生物化學(xué)：第三十四章 DNA復(fù)制

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1、第三十四章第三十四章 DNADNA復(fù)制復(fù)制Watson & Crick:Watson & Crick: 一種遺傳物質(zhì)，必須能行使兩種 功能，即自我復(fù)制和對細胞的高 度特異性的影響遺傳物質(zhì)的基本屬性遺傳物質(zhì)的基本屬性：基因的自我復(fù)制基因的自我復(fù)制 基因的突變基因的突變 控制性狀的表達控制性狀的表達DNA復(fù)制復(fù)制 親代雙鏈親代雙鏈DNADNA分子在分子在DNADNA聚合酶的作用下，分聚合酶的作用下，分別以每條單鏈別以每條單鏈 DNADNA分子為模板，聚合與自身堿基分子為模板，聚合與自身堿基可以互補配對的游離的可以互補配對的游離的dNTPdNTP, , 合成出兩條與親代合成出兩條與親代DNADNA分

2、子完全相同的子代分子完全相同的子代DNADNA分子的過程。分子的過程。 DNA復(fù)制的一般特征復(fù)制的一般特征 以原來的DNA兩條鏈作為模板，四種dNTP為前體，還需要Mg2 作為模板的DNA需要解鏈 半保留復(fù)制 需要引物主要是RNA，少數(shù)是蛋白質(zhì) 復(fù)制的方向始終是53 具有固定的起點 多為雙向復(fù)制，少數(shù)為單向復(fù)制 半不連續(xù)性 具有高度的忠實性和進行性 一、一、DNADNA的半保留復(fù)制的半保留復(fù)制 ( semiconservative replication ) DNA復(fù)制可能的三種方式復(fù)制可能的三種方式由Meselson和Stahl設(shè)計證明半保留復(fù)制的實驗的被譽為生物學(xué)最美麗的實驗Testing

3、 Models for DNA replicationMeselson 和Stahl的證明DNA半保留復(fù)制的實驗流程（1958） Meselson 和和Stahl的實驗結(jié)果的實驗結(jié)果MeselsonMeselson與與StalhStalh在在4242年以后在年以后在最初他們相最初他們相遇的一顆樹遇的一顆樹下重逢時的下重逢時的合影合影Matthew Meselson and Franklin Stahl more recentlyFaculty member at HarvardMechanisms of Molecular EvolutionFaculty member at U. of Or

4、egonMeiotic RecombinationTaylor以蠶豆根尖細胞為材料、使用放射性同位以蠶豆根尖細胞為材料、使用放射性同位素證明真核細胞素證明真核細胞DNA也是半保留復(fù)制也是半保留復(fù)制的實驗。的實驗。二、復(fù)制起點與方向二、復(fù)制起點與方向（origin & direction ） DNA鏈延伸的方向：鏈延伸的方向：從從53證明證明DNA復(fù)制的方向始終是復(fù)制的方向始終是53的末端終止實驗的末端終止實驗 實驗證明實驗證明 復(fù)制從復(fù)制從DNA分子的特定位置開始。分子的特定位置開始。 復(fù)制起點（復(fù)制原點）復(fù)制起點（復(fù)制原點） Origin, O - DNA分子上開始復(fù)制的特定位置。分子上開始

5、復(fù)制的特定位置。 復(fù)制子復(fù)制子Replicon - 能夠獨立進行復(fù)制的基因組單位。能夠獨立進行復(fù)制的基因組單位。 A unit of the genome in which DNA contain a region from origin to terminator 一個復(fù)制子只含有一個復(fù)制起點一個復(fù)制子只含有一個復(fù)制起點。DNA復(fù)制起始區(qū)的特征復(fù)制起始區(qū)的特征DNA復(fù)制起始區(qū)的特征復(fù)制起始區(qū)的特征 由多個短的重復(fù)序列組成； 能夠被多亞基的復(fù)制起始區(qū)結(jié)合蛋白識別； 通常富含AT堿基對，這有利于DNA復(fù)制起動時的解鏈，因為AT堿基對含有的氫鍵數(shù)目低于GC堿基對。 “呼吸呼吸現(xiàn)象現(xiàn)象” ” DNA

6、復(fù)制原點處氫鍵迅速斷裂與再生，復(fù)制原點處氫鍵迅速斷裂與再生， 導(dǎo)致兩條導(dǎo)致兩條DNA鏈鏈不斷解鏈與聚合，不斷解鏈與聚合， 形成瞬間的單泡狀結(jié)構(gòu)的過程。形成瞬間的單泡狀結(jié)構(gòu)的過程。 在富含在富含AT的區(qū)域內(nèi)尤為明顯的區(qū)域內(nèi)尤為明顯單單起點、起點、單單向向多多起點、起點、單單向向單單起點、起點、雙雙向向多多起點、起點、雙雙向向 原核生物（染色體、質(zhì)粒）、真核生物細胞器：原核生物（染色體、質(zhì)粒）、真核生物細胞器： 雙鏈環(huán)狀雙鏈環(huán)狀DNA，雙向為主、對稱為主雙向為主、對稱為主 真核生物染色體：真核生物染色體： 雙鏈線狀雙鏈線狀DNA，雙向?qū)ΨQ雙向?qū)ΨQ 電鏡下真核生物電鏡下真核生物DNA的多個復(fù)制叉結(jié)構(gòu)

7、的多個復(fù)制叉結(jié)構(gòu)復(fù)制叉的結(jié)構(gòu)復(fù)制叉的結(jié)構(gòu)當(dāng)當(dāng)DNADNA復(fù)制復(fù)制從起始區(qū)起從起始區(qū)起動的時候，動的時候，起始區(qū)的起始區(qū)的DNADNA雙鏈因雙鏈因發(fā)生解鏈而發(fā)生解鏈而形成叉狀結(jié)形成叉狀結(jié)構(gòu)，這樣的構(gòu)，這樣的結(jié)構(gòu)被稱為結(jié)構(gòu)被稱為復(fù)制叉復(fù)制叉 真核生物真核生物DNA復(fù)制子復(fù)制子復(fù)制開始時，將大腸桿菌放在含低劑量的3H-dT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾分鐘；隨后，將細菌轉(zhuǎn)移到含高劑量的3H-dT的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)一段時間；最后，收集細胞，小心地裂解以抽取其中的染色體DNA進行放射自顯影。如果是單向復(fù)制，自顯影圖譜上銀顆粒的密度應(yīng)該是一端高、一端低；如果是雙向復(fù)制，則應(yīng)該中間是一段低密度的銀顆粒，兩側(cè)是高密度的銀顆

8、粒。低密度銀顆粒意味著這一段DNA屬于復(fù)制起始區(qū)，高密度顆粒代表的是后來合成的。Grow cells for several generationsSmall amounts of 3H thymidineare incorporated into new DNAGrow for brief period of timeAdd a high concentration of 3H- thymidinein media with lowconcentration of 3H- thymidineBacterial culture*T*T*T*TDense label at the replica

9、tion forkwhere new DNA is being made*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*TAll DNA is lightlylabeled with radioactivity*T*T*TCairns then isolated the chromosomes by lysing the cells very very gently and placed them on an electron micrograph (EM) grid which he exposed to X-ray film for

10、 two months.實驗證明實驗證明Cairns證明大腸桿菌證明大腸桿菌DNA雙向復(fù)制的實驗雙向復(fù)制的實驗三、三、DNADNA的的半不連續(xù)復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制 （semi-discontinuous replicationsemi-discontinuous replication） 5353Direction ofunwindingContinuous replication53PrimerPrimer53Primer53Discontinuous replicationDNA replication is semi-discontinuous先導(dǎo)鏈先導(dǎo)鏈后隨鏈后隨鏈How to prove

11、 it ?DNA 的半不連續(xù)復(fù)制：的半不連續(xù)復(fù)制：semi-discontinuousOkazakis (1968)；Reiji Okazaki was born near Hiroshima, Japan, in 1930. He was a teenager there at the time of the explosion of the first of two nuclear bombs that the US dropped at the end of World War II. His scientific career was cut short by his untimely

12、 death from cancer in 1975 at the age of 44, perhaps related to his exposure to the fallout of that blast.a. If the replication of DNA is semidiscontinuous, one ought to be able to label and catch these short pieces before they are ligated together by pulses of labeling. b. If the enzyme (DNA ligase

13、) is absent, these short pieces of DNA ought to be detectable even after relatively long time of pulses. Evidence for Semi-Discontinuous Replication(pulse-chase experiment) Bacteria arereplicatingBacterial cultureAdd 3H ThymidineFor a SHORT time(i.e. seconds)Flood with non-radioactive TAllow replica

14、tionTo continue Harvest the bacteriaat different timesafter the chaseIsolate their DNASeparate the strands(using alkali conditions)Run on a sizing gradientRadioactivity will onlybe in the DNA that was made during the pulsesmallestlargestResults of pulse-chase experiment Pulse5353Direction ofunwindin

15、g35PrimerPrimer53Primer53*ChaseLigase mutant DNA semi-discontinuous replicationDNA semi-discontinuous replication leading strand , lagging strand 均有均有 dUMPdUMP 的摻入的摻入 Okazaki Okazaki 片段在某種意義上為片段在某種意義上為 dUMPdUMP 片段片段 先導(dǎo)鏈按先導(dǎo)鏈按 dUMPdUMP 片段連續(xù)復(fù)制片段連續(xù)復(fù)制后隨鏈按后隨鏈按Okazaki 片段不連續(xù)復(fù)制片段不連續(xù)復(fù)制( Prok. 1-2kb, Euk. 0.1-

16、0.2kb )岡崎片段的連接岡崎片段的連接 DNA pol I DNA ligase脈沖標(biāo)記目的在于即時標(biāo)記在特定時段內(nèi)合成的DNA。脈沖追蹤目的則是要弄清那些被標(biāo)記上的DNA片段后來的去向。 Okazaki的脈沖標(biāo)記和脈沖追蹤的實驗的脈沖標(biāo)記和脈沖追蹤的實驗Okazaki的脈沖標(biāo)記和脈沖追蹤的實驗結(jié)果分析的脈沖標(biāo)記和脈沖追蹤的實驗結(jié)果分析在復(fù)制叉中不連續(xù)合成的DNA片段稱為岡崎片段，連續(xù)合成的DNA子鏈被稱為前導(dǎo)鏈，不連續(xù)合成的DNA子鏈被稱為后隨鏈或滯后鏈。 J. Huberman and A. Tsai performed the same kind of experiment in a

17、 eukaryote: the fruit fly Drosophila melanogaster.復(fù)制的特殊方式復(fù)制的特殊方式 質(zhì)粒質(zhì)粒ColE1：完全單向；：完全單向； 噬菌體噬菌體x174：滾環(huán)復(fù)制；：滾環(huán)復(fù)制；某些噬菌體（如M13和X174）DNA和一些小的質(zhì)粒（如枯草桿菌內(nèi)的pIM13質(zhì)粒）在宿主細胞內(nèi)通過滾環(huán)復(fù)制方式擴增DNA。 真核細胞的某些基因，如某些兩棲動物卵母細胞內(nèi)的rRNA基因和哺乳動物細胞內(nèi)的二氫葉酸還原酶基因，在特定的情況下會通過滾環(huán)復(fù)制在較短的時間內(nèi)迅速增加目標(biāo)基因的拷貝數(shù)。 cycling amplificationcycling amplification533

18、3Some phages (e.g.,):滾環(huán)復(fù)制滾環(huán)復(fù)制 D-環(huán)復(fù)制環(huán)復(fù)制線粒體和葉綠體DNA通常以D-環(huán)的方式進行復(fù)制。少數(shù)病毒，如腺病毒，也進行D-環(huán)復(fù)制 。催化線粒體DNA復(fù)制的酶是DNA聚合酶，兩條鏈的合成都需要先合成RNA引物，但都不形成岡崎片段，因此都是連續(xù)合成。 兩條子鏈的合成在時間上的不同步。 線粒體線粒體DNA；D-環(huán)復(fù)制環(huán)復(fù)制 In In mitmit. DNA . DNA also in chl. DNA also in chl. DNA D D環(huán)復(fù)制環(huán)復(fù)制 四、復(fù)制的速度與時間四、復(fù)制的速度與時間 （speed & time） 原核生物：原核生物：5X104bp/mi

19、n E.coli 5X106bp, 雙向等速，單復(fù)制子雙向等速，單復(fù)制子 一般情況需一般情況需40mins, 豐富培養(yǎng)基中形成多復(fù)制叉，豐富培養(yǎng)基中形成多復(fù)制叉，20mins 真核生物：真核生物：2000bp/min human 3X109bp, 雙向、多復(fù)制子雙向、多復(fù)制子 需需6-8hrsDNA復(fù)制的速度復(fù)制的速度 染色體染色體DNA：S期期 細胞器細胞器DNA：整個細胞周期整個細胞周期 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA：隨染色體復(fù)制或單獨復(fù)制隨染色體復(fù)制或單獨復(fù)制 病毒病毒DNA：立即復(fù)制或整合到宿主染色體中立即復(fù)制或整合到宿主染色體中DNA復(fù)制的時間復(fù)制的時間DNA replication at pha

20、se S of cell cycleDNA replication at phase S of cell cycle E.coli 37 0.5 h105 bp/min S 6-8hs M 1hG23-4hsmammalian cell 22-25hrs 2000 bp/min G112hs五、五、與與DNADNA復(fù)制有關(guān)的酶、蛋白質(zhì)復(fù)制有關(guān)的酶、蛋白質(zhì) （enzymes & proteins ） DNA聚合酶 DNA解鏈酶 單鏈結(jié)合蛋白 DNA引發(fā)酶 DNA拓撲異構(gòu)酶 DNA連接酶 端聚酶（真核生物特有） DNA聚合酶的全名是依賴于DNA的DNA聚合酶，就是以DNA為模板，催化DNA合成的聚

21、合酶。 DNA聚合酶是參與DNA復(fù)制的主要酶，該酶的許多性質(zhì)直接決定了DNA復(fù)制的一些基本特征。 反應(yīng)通式：i1n/DNADNAnPP)dNTP(dNMP-OdNTP)OH-引物（引物鎂離子模板聚合酶， 原核生物DNA 聚合酶 DNA pol I,II,III,IV和V 真核生物DNA 聚合酶 DNA pol ,和以及更多隨后的隨后的 PPiPPi迅速水解驅(qū)動反應(yīng)的進行迅速水解驅(qū)動反應(yīng)的進行模板；模板；引物；引物；dNTP；合成方向；合成方向；反應(yīng)可逆；反應(yīng)可逆；Mg2+；大腸桿菌細胞蛋白質(zhì)提取物大腸桿菌細胞蛋白質(zhì)提取物+DNA模板模板有無有無DNA合成合成?- dNTPs- Mg2+ (輔助

22、因子輔助因子)- ATP (能源能源)- 游離的游離的3OH端端 (引物引物)體外測定體外測定DNA復(fù)制復(fù)制純化得到純化得到DNA聚合酶聚合酶I 目前是目前是Standford大大 學(xué)醫(yī)學(xué)院的終身教授學(xué)醫(yī)學(xué)院的終身教授不可思議!l53外切核酸酶l 35外切核酸酶l 53DNA聚合酶DNA聚合酶聚合酶I一條單一肽鏈至少具有三種不同的酶活性！一條單一肽鏈至少具有三種不同的酶活性！DNA聚合酶折疊成幾個不同的結(jié)構(gòu)域聚合酶折疊成幾個不同的結(jié)構(gòu)域Klenow fragmentKlenow fragment 具有校對作用具有校對作用Proofreading functionKlenowKlenow酶的晶體

23、結(jié)構(gòu)模型酶的晶體結(jié)構(gòu)模型 stalling transient melting exonuclease site occupancyDNADNA聚合酶的聚合和校對聚合酶的聚合和校對 切口（缺刻）平移切口（缺刻）平移nick translation* gap fill-inDNA聚合酶I所具有的53聚合酶和53外切酶活性的聯(lián)合使用可導(dǎo)致一個具有切口的DNA分子發(fā)生切口平移。如果在切口平移反應(yīng)中加入放射性標(biāo)記的dNTP，則放射性標(biāo)記的核苷酸會參入到重新合成的DNA鏈上，從而使DNA的一條鏈帶上同位素標(biāo)記。 其結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜!DNADNA聚合酶聚合酶IIIIII全酶的滑動鉗夾住雙螺旋全酶的滑動鉗夾住雙

24、螺旋DNADNA DNA聚合酶聚合酶I、II和和III的性質(zhì)和功能的性質(zhì)和功能性質(zhì)DNA聚合酶IDNA聚合酶IIDNA聚合酶III結(jié)構(gòu)基因polApolBpolC分子量（kDa）10390130分子數(shù)/細胞40010010Vmax(參入的nt/秒)16202525010003-外切酶活性5-外切酶活性進行性（nt）320010 000500 000突變體表現(xiàn)型UV敏感、硫酸二甲酯敏感無DNA復(fù)制溫度敏感型生物功能DNA修復(fù)、RNA引物切除DNA修復(fù)染色體DNA復(fù)制其它的其它的DNA pol DNA pol IV 和和DNA pol V 1999年發(fā)現(xiàn)；年發(fā)現(xiàn)； 在在DNA errorprone

25、 repair中起作用；中起作用；已在真核細胞中發(fā)現(xiàn)至少15種以上的DNA聚合酶，除了5種發(fā)現(xiàn)較早的DNA聚合酶、和以外，其它幾種DNA聚合酶如聚合酶、和都有相關(guān)的報道，這些新發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶一般缺乏3-外切酶的活性（除外），因此沒有校對的功能，它們主要參與DNA的跨越合成，以克服損傷對DNA復(fù)制的不利影響。 真核生物真核生物DNA pol DNA pol : 引物合成引物合成 DNA pol : DNA repair DNA pol : 線粒體線粒體 DNA合成合成 DNA pol : DNA pol III DNA pol : DNA pol I真核細胞真核細胞DNA聚合酶聚合酶、和和的

26、性質(zhì)和功能的性質(zhì)和功能性質(zhì)DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶亞細胞定位細胞核細胞核線粒體基質(zhì)細胞核細胞核引發(fā)酶活性有無無無無亞基數(shù)目41424催化亞基的相對分子質(zhì)量（kDa）16018540125125210230或125140對dNTPs的Km值(M)251040.524內(nèi)在的進行性中等低高低高在PCNA存在時的進行性中等低高高高3-外切酶活性5-外切酶活性對3,5-ddNTP的敏感性低高高低中等對阿拉伯糖CTP的敏感性高低低高高對四環(huán)雙萜的敏感性高低低高高生物功能細胞核DNA復(fù)制細胞核DNA修復(fù)線粒體DNA復(fù)制細胞核DNA復(fù)制細胞核DNA復(fù)制和修復(fù)真核細胞真核細胞

27、DNADNA聚合酶聚合酶 真核真核DNADNA聚合酶聚合酶 和和 在跨損傷合成中的作用在跨損傷合成中的作用 真核細胞真核細胞DNADNA聚合酶聚合酶 由由PCNAPCNA三個亞基構(gòu)成的滑動鉗結(jié)構(gòu)三個亞基構(gòu)成的滑動鉗結(jié)構(gòu) DNA解鏈酶是一類催化DNA雙螺旋解鏈的酶。它幾乎參與和DNA有關(guān)的一切代謝過程，包括DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)和重組。 任何一種DNA解鏈酶都能夠結(jié)合DNA，這種結(jié)合與DNA序列無關(guān)，這是解鏈酶作用的前提。大多數(shù)解鏈酶優(yōu)先結(jié)合DNA的單鏈區(qū)域，少數(shù)解鏈酶，優(yōu)先結(jié)合DNA的雙鏈。 解鏈酶除了能夠結(jié)合DNA以外，還能夠結(jié)合NTP，并同時具有內(nèi)在的依賴于DNA的NTP酶活性。 所有的D

28、NA解鏈酶都具有移位酶活性。其移位酶活性使得它沿著被結(jié)合的DNA鏈單向移動，以不斷地解開DNA雙鏈區(qū)域。 大腸桿菌大腸桿菌DnaBDnaB蛋白的解鏈酶活性蛋白的解鏈酶活性 是一種專門與DNA單鏈區(qū)域結(jié)合的蛋白質(zhì)，為DNA復(fù)制、修復(fù)和重組所必需的成分。SSB本身并沒有任何酶的活性，但通過與DNA單鏈區(qū)段的結(jié)合在DNA復(fù)制、修復(fù)和重組中發(fā)揮以下幾個方面的作用：（1）暫時維持DNA的單鏈狀態(tài)，防止互補的單鏈在作為復(fù)制模板之前重新退火成雙螺旋；（2）防止DNA的單鏈區(qū)域自發(fā)形成鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)（如鏈內(nèi)雙螺旋），以消除它們對DNA聚合酶進行性的影響；（3）包被DNA的單鏈區(qū)段，防止核酸酶對DNA單鏈區(qū)域的水

29、解；（4）刺激某些酶的活性。 大腸桿菌單鏈結(jié)合蛋白與單鏈大腸桿菌單鏈結(jié)合蛋白與單鏈DNADNA結(jié)合的協(xié)同效應(yīng)結(jié)合的協(xié)同效應(yīng) 拓撲異構(gòu)酶是一類通過催化DNA鏈的斷裂、旋轉(zhuǎn)和重新連接而直接改變DNA拓撲學(xué)性質(zhì)的酶。此類酶不僅可以解決在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組和染色質(zhì)重塑過程中遇到的拓撲學(xué)障礙，而且能夠細調(diào)細胞內(nèi)DNA的超螺旋程度，以促進DNA與蛋白質(zhì)的相互作用，同時防止DNA形成有害的過度超螺旋。 按照DNA鏈的斷裂方式，拓撲異構(gòu)酶被分為I型和II型。I型在作用過程中，只能切開DNA的一條鏈，而II型均為寡聚體蛋白，在作用過程中同時交錯切開DNA的兩條鏈，并能在消耗ATP的同時將一個DNA雙螺旋從一

30、個位置經(jīng)過另一個雙螺旋的裂口“主動運輸”到另外一個位置。 II型拓撲異構(gòu)酶主要參與DNA復(fù)制，既可以在DNA分子中引入有利于復(fù)制的負超螺旋，又可以及時清除復(fù)制叉前進中形成的正超螺旋，還能分開復(fù)制結(jié)束后纏繞在一起的兩個子代DNA分子，其催化的反應(yīng)依賴于ATP。 DNADNA復(fù)制過程中形成的正超螺旋復(fù)制過程中形成的正超螺旋 I I型型DNADNA拓撲異構(gòu)酶的作用機理拓撲異構(gòu)酶的作用機理 DNADNA拓撲異構(gòu)酶的催化的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)拓撲異構(gòu)酶的催化的轉(zhuǎn)酯反應(yīng) II II型型DNADNA拓撲異構(gòu)酶的作用機制拓撲異構(gòu)酶的作用機制 是一種專門用來起動或引發(fā)DNA合成的酶。由于DNA聚合酶本身不能起動多聚物的合成

31、，只能延伸已經(jīng)被起動的多聚物，因此，引發(fā)酶是DNA復(fù)制所必需的。因為DNA復(fù)制的半不連續(xù)性，所以，引發(fā)酶在前導(dǎo)鏈上只需用引發(fā)一次，而在后隨鏈上則需用引發(fā)多次。大腸桿菌引發(fā)酶的結(jié)構(gòu)模型大腸桿菌引發(fā)酶的結(jié)構(gòu)模型 RNA引物只是用來起動DNA的復(fù)制，它最終并不存在于被復(fù)制的DNA分子之中，遲早要被除去，實際上，細胞內(nèi)有專門的酶負責(zé)切除RNA引物。原核細胞內(nèi)切除RNA的酶是DNA聚合酶I或核糖核酸酶H。真核細胞負責(zé)切除RNA引物的酶是RNase H/FEN1或FEN1/Dna2。 是一類催化一個雙螺旋DNA內(nèi)相鄰核苷酸3-羥基和5-磷酸甚至兩個雙螺旋DNA兩端的3-羥基和5-磷酸發(fā)生連接反應(yīng)形成3,5

32、-磷酸二酯鍵的酶。DNA連接酶在DNA復(fù)制過程中的作用是“縫合”后隨鏈上相鄰的岡崎片段，使不連續(xù)合成的后隨鏈成為一條連續(xù)的鏈。 DNA連接酶在催化連接反應(yīng)時需消耗能量。根據(jù)能量供體的性質(zhì)，連接酶可以分為兩類：第一類使用 NAD+，第二類使用ATP。細菌的DNA連接酶屬于第一類，真核細胞、病毒和噬菌體的連接酶屬于第二類。 DNADNA連接酶的作用機理連接酶的作用機理 尿嘧啶-DNA糖苷酶是一種專門用來切除出現(xiàn)在DNA鏈上非正常尿嘧啶堿基的水解酶。尿嘧啶出現(xiàn)在DNA鏈上有兩種原因：一是在DNA復(fù)制過程中，細胞中存在的dUTP代替dTTP直接進入新合成的DNA鏈；二是DNA分子中的胞嘧啶堿基發(fā)生自發(fā)

33、脫氨基作用。 端聚酶也稱為端粒酶或端粒末端轉(zhuǎn)移酶，由蛋白質(zhì)和RNA兩種成分組成，其中蛋白質(zhì)具有逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，其三維結(jié)構(gòu)與其它逆轉(zhuǎn)錄酶有明顯的相似性，而RNA含有1.5拷貝的端粒DNA重復(fù)序列，這一部分序列作為逆轉(zhuǎn)錄酶的模板。不同來源的端聚酶在RNA長度上變化很大，但它們都形成特定的二級結(jié)構(gòu)，作為模板的那一部分序列處于單鏈狀態(tài)，以方便它與端粒區(qū)的重復(fù)序列結(jié)合，并有效地充當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄的模板。幾種真核生物的端粒重復(fù)序列幾種真核生物的端粒重復(fù)序列物種名稱重復(fù)序列四膜蟲、草履蟲和纖毛蟲T2G4酵母(TG)13TG23擬南芥T3AG3人T2AG3端聚酶的結(jié)構(gòu)模型端聚酶的結(jié)構(gòu)模型 端聚酶的作用機理端聚酶的作用

34、機理 端粒酶活性與細胞分裂能力的關(guān)系端粒酶活性與細胞分裂能力的關(guān)系 六、六、 DNADNA復(fù)制的過程復(fù)制的過程復(fù)制的起始復(fù)制的起始（InitiationInitiation）復(fù)制的延伸（ElongationElongation）復(fù)制的終止（TerminationTermination）以大腸桿菌為代表的以大腸桿菌為代表的“-復(fù)制復(fù)制”系統(tǒng)系統(tǒng) DNA復(fù)制的起始起始于OriC的識別，結(jié)束于引發(fā)體的形成 DNA復(fù)制的延伸 （1）復(fù)制體的形成（2）前導(dǎo)鏈合成（3）后隨鏈合成（4）前導(dǎo)鏈合成和后隨鏈合成之間的協(xié)調(diào) DNA復(fù)制的終止和子代DNA的分離 參與大腸桿菌參與大腸桿菌DNA復(fù)制的主要蛋白質(zhì)或酶的

35、名稱和功能復(fù)制的主要蛋白質(zhì)或酶的名稱和功能蛋白質(zhì)名稱功能DNA旋轉(zhuǎn)酶II型拓撲異構(gòu)酶，負責(zé)清除復(fù)制叉前進中的拓撲學(xué)障礙SSB單鏈結(jié)合蛋白DnaA蛋白復(fù)制起始因子，識別復(fù)制起始區(qū)OriCDnaB蛋白DNA解鏈酶DnaC蛋白招募DnaB蛋白到復(fù)制叉DnaG蛋白DNA引發(fā)酶，引物合成DnaT蛋白輔助DnaC蛋白的作用HU蛋白類似于真核細胞的組蛋白，結(jié)合DNA并使DNA彎曲PriA蛋白引發(fā)體的裝配PriB蛋白引發(fā)體的裝配PriC蛋白引發(fā)體的裝配DNA聚合酶IIIDNA鏈的延伸DNA聚合酶I切除引物，填補空隙DNA連接酶縫合相鄰的岡崎片段DNA拓撲異構(gòu)酶IV分離子代DNARep蛋白DNA解鏈酶Tus復(fù)制

36、終止大腸桿菌大腸桿菌DNADNA復(fù)制起始區(qū)的結(jié)構(gòu)復(fù)制起始區(qū)的結(jié)構(gòu) 大腸桿菌大腸桿菌DNADNA復(fù)制過程中引發(fā)體的形成復(fù)制過程中引發(fā)體的形成 大腸桿菌大腸桿菌DNADNA復(fù)制過程中復(fù)制體的形成復(fù)制過程中復(fù)制體的形成 大腸桿菌大腸桿菌DNADNA復(fù)制的延伸復(fù)制的延伸 大腸桿菌大腸桿菌DNADNA復(fù)制終止區(qū)的結(jié)構(gòu)復(fù)制終止區(qū)的結(jié)構(gòu) 子代子代DNADNA的分離的分離 真核細胞的DNA復(fù)制在很多方面與原核細胞極為相似，但也有幾點不同于原核細胞的地方：（1）需要解決核小體和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對DNA復(fù)制構(gòu)成的障礙；（2）復(fù)制叉移動的速度遠低于原核細胞；（3）具有多個復(fù)制子，這可以彌補復(fù)制叉移動速度低對整個DNA復(fù)制

37、速度的制約；（4）岡崎片段的長度小于原核細胞；（5）復(fù)制被限制在細胞周期的S期，并受到嚴格的調(diào)控；（6）在第一輪復(fù)制結(jié)束之前不可能進行第二輪復(fù)制，而原核細胞在第一輪復(fù)制還沒有結(jié)束的時候就可以進行第二輪復(fù)制；（7）需要端聚酶解決染色體DNA末端復(fù)制問題。 真核細胞真核細胞DNADNA復(fù)制叉的結(jié)構(gòu)模型復(fù)制叉的結(jié)構(gòu)模型 參與真核細胞參與真核細胞DNA復(fù)制的主要蛋白質(zhì)和酶的結(jié)構(gòu)與功能復(fù)制的主要蛋白質(zhì)和酶的結(jié)構(gòu)與功能蛋白質(zhì)名稱大?。╧Da）功能T抗原（Tumor antigen）90識別復(fù)制起始區(qū)，35解鏈酶（受RPA的刺激）復(fù)制蛋白A（RPA）70，34，11結(jié)合單鏈DNA，刺激復(fù)制起始區(qū)的解鏈，刺激

38、T抗原的解鏈酶的活性，刺激DNA聚合酶/引發(fā)酶的活性，與RFC和PCNA一道刺激DNA聚合酶的活性以產(chǎn)生較長的DNA產(chǎn)物。還能阻止DNA聚合酶/引發(fā)酶與新合成的鏈結(jié)合。DNA聚合酶/引發(fā)酶167, 79, 62, 48起動前導(dǎo)鏈和后隨鏈的合成，在5-端合成約10 nt的RNA引物，3-端合成約30 nt的DNA。在后隨鏈模板上頻繁起動引物的合成。聚合酶無校對功能。 p167具有聚合酶活性，p48具有引發(fā)酶活性。與引發(fā)點穩(wěn)定的結(jié)合需要RPA 的刺激。DNA聚合酶125, 55, 40完成前導(dǎo)鏈和后隨鏈的合成。125 kDa亞基具有聚合酶和35外切酶活性，p40與 PCNA相互作用。DNA聚合酶2

39、55, 79, 29, 23并非SV40 DNA復(fù)制所必需的，但在酵母細胞中p255基因的缺失可導(dǎo)致細胞死亡。它在復(fù)制中確切的功能尚不清楚。p255具有聚合酶和35外切酶活性。參與真核細胞參與真核細胞DNA復(fù)制的主要蛋白質(zhì)和酶的結(jié)構(gòu)與功能（續(xù)）復(fù)制的主要蛋白質(zhì)和酶的結(jié)構(gòu)與功能（續(xù)）蛋白質(zhì)名稱大小（kDa）功能復(fù)制因子C（RFC）140, 40, 38, 37, 36裝載PCNA到DNA，依賴于DNA的 ATP酶活性（受到PCNA的刺激），與引物的3-端結(jié)合，結(jié)合需要 ATP。參與聚合酶的切換：打破RPA和DNA聚合酶/引發(fā)酶的接觸，從而使聚合酶與 PCNA相連。分裂細胞核抗原（PCNA）36

40、提高聚合酶和聚合酶進行性，形成三聚體的環(huán)形結(jié)構(gòu)（類似于大腸桿菌DNA 聚合酶III的亞基），也可以和 RFC、FEN-1、核苷酸切除修復(fù)蛋白XPG以及其它一些蛋白質(zhì)結(jié)合。拓撲異構(gòu)酶I110釋放復(fù)制叉前面的超螺旋張力。拓撲異構(gòu)酶IIa或IIb170 (IIa), 180 (IIb)分開連環(huán)體。翼式內(nèi)切核酸酶（FEN-1）4353外切酶/內(nèi)切酶，切除岡崎片段5-端的RNA引物，但不能水解與單鏈DNA相雜交的5-三磷酸核苷酸（需要RNaseH1切掉5-端的一段核苷酸），與PCNA的結(jié)合可刺激它的活性到10倍。FEN-1還能去除由DNA聚合酶/引發(fā)酶合成的錯配核苷酸。RNaseH189內(nèi)切核酸酶，切斷

41、引物在5-端留下單核糖核苷酸。DNA連接酶I125連接岡崎片段，結(jié)合PCNA。使用ATP為能源。SV40SV40的的 DNADNA復(fù)制模型復(fù)制模型 （1）使用端聚酶；（2）將線形DNA暫時轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)形DNA；（3）經(jīng)重組形成串聯(lián)體；（4）滾環(huán)復(fù)制；（5）使用蛋白質(zhì)-dNTP作為引物。T7T7噬菌體噬菌體DNADNA末端末端DNADNA的復(fù)制的復(fù)制 人體發(fā)育完成，端粒酶被抑制，人體發(fā)育完成，端粒酶被抑制， 細胞分裂次數(shù)與端粒長短呈正比細胞分裂次數(shù)與端粒長短呈正比細胞分裂細胞分裂端粒閾值端粒閾值端粒長短端粒長短端粒酶活端粒酶活 Harley (1989)端粒的重復(fù)片段為探針檢測端粒的重復(fù)片段為探針檢

42、測 胎兒細胞株胎兒細胞株嬰兒細胞株嬰兒細胞株青年細胞株青年細胞株老年細胞株老年細胞株年齡年齡小小 大大端粒長度端粒長度 長 短早衰性侏儒癥的端粒明顯較正常人短早衰性侏儒癥的端粒明顯較正常人短“多莉多莉”的衰老的衰老癌細胞的無限繁殖癌細胞的無限繁殖 ( (癌細胞中的端粒酶被激活癌細胞中的端粒酶被激活) )正常細胞的壽命一定，正常細胞的壽命一定，called “the called “the HayflickHayflick limit” limit”治療腫瘤的可能方式：關(guān)閉端粒酶基因，或者抑制端粒酶活性治療腫瘤的可能方式：關(guān)閉端粒酶基因，或者抑制端粒酶活性延長人類壽命或者獲得永生的希望：重新體細

43、胞中的激活端粒酶活性延長人類壽命或者獲得永生的希望：重新體細胞中的激活端粒酶活性（1）四種dNTPs濃度的平衡（2）DNA聚合酶的高度選擇性（3）DNA聚合酶的自我校對（4）錯配修復(fù)（5）使用RNA作為引物干細胞的分裂是不對稱的，而分裂的不對稱性使以后的干細胞能夠選擇性得到含有最老的DNA模板的染色體。這樣的假設(shè)是合乎邏輯的，因為如果一個干細胞在分裂中抓住最老的DNA，就等于將復(fù)制可能產(chǎn)生的錯誤“拒之門外”，從而大大降低了細胞癌變的可能性，而將來分化成體細胞的子細胞得到易錯的新DNA也沒有什么危險，因為它們很快停止分裂或者死亡，特別是在高度更新的組織?！安恍噫溂僬f不朽鏈假說”圖解圖解 DNA復(fù)

44、制的調(diào)控主要集中在起始階段，現(xiàn)分別介紹原核細胞和真核細胞的DNA復(fù)制的起始過程是如何受到調(diào)控的。 原核細胞DNA復(fù)制起始的調(diào)控 在大腸桿菌，由Dam甲基化酶和DnaA蛋白控制。 真核細胞DNA復(fù)制起始的調(diào)控（1）由執(zhí)照因子控制的正調(diào)控（2）由增殖蛋白控制的負調(diào)控甲基化對原核細胞甲基化對原核細胞DNADNA復(fù)制的調(diào)節(jié)復(fù)制的調(diào)節(jié) 錯配修復(fù)酵母細胞酵母細胞DNADNA復(fù)制的正調(diào)控復(fù)制的正調(diào)控 DNA 損傷、修復(fù)和突變損傷、修復(fù)和突變哪些因素能影響到哪些因素能影響到DNA的完整性？的完整性？N細胞內(nèi)源的因素N環(huán)境因素 -例如化學(xué)試劑、污染物和UV線N疾病治療-例如離子輻射和化療細胞內(nèi)源因素細胞內(nèi)源因素

45、N復(fù)制錯誤N例如四種dNTP之間的不平衡導(dǎo)致錯配NDNA本身的不穩(wěn)定N堿基的自發(fā)脫氨基NDNA的脫嘌呤/脫嘧啶導(dǎo)致堿基脫落N活性氧的作用NDNA, 蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化DNA分子上的自發(fā)脫嘌呤作用和自發(fā)脫氨基作用分子上的自發(fā)脫嘌呤作用和自發(fā)脫氨基作用脫嘌呤脫嘌呤/脫嘧啶脫嘧啶* 脫嘌呤比脫嘧啶更容易* 在DNA分子上產(chǎn)生無堿基位點（AP位點）* 大腸桿菌 1 次脫嘌呤/ 基因組/ 復(fù)制* 嗜熱水生菌 300次脫嘌呤/ 基因組/ 復(fù)制* 哺乳動物細胞 10 000次脫嘌呤/ 基因組/ 復(fù)制活性氧（活性氧（ROS）* 由正常的細胞代謝產(chǎn)生* 線粒體利用細胞 85% O2，是主要的ROS來源* 導(dǎo)致D

46、NA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)損傷* 常見的形式： 過氧化氫 (H2O2) 超氧化物自由基 (O2-) 一氧化氮 (NO) 羥基自由基 (HO) 過氧亞硝基陰離子 (O=NOO-) 烷過氧化物 (ROOH) 烷氧自由基 (RO)環(huán)境（外源）因素環(huán)境（外源）因素N 化學(xué)試劑 (1) 天然化合物 黃曲霉素 (2) 人造化合物 苯并芘- 香煙 順鉑- 化療藥物N 物理因素 (1)UV (2)離子輻射 -射線 x-射線DNA損傷類型損傷類型N堿基修飾N堿基丟失-無堿基位點N復(fù)制錯誤：錯誤 N鏈斷裂N蛋白質(zhì)-DNA交聯(lián)NDNA-DNA交聯(lián)DNA損傷的因素和損傷的主要類型損傷的因素和損傷的主要類型損傷類型實例/原因堿

47、基丟失自發(fā)脫堿基（熱、酸），脫嘌呤脫嘧啶，104嘌呤脫落/天/細胞（恒溫動物）堿基修飾形成堿基加合物，例如，8-羥基脫氧鳥嘌呤（離子輻射或活性氧），6-烷基鳥嘌呤（烷基化試劑）堿基交聯(lián)嘧啶二聚體和6-4光產(chǎn)物（UV）堿基轉(zhuǎn)換CU，AI（自發(fā)脫氨基），100堿基脫氨基/天/細胞堿基錯配GT（4種dNTP濃度不平衡、堿基的互變異構(gòu)或堿基之間的差別不足）DNA鏈斷裂因磷酸二酯鍵被破壞引起單鏈斷裂或雙鏈斷裂（離子輻射或特殊的化學(xué)試劑），因脫氧核糖環(huán)3號位發(fā)生斷裂引起的DNA鏈斷裂（博來霉素）DNA鏈間交聯(lián)互補雙鏈之間產(chǎn)生交聯(lián)（雙功能試劑的作用）DNA與蛋白質(zhì)的交聯(lián)UV活性氧的堿基修飾作用活性氧的堿基修

48、飾作用 鳥嘌呤的甲基化導(dǎo)致堿基錯配鳥嘌呤的甲基化導(dǎo)致堿基錯配 紫外線引起的堿基損傷紫外線引起的堿基損傷 離子輻射引起的離子輻射引起的DNA鏈斷裂鏈斷裂 穩(wěn)定，但脆弱穩(wěn)定，但脆弱*不修復(fù)將導(dǎo)致突變不修復(fù)將導(dǎo)致突變 干擾轉(zhuǎn)錄和復(fù)制 導(dǎo)致突變 加速衰老*細胞的修復(fù)機制是必需的細胞的修復(fù)機制是必需的 修復(fù)機制是全方位的、高效的 1 /1000損傷躲過修復(fù) DNA與其它生物大分子一樣，在受到機體內(nèi)外因素的作用下，其結(jié)構(gòu)會遭受到各種各樣的損傷，但是，和其它生物大分子不一樣的是，DNA是唯一的一種在發(fā)生損傷以后可以被完全修復(fù)的分子，而其它生物大分子在受到損傷以后要么被降解，要么被取代。當(dāng)然，并不是發(fā)生在DN

49、A分子上的所有損傷都可以修復(fù)。如果DNA受到的損傷不能及時被修復(fù)，不僅會使DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄受到影響，還可以導(dǎo)致細胞的癌變和早衰。 細胞之所以在DNA受到損傷以后，選擇的處理方法是盡量將其修復(fù)而不是將其降解，這一是因為作為遺傳物質(zhì)的DNA分子在細胞內(nèi)只有一個拷貝，如果將其水解的話，細胞也就失去了存在的根基；二是DNA的互補雙螺旋結(jié)構(gòu)使得修復(fù)一個受損傷的DNA分子變得很容易。正因為如此，一種生物體，即使是那些基因組甚小的生物，也會在修復(fù)上投入大量的基因（100個基因），這再次說明了DNA的穩(wěn)定性壓倒一切。.被科學(xué)雜志評為1994年的年度分子直接修復(fù)切除修復(fù)錯配修復(fù)雙鏈斷裂修復(fù)易錯修復(fù)重組修復(fù)嘧啶

50、二聚體的直接修復(fù)由DNA光裂解酶催化。此酶直接識別和結(jié)合嘧啶二聚體。然后，利用作為吸光色素的輔基捕捉到的光能，將嘧啶二聚體打開，最后再與DNA解離。但是胎盤類哺乳動物卻沒有這種酶。烷基化堿基的直接修復(fù)由特定的烷基轉(zhuǎn)移酶催化 DNA鏈斷裂的直接修復(fù)由DNA連接酶催化。 光裂解酶的三維結(jié)構(gòu)光裂解酶的三維結(jié)構(gòu) 嘧啶二聚體的直接修復(fù)嘧啶二聚體的直接修復(fù) 光裂解酶作用的詳細機制光裂解酶作用的詳細機制 烷基化堿基的直接修復(fù)烷基化堿基的直接修復(fù) 切除修復(fù)先切除損傷的堿基或核苷酸，然后，重新合成正常的核苷酸，最后，再經(jīng)連接酶重新連接，將原來的切口縫合。整個切除修復(fù)過程包括識別、切除、重新合成和重新連接。切除修

51、復(fù)又分為堿基切除修復(fù)（BER）和核苷酸切除修復(fù)（NER），兩者的主要差別在于識別損傷的機制上，前者是直接識別具體的受損傷的堿基，而后者并不識別具體的損傷，而是識別損傷對DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)造成的扭曲。* DNA 糖苷酶切除受損傷的堿基 * 短修補是主要途徑，約占80%90%，只需合成屬于AP位點的1個正常的核苷酸* 長修補是次要途徑，約占10%20%，為短修補途徑的備用途徑，要合成1小段寡聚核苷酸尿嘧啶的切除修復(fù)尿嘧啶的切除修復(fù) DNA糖苷酶都是糖苷酶都是沿著沿著DNA小溝掃小溝掃描描DNA，當(dāng)找到，當(dāng)找到受損傷的堿基以受損傷的堿基以后即與后即與DNA結(jié)合結(jié)合，并導(dǎo)致，并導(dǎo)致DNA結(jié)結(jié)構(gòu)發(fā)生歪曲，

52、以構(gòu)發(fā)生歪曲，以便將損傷的堿基便將損傷的堿基擠出雙螺旋，進擠出雙螺旋，進入它的活性中心入它的活性中心被切割。被切割。 真核細胞的堿基切除修復(fù)真核細胞的堿基切除修復(fù) NER最初的切點是損傷部位附近的3,5-磷酸二酯鍵，主要用來修復(fù)因UV、絲裂霉素 C和順鉑等因素造成的比較大的損傷，如嘧啶二聚體、6-4光產(chǎn)物或體積較大的堿基加合物以及鏈間交聯(lián)等導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲并影響到DNA復(fù)制的損傷，此外，約20%堿基的氧化性損傷也由它修復(fù)。在修復(fù)過程中，損傷以寡聚核苷酸的形式被切除。由于NER識別損傷的機制并非針對損傷本身，而是損傷對DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)造成的扭曲，因此，NER能夠使用相同的機制和幾乎同一套修

53、復(fù)蛋白去修復(fù)一系列性質(zhì)并不相同的損傷。NER在所有的生物具有相同的步驟：在所有的生物具有相同的步驟： 識別損傷由特殊的蛋白質(zhì)完成，并由此引發(fā)一系列的蛋白質(zhì)與受損傷DNA的有序結(jié)合； 切除損傷特殊的內(nèi)切酶在損傷部位的兩側(cè)切開DNA鏈，隨后兩個切口之間帶有損傷的DNA片段被去除； 修復(fù)合成DNA聚合酶以另外一條鏈為模板，合成已被切除的序列； 縫合切口由DNA連接酶催化。兩類堿基切除修復(fù)兩類堿基切除修復(fù)-全局性基因組NER和轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)性NERC 全局性基因組NER負責(zé)修復(fù)整個基因組的損傷，速度慢，效率低。C 轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)性NER專門負責(zé)修復(fù)那些正在轉(zhuǎn)錄的基因在模板鏈上的損傷，速度快，效率高。C 兩類NER

54、的主要差別在于識別損傷的機制上，至于損傷識別以后發(fā)生的修復(fù)反應(yīng)并無本質(zhì)上的不同。TCR由RNA聚合酶識別損傷，當(dāng)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄到受損傷部位而前進受阻的時候，TCR系統(tǒng)即被起動。全局性全局性NER和轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)性和轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)性NER *受到ATP水解的驅(qū)動，2個UvrA與1個UvrB形成三聚體復(fù)合物 （UvrA2UvrB1）；*該復(fù)合物與DNA隨機結(jié)合后，沿著DNA鏈移動，以探測損傷的位置。*識別損傷的過程比較緩慢，為GGR系統(tǒng)的限速步驟。*當(dāng)遇到嘧啶二聚體時，通過水解ATP，造成損傷部位的DNA雙螺旋發(fā)生局部解鏈和進一步彎曲，致使UvrB與損傷部位形成更緊密的接觸；*UvrA在ATP水解后離開復(fù)合

55、物，留下UvrB橫跨損傷部位；大腸桿菌大腸桿菌的核苷酸切除修復(fù)的核苷酸切除修復(fù)* UvrC被UvrB招募到損傷部位后激活UvrB的核酸內(nèi)切酶活性，UvrB在距離嘧啶二聚體的下游4nt的位置切開DNA鏈；* 與此同時，UvrC的核酸內(nèi)切酶活性被UvrB激活，在距離嘧啶二聚體的上游7nt的位置切開DNA鏈；* 于是，產(chǎn)生一個長達13nt的含有嘧啶二聚體的寡聚核苷酸片段。大腸桿菌大腸桿菌的核苷酸切除修復(fù)的核苷酸切除修復(fù)* 在解鏈酶UvrD的作用下，ATP被水解，包含嘧啶二聚體的DNA片段發(fā)生解鏈而離開雙螺旋，UvrC也隨之而去；* 最后，DNA聚合酶I或II填補空缺；* DNA連接酶則縫合切口。大腸

56、桿菌大腸桿菌的核苷酸切除修復(fù)的核苷酸切除修復(fù)轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)性核苷酸切除修復(fù)轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)性核苷酸切除修復(fù) 哺乳動物細胞的全局性哺乳動物細胞的全局性NER和轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)性和轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)性NER MMR系統(tǒng)主要用來修復(fù)DNA分子上錯配堿基對，此外，還能修復(fù)一些因“復(fù)制打滑”而誘發(fā)的核苷酸插入或缺失損傷。錯配修復(fù)系統(tǒng)必須能夠保證只會將子鏈上錯誤的堿基切除，而不會把母鏈中本來就正確的堿基切除。大腸桿菌的MMR系統(tǒng)的確就是利用甲基化來區(qū)分子鏈和母鏈的，因此，大腸桿菌內(nèi)修復(fù)復(fù)制中產(chǎn)生的錯配堿基的系統(tǒng)又稱為甲基化導(dǎo)向的錯配修復(fù)。至于其它細菌和真核細胞如何區(qū)分子鏈和母鏈的尚不清楚。參與錯配修復(fù)的蛋白質(zhì)和酶的名稱和功能參與錯配修復(fù)

57、的蛋白質(zhì)和酶的名稱和功能大腸桿菌酵母哺乳動物大腸桿菌中蛋白質(zhì)的功能MutS Msh2,Msh6,Msh3Msh1（線粒體）Msh4，Msh5（減數(shù)分裂重組）Msh2,Msh6,Msh3不明Msh4，Msh5（減數(shù)分裂重組）識別錯配堿基，具有弱的ATP酶活性。MutLMlh1Pms1Mlh2,Mlh3Mlh1Pms2Pms1調(diào)節(jié)MutS和MutH之間的相互作用，與UvrD作用。MutH不明不明結(jié)合半甲基化的GATC位點，序列和甲基化特異性內(nèi)切酶，剪切非甲基化GATC的5-端。UvrD不明不明解鏈酶II，催化被切開的含有錯配堿基的子鏈與母鏈的分離。* （1）首先由MutS識別并結(jié)合除了C-C以外的

58、錯配堿基對，MutL隨后結(jié)合；（2）在錯配堿基對兩側(cè)的DNA通過MutS作相向移動；（3）MutH與MutL和GATC位點結(jié)合；（4）MutH的核酸內(nèi)切酶活性被MutS/MutL激活，在非甲基化GATC的5-端切開子鏈；（5）UvrD作為解鏈酶，催化被切開的含有錯配堿基的子鏈與母鏈的分離，SSB則與母鏈上處于單鏈狀態(tài)的區(qū)域結(jié)合，特殊的外切酶將游離出來的含有錯配堿基的單鏈DNA進行水解。如果MutH的切點在錯配堿基的3-端，將由外切核酸酶I或X從35方向水解。如果MutH的切點在在錯配堿基的5-端，則由外切核酸酶VII和 RecJ 來降解；（6）最后，DNA聚合酶III和連接酶分別進行缺口的修復(fù)

59、合成和切口的縫合。Damage Bypass* Many lesions can still escape DNA repair and are present at the time of DNA replication* During DNA replication - unrepaired damage can block the major replicative DNA polymerase Pol (,) and halt replication* Need to bypass the block or may result in chromosomal truncation *

60、BER and NER cant be used because the replication fork has already separated the parental DNA strands* Two Systems are used - Recombinational Bypass and Bypass Synthesis同源重組修復(fù)利用細胞內(nèi)一些促進同源重組的蛋白質(zhì)來從姊妹染色體或同源染色體那里獲得合適的修復(fù)斷裂的信息，這一種方式的精確性較高；非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)在無序列同源的情況下，讓斷裂的末端重新連接起來，這種方式容易發(fā)生錯誤，是人類修復(fù)雙鏈斷裂的主要方式。DNA雙

61、鏈斷裂的重組修復(fù)雙鏈斷裂的重組修復(fù) 哺乳動物細胞哺乳動物細胞DNA雙鏈斷裂的非同源末端連接雙鏈斷裂的非同源末端連接 損傷跨越損傷跨越 重組跨越使用同源重組的方法將DNA模板進行交換以避免損傷對復(fù)制的抑制，從而使復(fù)制能夠繼續(xù)下去，而隨后的復(fù)制仍然使用細胞內(nèi)高保真的聚合酶，因此忠實性并無下降，故此途徑被視為一種無錯的系統(tǒng)?？缭胶铣捎址Q為（TLS）跨損傷合成，由專門的DNA聚合酶與停留在損傷位點上的原來催化復(fù)制的DNA聚合酶交換，在子鏈上（模板鏈上損傷堿基的對面）插入正確或錯誤的核苷酸，結(jié)果導(dǎo)致對損傷位點無錯或易錯的跨越。 大腸桿菌的重組跨越大腸桿菌的重組跨越 大腸桿菌的大腸桿菌的SOS反應(yīng)反應(yīng) S

62、OS反應(yīng)是指細胞在受反應(yīng)是指細胞在受到潛在致死性壓力下，到潛在致死性壓力下，例如例如UV輻射、胸腺嘧輻射、胸腺嘧啶饑餓、啶饑餓、DNA修飾物的修飾物的作用和作用和DNA復(fù)制所必需復(fù)制所必需的基因的失活，做出的的基因的失活，做出的有利于細胞生存的代謝有利于細胞生存的代謝預(yù)警反應(yīng)，包括易錯的預(yù)警反應(yīng)，包括易錯的跨損傷合成、細胞絲狀跨損傷合成、細胞絲狀化和切除修復(fù)的激活，化和切除修復(fù)的激活，其中涉及到近其中涉及到近20個個“sos”基因的表達，整基因的表達，整個反應(yīng)受到個反應(yīng)受到LexA 阻遏阻遏蛋白和蛋白和RecA激活蛋白激活蛋白的調(diào)節(jié)。的調(diào)節(jié)。 大腸桿菌大腸桿菌DNA損傷的跨越合成損傷的跨越合成

63、 DNA聚合酶聚合酶V參與的跨損傷合成的詳細步驟參與的跨損傷合成的詳細步驟 真核細胞真核細胞DNA的跨損傷合成的跨損傷合成 L修復(fù)系統(tǒng)的不完善，為DNA的突變打開了方便之門，因為這些損傷如果在下一輪DNA復(fù)制之前還沒有被修復(fù)的話，就有可能直接被固定下來傳給子代，有的則通過易錯的跨損傷合成產(chǎn)生新的錯誤并最終也被固定下來。這些發(fā)生在DNA分子上可遺傳的結(jié)構(gòu)變化通稱為突變 L點突變是指DNA 分子某一位點上所發(fā)生的一種堿基對變成另外一種堿基對的突變，可分為轉(zhuǎn)換和顛換兩種形式，其中，轉(zhuǎn)換是指兩種嘌呤堿基或兩種嘧啶堿基之間的相互轉(zhuǎn)變，顛換是指嘌呤堿基和嘧啶堿基之間的互變 L移碼突變是指在一個蛋白質(zhì)基因的

64、編碼區(qū)發(fā)生的一個或多個核苷酸（非3的整數(shù)倍）的缺失或插入。 堿基突變的幾種方式堿基突變的幾種方式 移框突變移框突變 （1）突變的密碼子決定同樣的氨基酸，這樣的突變對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能不會產(chǎn)生任何影響，因此稱為沉默突變。（2）突變的密碼子決定不同的氨基酸，這樣的突變可能對蛋白質(zhì)的功能不產(chǎn)生任何影響或影響微乎其微，也可能產(chǎn)生災(zāi)難性的后果而帶來分子病。由于突變導(dǎo)致出現(xiàn)了錯誤的氨基酸，因此，這樣的突變稱為錯義突變。如果錯誤的氨基酸與原來的氨基酸是同種性質(zhì)，這種突變被稱為中性突變。（3）突變的密碼子變?yōu)榻K止密碼子或者相反，前者因為終止密碼子的提前出現(xiàn)可導(dǎo)致一條多肽鏈被截短，被稱為無義突變，后者則會加長一

65、條多肽鏈，被稱為加長突變或通讀突變。 L DNA突變可能是隱性的，也可能是顯性的。L 如果突變僅僅是滅活一種蛋白質(zhì)，那么，這種突變一般產(chǎn)生隱性性狀。因為染色體是成對的，每一個基因至少有2個拷貝，一條同源染色體上正常的基因能夠抵消另一條同源染色體上突變的基因?qū)毎δ芎托誀畹挠绊?。因此，只有一對同源染色體上兩個相同的基因都發(fā)生突變，才會影響到表現(xiàn)型；如果突變產(chǎn)生的蛋白質(zhì)對細胞有毒，這種毒性無法被另外一條染色體上正?；虮磉_出來的正常的蛋白質(zhì)所抵消或中和，那么，這種突變被視為顯性。顯性突變只需要兩條同源染色體上任意一個拷貝上的基因發(fā)生突變， 就可以帶來突變體的表現(xiàn)型發(fā)生變化。幾乎任何導(dǎo)致DNA損傷

66、的因素都能夠?qū)е翫NA突變，前提是它們造成的損傷在DNA復(fù)制之前還沒有被細胞內(nèi)的修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)，因此，可以這樣認為，導(dǎo)致DNA損傷的原因在某種意義上就是導(dǎo)致DNA突變的原因。由內(nèi)在因素引起的突變被稱為自發(fā)性突變，由外在因素引發(fā)的突變被稱為誘發(fā)突變。各種導(dǎo)致DNA突變的內(nèi)外因素總稱為突變原。$自發(fā)的點突變（1）DNA復(fù)制過程中的錯配（2）自發(fā)脫氨基 （3）活性氧的氧化（4）堿基的烷基化 $自發(fā)的移碼突變（1）“復(fù)制打滑” （2）轉(zhuǎn)座作用。 烯醇式的烯醇式的T和和G的配對的配對 自發(fā)脫氨基和活性氧作用引起的堿基轉(zhuǎn)換自發(fā)脫氨基和活性氧作用引起的堿基轉(zhuǎn)換 復(fù)制打滑引起的移框突變復(fù)制打滑引起的移框突變 1. 誘發(fā)點突變 （1）堿基類似物，如5-溴尿嘧啶和2-氨基 嘌呤 （2）烷基化試劑，如氮芥和硫芥等 （3）脫氨基試劑，如亞硝酸 （4）羥胺 2. 誘發(fā)移碼突變 嵌入試劑，如吖啶黃，原黃素和EB等 堿基類似物誘發(fā)的點突變堿基類似物誘發(fā)的點突變 誘變劑誘發(fā)的點突變誘變劑誘發(fā)的點突變 嵌入試劑誘發(fā)的移框突變嵌入試劑誘發(fā)的移框突變 各種化學(xué)誘變劑化學(xué)結(jié)構(gòu)各種化學(xué)誘變劑化學(xué)結(jié)構(gòu) （一）回復(fù)突變 如果在老的突