié)果較為局限
7、，缺乏特異性，且反應(yīng)條件難以掌控等弊端，限制它的發(fā)展。而在基因水平對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行改造操作簡便，且針對(duì)性強(qiáng)，結(jié)果多樣，在現(xiàn)代其他分子生物學(xué)技術(shù)的輔助下，具有廣闊的發(fā)展前景。通過嚴(yán)格的分子設(shè)計(jì)，利用基因工程手段，將蛋白質(zhì)分子定向改造成為具有預(yù)期性能的蛋白質(zhì)，可分為兩類改造，一類是現(xiàn)有的天然蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，另一類是完全重新設(shè)計(jì)新的蛋白質(zhì)分子。改造天然白質(zhì)分子可以分為對(duì)少數(shù)幾個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行替換（小改），對(duì)蛋白質(zhì)分子的一小段多肽或結(jié)構(gòu)域進(jìn)行改造或替換即分子剪裁（中改），以及局部重建（大改），在蛋白質(zhì)工程研究及應(yīng)用中，“小改”及“中改”較為常見。而設(shè)計(jì)全新的蛋白質(zhì)分子，需要有完備的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)及功能
8、的數(shù)據(jù)庫，并且對(duì)它們有著十分全面的了解，該技術(shù)研究現(xiàn)在處于不成熟階段，通過深入的基礎(chǔ)研究，可有廣闊的發(fā)展空間。蛋白質(zhì)工程的主要技術(shù)科分為理性分子設(shè)計(jì)和非理性分子設(shè)計(jì)。理性分子設(shè)計(jì)主要是利用定點(diǎn)誘變技術(shù)，在已知DNA序列的特定位點(diǎn)改變核苷酸或核苷酸片段，從而有針對(duì)性的獲得預(yù)期特性的蛋白質(zhì)分子。非理性分子設(shè)計(jì)，又稱定向演化，這種方法通過人為制造進(jìn)化條件，體外改造目的基因，并進(jìn)行定向篩選，從而獲得預(yù)期性能的蛋白質(zhì)分子。2 蛋白質(zhì)工程技術(shù)分類2.1 定點(diǎn)突變技術(shù)定點(diǎn)突變（site-directed mutagenesis）技術(shù)是根據(jù)已知蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)和功能，利用分子生物學(xué)等手段，使特定位點(diǎn)的基因突變，
9、從而有針對(duì)性的改變分子的活性基團(tuán)，核苷酸及DNA片段，從而改造蛋白質(zhì)分子，使其獲得預(yù)期性質(zhì)與功能1-2。該技術(shù)為蛋白質(zhì)工程常用的操作手段，具有特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，及操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。在生物醫(yī)藥的開發(fā)以及工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)等領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用，其主要作用為調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)分子的活性，穩(wěn)定性；改善酶蛋白質(zhì)的催化能力，專一性，親和力及作用條件等，且定點(diǎn)突變是研究蛋白質(zhì)分子序列，結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系及作用機(jī)制的重要手段。其在生物醫(yī)療，藥物開發(fā)等領(lǐng)域的應(yīng)用實(shí)例有很多。L-天冬酰胺酶是治療急性粒細(xì)胞型白血病的靜脈注射或靜滴藥品，但其在臨床使用中常會(huì)引起過敏反應(yīng)，限制了它的廣泛應(yīng)用。吳梧桐3利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)該酶蛋白的結(jié)
10、構(gòu)分析并預(yù)測(cè)，確定了決定抗原表位的氨基酸序列，采用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)該區(qū)域進(jìn)行改造，并重組表達(dá)，獲得了免疫原性低且酶活性高的蛋白質(zhì)工程酶蛋白，完善了該類藥物的應(yīng)用。納豆激酶是一種具有溶解纖維蛋白活性的絲氨酸蛋白酶，其被廣泛用于治療心血管疾病類藥物的開發(fā)，但其在應(yīng)用中存在極易被氧化，且穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，Weng4等，在對(duì)該酶序列及結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)上，對(duì)其進(jìn)行定點(diǎn)突變，使納豆激酶中原本暴露的222位蛋氨酸殘基變?yōu)殡[蔽的構(gòu)像，從而提高酶的抗氧化活性，有利于應(yīng)用中藥物的穩(wěn)定效用。利用定點(diǎn)突變對(duì)蛋白質(zhì)序列，結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)研究，也有許多成功的例子，亮氨酸氨肽酶（LAP）是一種肽鏈端解酶，其作用于肽鏈可使氨基末端
11、氨基酸逐個(gè)游離，廣泛用于醫(yī)藥及食品等領(lǐng)域中，Chi5等，通過計(jì)算機(jī)模擬以及定點(diǎn)突變等技術(shù)，成功分析出了Ala348和Gly350這兩個(gè)緊靠協(xié)調(diào)配體的氨基酸殘基，是該酶維持其催化活性所必須的結(jié)構(gòu)，此外，通過定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)該酶的催化機(jī)制也有所解析。定點(diǎn)突變技術(shù)在使用過程中逐步優(yōu)化創(chuàng)新，以提高其效率及準(zhǔn)確性，Carapito6等發(fā)明了一種包含六個(gè)廣泛適用自動(dòng)液態(tài)處理系統(tǒng)環(huán)節(jié)的方法，該方法可自動(dòng)快捷且高通量地實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)突變，蛋白質(zhì)純化及鑒定等流程，可快速高效地獲得目的產(chǎn)物，使蛋白質(zhì)工程技術(shù)獲得了新的突破。定點(diǎn)突變技術(shù)的應(yīng)用雖然取得了一些成功，但由于其應(yīng)用需對(duì)蛋白質(zhì)序列及結(jié)構(gòu)有詳細(xì)的了解，且對(duì)于一般蛋白質(zhì)
12、僅改變一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，很難使其三維高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，從而蛋白質(zhì)功能也不會(huì)發(fā)生很大改變7-8，導(dǎo)致定點(diǎn)突變技術(shù)發(fā)展受限，所以在定點(diǎn)突變技術(shù)的基礎(chǔ)上通過對(duì)其本身的操作及方法進(jìn)行優(yōu)化，并與其他技術(shù)聯(lián)合使用，可提升它的利用價(jià)值及應(yīng)用效率，使其得到更好的發(fā)展。2.2 定向演化技術(shù)定向演化又稱非理性蛋白質(zhì)進(jìn)化，體外分子定向進(jìn)化。這種技術(shù)利用進(jìn)化的原理，在實(shí)驗(yàn)室中模擬自然進(jìn)化（隨機(jī)突變，DNA重組，自然選擇等）的條件，通過分子生物學(xué)技術(shù)（易錯(cuò)PCR，DNA改組等）對(duì)待改造蛋白的基因進(jìn)行誘變處理，增加其多樣性，并結(jié)合高通量篩選及壓力選擇等方法，定向篩選出性質(zhì)及功能符合需求的蛋白質(zhì)，經(jīng)過多輪選擇，即可獲得
13、具預(yù)期特征的新型蛋白質(zhì)。與定向誘變技術(shù)相比該方法不需要已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，功能位點(diǎn)及工作機(jī)理等特征，且可獲得的蛋白質(zhì)類型多樣，是一種很有發(fā)展前景的蛋白質(zhì)工程技術(shù)。該技術(shù)主要用于優(yōu)化蛋白質(zhì)的性質(zhì)，如提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，提高酶的催化活性，改變酶的作用底物及作用環(huán)境等，此外定向演化技術(shù)還可以為蛋白質(zhì)演化的研究提供寶貴的數(shù)據(jù)。2018年，F(xiàn)rances Arnoldy因在蛋白質(zhì)定向演化領(lǐng)域做出了杰出貢獻(xiàn)而獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，Arnold研究組成功的通過易錯(cuò)PCR誘變并篩選獲得了改造的枯草桿菌蛋白酶，使其可在高濃度的DMF環(huán)境中有效地發(fā)揮催化作用9，從而高效地合成某些高分子化合物，在工業(yè)上產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)
14、值。該團(tuán)隊(duì)還獲得了逆轉(zhuǎn)底物對(duì)映體選擇的海因酶，該酶可以L-對(duì)映體（L-5-（2-甲硫基乙基）-海因（L-MTEH)為底物合成L-甲硫氨酸10，在工業(yè)上具有重要的意義，該成果的取得，是利用了定向演化與定向誘變結(jié)合的技術(shù)，通過易錯(cuò)PCR對(duì)相關(guān)功能位點(diǎn)進(jìn)行粗篩，獲得關(guān)鍵序列后，再以飽和突變的方式定向的獲得目的蛋白，為開創(chuàng)性的研究思路，在該領(lǐng)域的其他研究具有啟發(fā)作用。此外，Arnold研究組通過DNA改組技術(shù)改造了類胡蘿卜素合成通路上的酶，從而獲得了新型的類胡蘿卜素，并首次鑒定出了能直接通過環(huán)化3，4-脫氫番茄紅素合成紅酵母烯的酶11，該研究對(duì)腫瘤及慢性病的治療具有深遠(yuǎn)意義。定向演化的主要技術(shù)有兩種，
15、它們有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，在蛋白質(zhì)工程的研究中具不同的適應(yīng)情況。2.2.1 易錯(cuò)PCR易錯(cuò)PCR是利用PCR反應(yīng)中所用到的Taq酶不具有3-5的外切酶活性，即無糾錯(cuò)活性，從而通過制造適當(dāng)?shù)臈l件，使DNA在擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)堿基錯(cuò)配，導(dǎo)致基因突變。該反應(yīng)通過改變PCR反應(yīng)的原條件如改變四種dNTP的比例，用dITP替代dNTP，及在反應(yīng)體系中增加鎂離子濃度，加入錳離子等，使PCR反應(yīng)以較低的比率引入隨機(jī)突變，再經(jīng)過篩選，并進(jìn)行連續(xù)易錯(cuò)PCR，可獲得有益突變積累的目的蛋白質(zhì)12-14。應(yīng)用易錯(cuò)PCR成功獲得性能良好的蛋白質(zhì)的例子有很多，如對(duì)D-氨基酸工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義的耐熱突變酶N-氨甲?；?D-氨基酸氨基
16、水解酶（DCase），D-氨基酸為許多抗生素，多肽類激素的合成原料，工業(yè)上常用DCase合成，而該酶由于熱穩(wěn)定性差，需經(jīng)多次固定化酶的作用才能穩(wěn)定生效，因而增加了其生產(chǎn)成本并破壞了其產(chǎn)品質(zhì)量。Yu15等通過易錯(cuò)PCR技術(shù)誘變?cè)撁富?，并?jīng)過篩選獲得耐熱性提高了7的DCase突變體，該蛋白質(zhì)工程酶的獲得可為D-氨基酸的合成節(jié)省很大的成本。此外，有研究組利用易錯(cuò)PCR鑒定出了新的抗原決定簇，為相應(yīng)蛋白類疫苗的開發(fā)提供了新的參考，Tsai16等，通過易錯(cuò)PCR獲得突變文庫并結(jié)合負(fù)性篩選方法，鑒定出了蟑螂變應(yīng)原Per al抗原決定簇，該抗原決定簇的獲得方式較為創(chuàng)新，對(duì)免疫學(xué)的發(fā)展具有一定價(jià)值。2.2.
17、2 DNA改組DNA改組（DNA shuffling)也稱有性PCR，該技術(shù)主要操作為，將一組同源但有差異的蛋白質(zhì)編碼基因，利用脫氧核糖核酸酶（DNAase ）或超聲波技術(shù)隨機(jī)斷裂成DNA小片段，通過小片段之間隨機(jī)出現(xiàn)的重疊，使這些片段在無外加引物的條件下PCR擴(kuò)增，由于擴(kuò)增模板隨機(jī)，幾輪PCR過后便獲得具有不同系譜間基因重組的DNA片段，最終組裝成完整的DNA序列，從而通過模擬自然演化獲得重組的DNA分子17-18。該技術(shù)改善了其他方法隨機(jī)性較大的弊端，將相關(guān)性片段的有益突變重組，廣泛用于蛋白質(zhì)性質(zhì)的優(yōu)化及酶特性的改良19，通過該技術(shù)已成功優(yōu)化了-葡萄糖苷酶，-內(nèi)酰胺酶，脂肪酶，綠色熒光蛋白
18、等，并在應(yīng)用中獲得了顯著成效。在免疫學(xué)領(lǐng)域，Locher20等，采用了DNA改組的方法對(duì)腦炎-病毒，HIV-1，登革熱病毒，惡性瘧原蟲，乙型肝炎病毒的不同血清性的編碼抗原決定簇的基因進(jìn)行重組，從而獲得了新型嵌合體疫苗，該疫苗具有交叉保護(hù)性，相比于針對(duì)特定血清型的疫苗具有更大的實(shí)用潛力。該技術(shù)在實(shí)踐中不斷發(fā)展，又衍生出了外顯子改組技術(shù)（exon shuffling），家族改組技術(shù)（family shuffling），交錯(cuò)延伸重組法21（staggered extension process,StEP），RPR法22（Random-Priming Recombination DNA Shuffli
19、ng）,過渡模板隨機(jī)嵌合技術(shù)（random chimeragenesis on transient templates，ACHITT），基因組改組技術(shù)23（whole-Genome shuffling），以及體外異源雜交和體內(nèi)修復(fù)24，非同源重組（Nonhomologous Recombination）技術(shù)等，這些技術(shù)不同程度的優(yōu)化了DNA改組技術(shù)，且有不同的適用范圍及條件，這些技術(shù)的革新也使蛋白質(zhì)工程獲得了巨大的發(fā)展。3 轉(zhuǎn)運(yùn)RNA介導(dǎo)蛋白質(zhì)工程轉(zhuǎn)運(yùn)RNA介導(dǎo)的蛋白質(zhì)工程（tRNA-mediated protein engineering），也稱為定點(diǎn)非氨基酸替代法（site-directe
20、d non-natural amino acid replacement,SNAAR），該技術(shù)痛過生物化學(xué)等方法把轉(zhuǎn)運(yùn)RNA攜帶的天然氨基酸換為人工設(shè)計(jì)或改造的非天然氨基酸，并在特定位點(diǎn)摻入，選擇性的對(duì)目的蛋白的編碼基因改良，隨后合成非天然蛋白質(zhì)25。目前利用轉(zhuǎn)運(yùn)RNA介導(dǎo)，已實(shí)現(xiàn)將幾十種非天然氨基酸摻入到蛋白質(zhì)中，并在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的探究，鑒別等方面有一定應(yīng)用，具有很大的發(fā)展?jié)摿?6。4 總結(jié)與展望蛋白質(zhì)工程作為多學(xué)科融合的研究領(lǐng)域，越來越廣泛的被科研人員所關(guān)注，已在基礎(chǔ)研究，技術(shù)革新，應(yīng)用實(shí)踐等取得了較大的突破。蛋白質(zhì)工程結(jié)合了多種新興的技術(shù)，改變目的蛋白質(zhì)的特性，具有理性，高效性，經(jīng)濟(jì)
21、性，創(chuàng)新性等優(yōu)點(diǎn)，具有深遠(yuǎn)的研究價(jià)值。蛋白質(zhì)工程已廣泛應(yīng)用于生物藥物研發(fā)，工業(yè)酶制劑優(yōu)化等領(lǐng)域。未來蛋白質(zhì)工程的發(fā)展方向會(huì)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的精細(xì)研究，以及蛋白質(zhì)改造技術(shù)的優(yōu)化升級(jí)等方面，創(chuàng)造出新結(jié)構(gòu)，新功能，新特性的蛋白質(zhì)，為生命科學(xué)領(lǐng)域提供新的發(fā)展動(dòng)力與創(chuàng)新機(jī)遇。參考文獻(xiàn)1 張新國，陳文潔，曾艷龍 等.蛋白質(zhì)工程技術(shù)及其在生物藥物研發(fā)中的應(yīng)用 A.藥學(xué)進(jìn)展，2011,12-0529-08.2 潘淑媛.生物藥物研發(fā)應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)的分析 A.生物技術(shù)世界，2015,10-0019-01.3 吳梧桐.蛋白質(zhì)工程技術(shù)與新型生物催化劑設(shè)計(jì)J.藥物生物技術(shù)，2004,11（1）：1-6.4 Wen
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蛋白質(zhì)與酶工程分析研究生物技術(shù)專業(yè)
