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1、第三章第三章 DNA的生物合成的生物合成 DNA DNA 復(fù)制一般特征復(fù)制一般特征 參與參與DNADNA復(fù)制的酶類復(fù)制的酶類 DNADNA復(fù)制基本過程復(fù)制基本過程 DNADNA復(fù)制的調(diào)控復(fù)制的調(diào)控 DNADNA損傷與修復(fù)損傷與修復(fù)一、一、DNA的生物學功能的生物學功能1、儲存遺傳信息、儲存遺傳信息2、復(fù)制遺傳信息、復(fù)制遺傳信息3、表達遺傳信息、表達遺傳信息4、遺傳變異、遺傳變異1962, Nobel Prize全保留全保留半保留半保留分散式分散式DNA如何進行復(fù)制？如何進行復(fù)制？15NP0P1P2P3P4P0P2P0P414N 15N/14N 15NMeselson-Stahl experim
2、ent1958, PNAS2 DNA復(fù)制的半不連續(xù)性復(fù)制的半不連續(xù)性復(fù)制時復(fù)制時DNA鏈延伸可能有三種方式：鏈延伸可能有三種方式：12 3 1967年，日本科學家岡崎用實驗證明復(fù)制過程中產(chǎn)生年，日本科學家岡崎用實驗證明復(fù)制過程中產(chǎn)生1001000bp的短片段的短片段沒有從沒有從3 5 延長延長DNA鏈的聚合酶鏈的聚合酶 一條鏈連續(xù)合成，一條鏈連續(xù)合成，稱稱主導鏈主導鏈，Leading Leading Strand Strand 另另一條鏈分段合成一條鏈分段合成，稱，稱隨從鏈隨從鏈Lagging StrandLagging Strand 。 原因：原因：DNADNA雙螺旋分子兩條鏈方向相反，新雙
3、螺旋分子兩條鏈方向相反，新鏈合成的方向只能鏈合成的方向只能5 533一個方向合成。一個方向合成。 在兩個方向同時進行，形成兩個復(fù)制叉在兩個方向同時進行，形成兩個復(fù)制叉( (Replication Fork ). 半保留半保留 半不連續(xù)性半不連續(xù)性 雙向性雙向性參與參與DNA復(fù)制的酶或蛋白因子：復(fù)制的酶或蛋白因子：1 DNA聚合酶聚合酶 催化催化DNA的合成的合成2 引物酶引物酶 起始起始RNA的合成的合成3 連接酶連接酶 連接岡崎片段連接岡崎片段4 DNA解鏈，解旋酶解鏈，解旋酶5 DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白 1956年，大腸桿菌年，大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶 1959，Nobel Prize（一
4、）（一） 作用機制作用機制 以以DNA做模板，堿基互補配對做模板，堿基互補配對，催化，催化4種種dNTP之間形成磷酸二之間形成磷酸二酯鍵，從而延長酯鍵，從而延長DNA鏈。鏈。 Mg2+ 在在模板模板鏈上進行鏈上進行 不能從頭合成，在不能從頭合成，在引物引物的的3 3OHOH端上延長端上延長 新鏈延長方向為新鏈延長方向為5 533延長延長 有有3 3種：種：DNADNA聚合酶聚合酶 I I，IIII，IIIIII。 多功能酶多功能酶： 合成合成DNADNA的活性的活性 聚合酶作用聚合酶作用, ,延長延長DNADNA鏈。鏈。 水解水解DNADNA的活性的活性 外切核酸酶活性外切核酸酶活性, ,切除
5、不配對切除不配對堿基，起校讀作用堿基，起校讀作用大腸桿菌大腸桿菌DNADNA聚合酶聚合酶I I ：單鏈多肽蛋白質(zhì)單鏈多肽蛋白質(zhì), ,分子量為分子量為109KD.109KD.性質(zhì)：多功能酶性質(zhì)：多功能酶大亞基：大亞基：5 533聚合酶活性聚合酶活性 3 355外切酶活性外切酶活性小亞基：小亞基：5 533外切酶活性。外切酶活性。 1000nt/min1000nt/min35外切酶活性外切酶活性 從游離從游離3OH端切割端切割,識別和消識別和消除不配對的核苷酸，保證了除不配對的核苷酸，保證了DNA復(fù)制的復(fù)制的忠實性。忠實性。53外切酶活性外切酶活性 DNA聚合酶聚合酶I中的小亞基帶有中的小亞基帶有
6、5外切外切酶活性，從雙鏈酶活性，從雙鏈DNA的的5端降解釋放端降解釋放出單核苷酸或寡聚核苷酸。出單核苷酸或寡聚核苷酸。35外切活性示意圖外切活性示意圖DNA聚合酶特有活性聚合酶特有活性 不是不是主要的復(fù)制酶主要的復(fù)制酶 RNARNA引物的切除引物的切除 DNADNA損傷的修復(fù)：紫外線作用形成的損傷的修復(fù)：紫外線作用形成的TTTT二二 聚體的切除聚體的切除 鏈置換：鏈置換： 可能參與遺傳重組可能參與遺傳重組 切口平移（切口平移（nick translationnick translation） 探針標記探針標記 不是復(fù)制酶，主要在不是復(fù)制酶，主要在DNADNA修復(fù)中起作用，無修復(fù)中起作用，無5
7、533外切酶活性。外切酶活性。 5% DNA5% DNA聚合酶聚合酶I I的活性的活性 1972 1972年發(fā)現(xiàn)年發(fā)現(xiàn)催化效率高，主要復(fù)制酶。由催化效率高，主要復(fù)制酶。由1010種種亞基組成亞基組成： （1 1）核心聚合酶：）核心聚合酶： ：5 53 3DNADNA聚合酶活性聚合酶活性 ：3 3-5-5外切酶活性，控制外切酶活性，控制 復(fù)制忠實性復(fù)制忠實性 ：核心酶的組建：核心酶的組建 （2 2） 二聚體：二聚體： 構(gòu)成滑動鉗，將全酶固定在構(gòu)成滑動鉗，將全酶固定在DNADNA模板上，提高合成速率（模板上，提高合成速率（20/20/秒秒-750/-750/秒秒。 （3 3） 復(fù)合物復(fù)合物 ： 2
8、 2 協(xié)助協(xié)助 二聚體結(jié)合二聚體結(jié)合到到 DNADNA E. coli DNA 聚合酶聚合酶不對稱二聚體不對稱二聚體 形成不對稱的二聚體，與形成不對稱的二聚體，與DNADNA雙鏈結(jié)合，后隨雙鏈結(jié)合，后隨鏈折疊鏈折疊1801800 0，使后隨鏈的物理方向，使后隨鏈的物理方向與主導鏈與主導鏈一一致，同時催化兩條鏈的復(fù)制。致，同時催化兩條鏈的復(fù)制。3 5 3 5 3 5 3 5 解鏈方向解鏈方向領(lǐng)頭鏈領(lǐng)頭鏈(leading strand)后隨鏈后隨鏈(lagging strand)3 5 DNA 聚合酶聚合酶 pol pol pol 亞基數(shù)目亞基數(shù)目 1 7 105 3 聚合酶活性聚合酶活性 + +
9、 + 3 5 外切酶活性外切酶活性 + + +5 3 外切酶活性外切酶活性 + - - - -聚合速度聚合速度(核苷酸核苷酸/分分) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000 持續(xù)合成能力持續(xù)合成能力 3-200 1 500 500 000功能功能 切除引物切除引物,修復(fù)修復(fù) 修復(fù)修復(fù) 復(fù)制復(fù)制大腸桿菌大腸桿菌3種種DNA聚合酶性質(zhì)比較聚合酶性質(zhì)比較 DNADNA聚合酶聚合酶 : : 多亞基、多功能酶。多亞基、多功能酶。 大亞基：大亞基：DNADNA聚合酶活性。聚合酶活性。 100nt/100nt/次次 小亞基：引物酶活性，小亞基：引物酶活性，合成合成RNARNA。 起始
10、起始DNADNA的合成：合成的合成：合成RNARNA引物和在引物和在RNA3RNA3羥基端合成一段羥基端合成一段DNADNA。 DNADNA聚合酶聚合酶 的的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) 多亞基組成：多亞基組成： P125 P125 大亞基，催化亞基，含聚合酶和大亞基，催化亞基，含聚合酶和 外切酶活性外切酶活性 P50 P50 與增殖細胞核抗原與增殖細胞核抗原(PCNA)(PCNA)結(jié)合相關(guān)結(jié)合相關(guān) P66P66 P12P12 主要主要DNADNA復(fù)制酶：復(fù)制酶：DNADNA聚合酶活性，延伸聚合酶活性，延伸DNADNA鏈。鏈。 與與RFCRFC和和PCNAPCNA形成形成“全酶全酶”，在，在RFCRFC和和PCN
11、APCNA等的協(xié)同下，促使等的協(xié)同下，促使DNADNA聚合酶聚合酶 的解離的解離， DNADNA聚聚合酶合酶 接替接替DNADNA聚合酶聚合酶 繼續(xù)繼續(xù)DNADNA鏈的合成鏈的合成- - DNADNA聚合酶聚合酶 向向DNADNA聚合酶聚合酶 的轉(zhuǎn)換。的轉(zhuǎn)換。 復(fù)制校正功能：復(fù)制校正功能：3 3-5-5外切核酸酶活性外切核酸酶活性 DNADNA聚合酶聚合酶 、 主要功能：主要功能：DNADNA修復(fù)。修復(fù)。 DNADNA聚合酶聚合酶：線粒體：線粒體DNADNA復(fù)制復(fù)制 1 1、PCNAPCNA：增殖細胞核抗原（增殖細胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen)
12、Proliferating Cell Nuclear Antigen)， DNADNA聚合酶的附屬蛋白，參與聚合酶的附屬蛋白，參與DNADNA的合的合成，類似成，類似 二聚體。二聚體。 2 2、RFCRFC：復(fù)制因子：復(fù)制因子C(Replication C(Replication Factor C)Factor C)。多亞基復(fù)合物，。多亞基復(fù)合物，DNADNA聚合酶聚合酶的附屬蛋白，的附屬蛋白，識別引物末端識別引物末端, ,參與鏈的延參與鏈的延長。類似長。類似 復(fù)合物。復(fù)合物。 3、PRP1PRP1和和PRP2PRP2 Primer Recognition Protein 增加增加DNA聚合酶
13、聚合酶 與模板引物末端的親和力與模板引物末端的親和力，增加，增加DNA聚合酶聚合酶 的活性。的活性。Taq DNA聚合酶特性聚合酶特性（Taq DNA polymerase）最初由最初由H.A.ErlicH從熱泉中的細菌中出來從熱泉中的細菌中出來 性質(zhì)性質(zhì)具有具有53聚合酶活性以及依賴于聚合作用的聚合酶活性以及依賴于聚合作用的外切酶活性外切酶活性 耐熱性耐熱性此酶是一種耐熱的依賴于此酶是一種耐熱的依賴于DNA的的DNA聚合酶聚合酶最適反應(yīng)溫度為最適反應(yīng)溫度為7280 應(yīng)用應(yīng)用能以高溫變性的靶能以高溫變性的靶DNA分離出來的單鏈分離出來的單鏈DNA為模板，進行為模板，進行DNA的體外擴增的體外擴
14、增PCR反應(yīng)。反應(yīng)。 DNA聚合酶不能引發(fā)聚合酶不能引發(fā)DNA新生鏈的合成，只新生鏈的合成，只能能在在已存在的已存在的DNA鏈鏈或或RNA鏈上延長鏈上延長DNA。引物酶催化引物引物酶催化引物RNA的合成。的合成。 19671967年發(fā)現(xiàn)年發(fā)現(xiàn) 催化岡奇片段間磷酸二酯鍵的形成，二個片段催化岡奇片段間磷酸二酯鍵的形成，二個片段必須都與完整的模板鏈結(jié)合。必須都與完整的模板鏈結(jié)合。 大腸桿菌的連接酶需大腸桿菌的連接酶需NAD+NAD+，真核細胞的連接酶真核細胞的連接酶需要需要ATPATP。 可連接雙鏈可連接雙鏈DNADNA中的單鏈切口，中的單鏈切口，RNA-DNARNA-DNA雜交體雜交體雙鏈單鏈切口
15、，不能連接雙鏈雙鏈單鏈切口，不能連接雙鏈RNARNA中的單鏈切中的單鏈切口?？凇＃ㄒ唬ㄒ唬〥NADNA螺旋酶（螺旋酶（HelicaseHelicase） 催化雙螺旋解旋和解鏈催化雙螺旋解旋和解鏈 需消耗需消耗ATPATP（二）拓撲異構(gòu)酶（二）拓撲異構(gòu)酶（Topoisomerase)Topoisomerase) DNA DNA 回旋酶（回旋酶（GyraseGyrase） 促進促進DNADNA雙鏈的解開雙鏈的解開, ,需消耗需消耗ATPATP。 兼有內(nèi)切酶和連接酶活性兼有內(nèi)切酶和連接酶活性, , 可迅速使可迅速使DNADNA兩條鏈斷開又接上兩條鏈斷開又接上, , 消除解鏈酶產(chǎn)生的消除解鏈酶產(chǎn)生的
16、拓撲張力。拓撲張力。當引入負超螺旋當引入負超螺旋時需要由時需要由ATPATP提供能量提供能量, , 同復(fù)制有關(guān)。同復(fù)制有關(guān)。（三）單鏈結(jié)合蛋白（三）單鏈結(jié)合蛋白 DNA單鏈結(jié)合蛋白（單鏈結(jié)合蛋白（Single Strand Binding protein，SSB） 復(fù)制因子復(fù)制因子A 主要功能：主要功能： 與單鏈親和力大，穩(wěn)定單與單鏈親和力大，穩(wěn)定單鏈結(jié)構(gòu)，保護單鏈免受核酸酶水解和鏈結(jié)構(gòu)，保護單鏈免受核酸酶水解和阻止雙鏈形成，有利復(fù)制進行。阻止雙鏈形成，有利復(fù)制進行。 Replicon Replicon 基因組中能獨立進行復(fù)制的基因組中能獨立進行復(fù)制的結(jié)構(gòu)單位稱復(fù)制子結(jié)構(gòu)單位稱復(fù)制子, , 或
17、者說單個復(fù)制起或者說單個復(fù)制起始點控制的始點控制的DNA,DNA,包含從起始位點到終止包含從起始位點到終止位點的全部位點的全部DNADNA。 復(fù)制的起始位點復(fù)制的起始位點 控制并起始復(fù)制的控制并起始復(fù)制的特定位點。特定位點。 終止位點終止位點 終止復(fù)制的位點終止復(fù)制的位點 每個細胞周期啟動復(fù)制一次。每個細胞周期啟動復(fù)制一次。 復(fù)制在復(fù)制在特定部位特定部位起始。起始。 原核生物僅有原核生物僅有一個一個起始部位。起始部位。 真核生物有真核生物有多個多個起始部位。起始部位。DNA拓撲異構(gòu)酶解決了解開拓撲異構(gòu)酶解決了解開DNA雙螺雙螺旋的問題旋的問題一一 復(fù)制的起始復(fù)制的起始（一）起始部位起始部位的序
18、列特征的序列特征 同位素標記顯示復(fù)制起始在特定部位開始同位素標記顯示復(fù)制起始在特定部位開始 復(fù)制起始點復(fù)制起始點:origin, ori:origin, ori DNA復(fù)制過程：復(fù)制過程：1 1、 M M1313噬菌體的起始部位順序特征噬菌體的起始部位順序特征 5959bpbp的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的發(fā)夾結(jié)構(gòu) 2 2、大腸桿菌大腸桿菌(OriC)(OriC)的起始部位順序特征的起始部位順序特征 240bp240bp的唯一起始部位的唯一起始部位 2 2個區(qū)域：個區(qū)域： 起始蛋白識別結(jié)合區(qū)起始蛋白識別結(jié)合區(qū)：4 4個個9 9bpbp重復(fù)順序重復(fù)順序 鄰近的鄰近的ATAT富含區(qū)富含區(qū)3 3個個1313bpbp重
19、復(fù)順序重復(fù)順序。 大腸桿菌基因組復(fù)制起始部位大腸桿菌基因組復(fù)制起始部位A: 含含ARS一致序列（一致序列（ACS），復(fù)制起始識別復(fù)合物結(jié)合），復(fù)制起始識別復(fù)合物結(jié)合B：增加復(fù)制起始位點的效率：增加復(fù)制起始位點的效率100200bp5211 5220 5230 5240 1 10 20 30CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTAGTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT 反轉(zhuǎn)重復(fù)序列反轉(zhuǎn)重復(fù)序列 大大T抗原結(jié)合
20、部位抗原結(jié)合部位 II A/T 富含區(qū)富含區(qū) 圖圖3-7 SV40 復(fù)制起始部位結(jié)構(gòu)復(fù)制起始部位結(jié)構(gòu) 獨特重復(fù)序列獨特重復(fù)序列 起始結(jié)合蛋白識別起始結(jié)合蛋白識別 ATAT富含序列，有利于富含序列，有利于DNADNA雙鏈解旋雙鏈解旋 多個復(fù)制起始點，有人發(fā)現(xiàn)任何大于多個復(fù)制起始點，有人發(fā)現(xiàn)任何大于15kb15kb的的DNADNA就能自主復(fù)制。就能自主復(fù)制。 起始不是隨機的，但未發(fā)現(xiàn)起始位點的特征序起始不是隨機的，但未發(fā)現(xiàn)起始位點的特征序列。列。特征：結(jié)合復(fù)制相關(guān)蛋白特征：結(jié)合復(fù)制相關(guān)蛋白 一個細胞周期復(fù)制一次一個細胞周期復(fù)制一次 不同細胞復(fù)制起始位點的應(yīng)用存在差異不同細胞復(fù)制起始位點的應(yīng)用存在差
21、異 1 噬菌體噬菌體（ X174X174）priA priA 識別起始位點，識別起始位點，ATPATP酶活性酶活性priB priB 起始引發(fā)起始引發(fā)priC priC 起始引發(fā)起始引發(fā)DnaT DnaT 起始引發(fā)起始引發(fā)DnaB DnaB 起始引發(fā)起始引發(fā)DnaC DnaC 起始引發(fā)起始引發(fā), ,與與DnaBDnaB一起作用一起作用DnaG DnaG RNARNA引物合成引物合成 2 2 大腸桿菌大腸桿菌 DnaA DnaA 識別并識別并結(jié)合于結(jié)合于oriCoriC區(qū)區(qū)，有有ATPATP酶活性，使酶活性，使ATAT富含區(qū)富含區(qū)解解鏈，促進鏈，促進DnaBDnaB結(jié)合形成起始復(fù)合物。結(jié)合形成起
22、始復(fù)合物。 DnaB DNADnaB DNA螺旋酶，有解旋和解鏈作用。螺旋酶，有解旋和解鏈作用。 DnaC DnaC 運輸運輸DnaBDnaB，形成起始復(fù)合物。形成起始復(fù)合物。 DnaG DNADnaG DNA復(fù)制引發(fā)酶，合成引物。復(fù)制引發(fā)酶，合成引物。 Hu Hu 促進復(fù)制復(fù)合物的形成。促進復(fù)制復(fù)合物的形成。 回旋酶回旋酶 松弛正超螺旋，促進單鏈松弛正超螺旋，促進單鏈DNADNA產(chǎn)生。產(chǎn)生。 單鏈結(jié)合蛋白單鏈結(jié)合蛋白 促進促進DNADNA解鏈，穩(wěn)定單鏈解鏈，穩(wěn)定單鏈DNADNA。 真核細胞（真核細胞（SV40）的）的DNA復(fù)制至少需要復(fù)制至少需要6個蛋白因子參與。個蛋白因子參與。 T抗原抗原
23、：N N端為端為DNADNA結(jié)合區(qū)，識別起始位點，結(jié)合區(qū)，識別起始位點，C C端具有螺旋端具有螺旋 酶活性，在酶活性，在RFARFA的協(xié)助下解開雙鏈。的協(xié)助下解開雙鏈。 SV40 SV40 編碼編碼 RFA：人單鏈結(jié)合蛋白：人單鏈結(jié)合蛋白 拓補異構(gòu)酶拓補異構(gòu)酶I或或II：解開超螺旋。：解開超螺旋。 復(fù)制因子復(fù)制因子C（replication facter C, RFC）：形成起始復(fù)合物）：形成起始復(fù)合物 DNA聚合酶聚合酶-引物酶復(fù)合物：合成引物，起始引物酶復(fù)合物：合成引物，起始DNADNA合成。合成。（1） ORC（ Origin Recognition Complex）6個亞基組成個亞基組
24、成 在真核生物中相當保守在真核生物中相當保守特異識別特異識別ARS （Autonomously replicating sequence）ORC1p，ORC2p，ORC4p 與與A 元件結(jié)合，元件結(jié)合，ORC5p與與B元件結(jié)合元件結(jié)合結(jié)合過程需要結(jié)合過程需要ATP（三）復(fù)制的起始引發(fā)（三）復(fù)制的起始引發(fā)（Priming） 合成合成RNA引物的過程引物的過程 單鏈結(jié)合蛋白單鏈結(jié)合蛋白SSB與與M13噬菌體單鏈噬菌體單鏈DNA結(jié)合，在發(fā)夾結(jié)構(gòu)前結(jié)合，在發(fā)夾結(jié)構(gòu)前6 bp處，處，RNA聚合酶合成聚合酶合成 2030個堿基的個堿基的RNA. 破壞發(fā)夾結(jié)構(gòu)；破壞發(fā)夾結(jié)構(gòu)；SSB結(jié)合；結(jié)合；DNA聚合酶聚
25、合酶III在在3OH延長延長DNA鏈。鏈。 DNA聚合酶聚合酶I水解水解RNA，并并補補平缺口，連接酶連接平缺口，連接酶連接。1、M13噬菌體噬菌體priA,priB,priC識別起始點識別起始點在在DnaT幫助下幫助下DnaB,DnaC復(fù)合物結(jié)復(fù)合物結(jié)合形成前引發(fā)體合形成前引發(fā)體引發(fā)體引發(fā)體引發(fā)體可沿著引發(fā)體可沿著DNA鏈移動，在鏈移動，在合適的位點起始合適的位點起始引物引物RNA的合成的合成引發(fā)體的裝配只能在起始點，引發(fā)體的裝配只能在起始點，引物合成可在多處。引物合成可在多處。引發(fā)體移動的方向與引發(fā)體移動的方向與DNADNA鏈鏈延長的方向相反。延長的方向相反。類似岡崎片段的合成類似岡崎片段
26、的合成2、 X174DNAPAS：primosome assembly site 3、大腸桿菌大腸桿菌Hu因子促進復(fù)合物形成因子促進復(fù)合物形成DnaA結(jié)合結(jié)合OriC富含富含AT區(qū)解鏈區(qū)解鏈2DnaB-DnaC復(fù)合物復(fù)合物DnaB解鏈解鏈T抗原識別起始點和解鏈抗原識別起始點和解鏈RFA結(jié)合到單鏈結(jié)合到單鏈DNA拓撲異構(gòu)酶參與下形成前引發(fā)體拓撲異構(gòu)酶參與下形成前引發(fā)體DNApol -引物酶結(jié)合形成引發(fā)體引物酶結(jié)合形成引發(fā)體SV40 DNA復(fù)制的起始復(fù)制的起始ORC：Origin Recognition Complex5、真核生物復(fù)制的起始、真核生物復(fù)制的起始“Licensing mechanis
27、ms”S期期 DNA合成合成MCM：微染色體支持蛋白：微染色體支持蛋白（一）（一） 原核生物原核生物DNADNA鏈的延伸鏈的延伸延伸延伸反應(yīng)反應(yīng)：在在RNARNA引物的引物的OHOH端由端由DNADNA聚合酶聚合酶IIIIII，按堿基互補按堿基互補規(guī)則延伸。規(guī)則延伸。前導鏈的延長前導鏈的延長： 3 355方向這條鏈做模板鏈的方向這條鏈做模板鏈的新鏈合成可以隨著復(fù)制叉向前移動，連續(xù)合成新鏈合成可以隨著復(fù)制叉向前移動，連續(xù)合成（5 5 3 3）。 5 5 3 3 方向這條鏈做模板鏈的新鏈合成則不方向這條鏈做模板鏈的新鏈合成則不能隨著復(fù)制叉向前移動能隨著復(fù)制叉向前移動進行進行連續(xù)合成，只能分連續(xù)合成
28、，只能分段合成一小段，這一小段新合成的段合成一小段，這一小段新合成的DNADNA鏈稱岡鏈稱岡奇片段。每一段新合成的一小段中奇片段。每一段新合成的一小段中有有RNARNA，由由RNARNA酶水解，酶水解，DNADNA聚合酶聚合酶I I補平，補平，最后由連接最后由連接酶酶連接。連接。1 1) DNA) DNA聚合酶不能從頭合成新鏈，只能在聚合酶不能從頭合成新鏈，只能在3 3- -OHOH羥基端延長。復(fù)制羥基端延長。復(fù)制起始起始時的時的3 3- -OHOH羥基端是羥基端是RNARNA。2) 2) 按照堿基互補原則合成新鏈按照堿基互補原則合成新鏈。3)3) 兩條鏈同時復(fù)制，新鏈的延伸方向是兩條鏈同時復(fù)
29、制，新鏈的延伸方向是5 533，一條鏈連續(xù)合成，稱主導鏈，另一條鏈不連一條鏈連續(xù)合成，稱主導鏈，另一條鏈不連續(xù)合成，稱隨從鏈（后隨鏈）。續(xù)合成，稱隨從鏈（后隨鏈）。4) ) 復(fù)制以雙向進行，復(fù)制正在進行的復(fù)制以雙向進行，復(fù)制正在進行的部位稱復(fù)制叉（部位稱復(fù)制叉（ReplicationReplication fork fork）, , 復(fù)制叉從起始點沿著復(fù)制叉從起始點沿著DNADNA移動移動。1、前導鏈的延伸前導鏈的延伸 PolPol 合成一段新鏈合成一段新鏈 在在RFCRFC和和PCNAPCNA協(xié)助下，協(xié)助下， PolPol PolPol 轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)換 由由Pol Pol 完成全部前導鏈的合成完成
30、全部前導鏈的合成2 2、后隨鏈的延伸、后隨鏈的延伸型：細菌 滾環(huán)式滾環(huán)式 X174 D型型 線粒體線粒體DNAA protein: Phage 編碼編碼滾環(huán)可形成多聯(lián)體滾環(huán)可形成多聯(lián)體裸露閉環(huán)雙鏈狀裸露閉環(huán)雙鏈狀 D型復(fù)制型復(fù)制 H鏈：富含鏈：富含G L鏈：富含鏈：富含CDNA聚合酶聚合酶 對于對于線性線性DNA復(fù)制例如復(fù)制例如 噬菌體等比較簡噬菌體等比較簡單，復(fù)制到單，復(fù)制到分子末端終止。分子末端終止。 對于對于環(huán)狀環(huán)狀的大腸桿菌的大腸桿菌DNA復(fù)制和真核生復(fù)制和真核生物的物的DNA復(fù)制就比較復(fù)雜。復(fù)制就比較復(fù)雜。 復(fù)制叉到達終止區(qū)，完成復(fù)制前，復(fù)制暫停。兩個子復(fù)制叉到達終止區(qū)，完成復(fù)制前，
31、復(fù)制暫停。兩個子代代DNA纏繞在一起，需要分開。纏繞在一起，需要分開。 大腸桿菌：大腸桿菌： 有復(fù)制起始點，也有復(fù)制終止點。有復(fù)制起始點，也有復(fù)制終止點。 細菌復(fù)制終止區(qū)含有多個約細菌復(fù)制終止區(qū)含有多個約22bp的終止子的終止子(terminator)位點，位點，E. coli 有有7個終止子位點。個終止子位點。 Tus: Terminus utilization substance 線性線性DNA在復(fù)制完成后，其末端由于引物在復(fù)制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出現(xiàn)縮短，需要在的水解而可能出現(xiàn)縮短，需要在端粒酶端粒酶（telomerase）的催化下，進行延長反應(yīng)。）的催化下，進行延長
32、反應(yīng)。5 3 3 5 5 3 3 5 端粒端粒DNA：端粒酶(telomerase) 依賴RNA的DNA聚合酶,其實質(zhì)是一種逆轉(zhuǎn)錄酶。 能識別特定的端粒重復(fù)序列,以自身RNA的部分序列(5-CUAACCCUAAC- 3)為模板,合成新的端粒重復(fù)序列,使端粒延長，保持染色體的完整 不需要DNA 模板 已知的惡性腫瘤特異性最強的標志，永生細胞 生殖細胞，造血干細胞，ips等非腫瘤細胞 端粒的縮短與衰老端粒酶以自身的RNA為模板，在3端合成DNA序列:RNA引物引物端粒酶的爬行模型端粒酶的爬行模型 上上世紀之初發(fā)現(xiàn)腫瘤世紀之初發(fā)現(xiàn)腫瘤RNARNA病毒病毒。 6464年，年，TeminTemin報道了
33、抑制報道了抑制DNADNA合成的放線菌素合成的放線菌素D D能抑制雞肉瘤能抑制雞肉瘤RNARNA病毒的繁殖病毒的繁殖。 據(jù)此提出雞肉瘤據(jù)此提出雞肉瘤RNARNA病毒的繁殖須經(jīng)過形成病毒的繁殖須經(jīng)過形成DNADNA的階段。的階段。v7 70 0年年Temin Temin 和和Baltimore Baltimore 兩個實驗室同時兩個實驗室同時從從( (雞雞) )勞氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病勞氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNARNA病毒中病毒中發(fā)現(xiàn)，在逆轉(zhuǎn)錄病毒病毒顆粒中存發(fā)現(xiàn)，在逆轉(zhuǎn)錄病毒病毒顆粒中存在著一種以在著一種以RNARNA為模板合成為模板合成DNADNA的酶，稱為的酶，稱
34、為RNARNA指導的指導的DNADNA聚合酶。聚合酶。 遺傳信息從遺傳信息從RNARNA流向流向DNADNA，即以即以RNARNA為模板合成為模板合成DNADNA稱為逆向轉(zhuǎn)錄，因此催化這一反應(yīng)的酶又稱為逆向轉(zhuǎn)錄，因此催化這一反應(yīng)的酶又稱稱逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶。 由逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中由逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中polpol基因編碼。是一種基因編碼。是一種多功能酶多功能酶。 有以有以RNARNA為模板和以為模板和以DNADNA為模板合成為模板合成DNADNA的的DNADNA聚聚合酶活性合酶活性。 需要需要RNARNA或或DNADNA做引物；做引物； 有有核糖核酸酶核糖核酸酶H H的活性（在逆轉(zhuǎn)錄酶的的活性（在
35、逆轉(zhuǎn)錄酶的C C端），端），能從能從3 355和從和從5 533水解水解RNARNA，使使RNARNA與與DNADNA的的雜交體分離。雜交體分離。1 1 用于合成用于合成cDNA. cDNA. 建立建立cDNAcDNA文庫文庫( (cDNA cDNA Library)Library)，獲得基因或探針。獲得基因或探針。2 2 與與PCRPCR連用連用 RT-PCRRT-PCR互補互補DNA（complementary DNA, cDNA） DNADNA復(fù)制是細胞增殖的一個關(guān)鍵事件，因此，復(fù)制是細胞增殖的一個關(guān)鍵事件，因此，DNADNA復(fù)制與細胞分裂是互相協(xié)調(diào)、互相調(diào)控的。復(fù)制與細胞分裂是互相協(xié)調(diào)
36、、互相調(diào)控的。 無論原核還是真核細胞中無論原核還是真核細胞中DNADNA復(fù)制都只發(fā)生在細胞復(fù)制都只發(fā)生在細胞周期中特定時期，在一個細胞周期中，周期中特定時期，在一個細胞周期中，DNADNA必須也必須也只能只能復(fù)制一次復(fù)制一次。1、起始體起始體 （ orisomeorisome，起始復(fù)合物，蛋白質(zhì)，起始復(fù)合物，蛋白質(zhì)- -ori Cori C復(fù)合物）的裝配復(fù)合物）的裝配 參與形成參與形成orisomeorisome的組分：的組分：Dna A, Hu, IHF，F(xiàn)is，Dpi， Ici A， Cnu，Hha，Rob，Seq A，Arc A相互作用相互作用 ：Fis, IHF 調(diào)節(jié)調(diào)節(jié) DnaA-A
37、TP與與oriC oriC 的結(jié)合，的結(jié)合，HUHU調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)DnaA, IHF DnaA, IHF 結(jié)合到結(jié)合到oriC, oriC, 并增強并增強DnaADnaA解鏈能力。解鏈能力。2 2、防止復(fù)制再次起始、防止復(fù)制再次起始(1) Dna A(1) Dna A活性的抑制活性的抑制 Dna A-ADP Dna A-ATPDna A-ADP Dna A-ATP無活性無活性 RIDA RIDA 有活性有活性 RIDA：regulatory inactivation of DnaA ori C(2) 降低游離形式的降低游離形式的Dna A水平水平Dna A結(jié)合位點結(jié)合位點 dat A區(qū)區(qū)在復(fù)制后極短
38、時間內(nèi)降低在復(fù)制后極短時間內(nèi)降低 Dna A 水平水平可以結(jié)合可以結(jié)合300分子的分子的Dna A(3)(3)隔離隔離 ori Cori C ori CGATCCTAG甲基化甲基化未甲基化未甲基化摸板鏈摸板鏈新合成鏈新合成鏈Seq A 特異識別特異識別,并結(jié)合于半甲基化并結(jié)合于半甲基化ori C 的的GATC序列序列,使使ori C被隔離被隔離,防止復(fù)制再次發(fā)生防止復(fù)制再次發(fā)生1 1、DNADNA復(fù)制起始的調(diào)控復(fù)制起始的調(diào)控2 2、細胞周期監(jiān)控點機制、細胞周期監(jiān)控點機制主要調(diào)控復(fù)制的起始1 1、復(fù)制起始點的選擇復(fù)制起始點的選擇 復(fù)制起始點數(shù)量的調(diào)控復(fù)制起始點數(shù)量的調(diào)控 真核細胞有多個復(fù)制起始點
39、，起用多少起真核細胞有多個復(fù)制起始點，起用多少起始點決定于始點決定于S S期的長短。期的長短。 S S期短，起始點多。期短，起始點多。S S期長，起始點少。期長，起始點少。 遺傳性起始點：遺傳性起始點： DNADNA上的起始元件上的起始元件 功能性起始點：功能性起始點： 實際起始點實際起始點 遺傳性起始點多于功能性起始點遺傳性起始點多于功能性起始點 酵 母 ： 自 主 復(fù) 制 序 列 （酵 母 ： 自 主 復(fù) 制 序 列 （ a u t o n o m o u s l y a u t o n o m o u s l y replicating sequeences, ARS)replicati
40、ng sequeences, ARS) 酵母細胞酵母細胞3 3號染色體上有號染色體上有1414個遺傳性復(fù)制起始個遺傳性復(fù)制起始點，只有點，只有6 6個功能性復(fù)制起始點。個功能性復(fù)制起始點。 將將Ura4Ura4基因處的強復(fù)制起始點突變后，在其附基因處的強復(fù)制起始點突變后，在其附近的弱復(fù)制起始點就成為強復(fù)制起始點。近的弱復(fù)制起始點就成為強復(fù)制起始點。 Ura4Ura4：乳清苷酸脫羧酶乳清苷酸脫羧酶 CHOCHO細胞核細胞核 蟾蜍卵細胞抽提物蟾蜍卵細胞抽提物 損壞損壞CHOCHO細胞核或細胞核或 裸露裸露DNADNA 非隨機起始，同正常非隨機起始，同正常 隨機起始隨機起始CHOCHO細胞細胞 復(fù)制
41、起始點的選擇與細胞核或染色體結(jié)構(gòu)密切相關(guān)復(fù)制起始點的選擇與細胞核或染色體結(jié)構(gòu)密切相關(guān)（1 1）復(fù)制的允許機制（）復(fù)制的允許機制（Licensing modelLicensing model） （2）蛋白激酶的調(diào)控）蛋白激酶的調(diào)控 蟾蜍卵細胞蟾蜍卵細胞 Licensing controlLicensing control 復(fù)制復(fù)制外源細胞核外源細胞核復(fù)制后，復(fù)制后，Licensing Factor失活，失活的失活，失活的Licensing Factor不能再次啟動復(fù)制。核不能再次啟動復(fù)制。核膜破裂后（細胞分裂后），新的膜破裂后（細胞分裂后），新的Licensing Factor進入核，啟動下一周
42、期進入核，啟動下一周期的的DNA復(fù)制。復(fù)制。真核細胞復(fù)制起始絕對必須的蛋白激酶：真核細胞復(fù)制起始絕對必須的蛋白激酶： CDK 和和 Cdc7-Dbf4激酶激酶(1)、前復(fù)制起始復(fù)合物前復(fù)制起始復(fù)合物的形成的形成 組成成分：組成成分：ORC(Origin Recognition Complex) 含含6種種蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)，Cdc6，RLF （Replication Licensing Factor, 復(fù)制允許因子）。復(fù)制允許因子）。(2)、CDK激活激活前前復(fù)制起始復(fù)合物復(fù)制起始復(fù)合物 復(fù)制前復(fù)合物復(fù)制前復(fù)合物受蛋白激酶的調(diào)控，或變成受蛋白激酶的調(diào)控，或變成起始復(fù)合物起始復(fù)合物，起始復(fù)制，或在復(fù)
43、制過程中轉(zhuǎn)變成起始復(fù)制，或在復(fù)制過程中轉(zhuǎn)變成復(fù)制后復(fù)合物復(fù)制后復(fù)合物，就，就再也不能啟動復(fù)制。再也不能啟動復(fù)制。 CDK（CyclinDependent), Cdc7-Dbf4激酶，激酶， 蛋白激酶蛋白激酶A，蛋白磷酸蛋白磷酸酶酶2A，都參與復(fù)制的起始，在不同階段起作用。都參與復(fù)制的起始，在不同階段起作用。前復(fù)制起始復(fù)合物前復(fù)制起始復(fù)合物（pre-replicative complexpre-replicative complex，pre-RC) pre-RC) （在遺傳性復(fù)制起始點裝配）（在遺傳性復(fù)制起始點裝配） CDKCDK起始復(fù)合物（起始復(fù)合物（Replicative Complex,R
44、C) Replicative Complex,RC) （在功能性復(fù)制起始點形成）（在功能性復(fù)制起始點形成）在在G1G1期向期向S S期過渡期間，期過渡期間，CDKCDK活性很高?；钚院芨?。 識別識別DNADNA損傷或損傷或DNADNA復(fù)制阻斷，通過復(fù)雜復(fù)制阻斷，通過復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導途徑，阻斷細胞周期，啟動修復(fù)機的信號轉(zhuǎn)導途徑，阻斷細胞周期，啟動修復(fù)機制，恢復(fù)基因組的完整性，修復(fù)后再進入細胞制，恢復(fù)基因組的完整性，修復(fù)后再進入細胞周期。周期。在長期進化過程在長期進化過程中，細胞形成一中，細胞形成一套保證細胞周期套保證細胞周期中中DNA復(fù)制和染復(fù)制和染色體分配質(zhì)量的色體分配質(zhì)量的檢查機制，即細檢查機
45、制，即細胞周期檢查點胞周期檢查點(1) G1 S S期檢查點期檢查點查看查看DNADNA有無損傷有無損傷 DNA damage checkpointDNA damage checkpoint 細胞周期暫時減慢或停止。細胞周期暫時減慢或停止。查看查看DNADNA復(fù)制的進度復(fù)制的進度 DNA replication DNA replication checkpointcheckpoint 限制限制DNADNA復(fù)制速度復(fù)制速度(2) G2 M 管理染色體的正確分配管理染色體的正確分配 Spindle Spindle assembly checkpointassembly checkpointDNA
46、損傷類型和產(chǎn)生原因1. 點突變 DNA聚合酶復(fù)制錯誤產(chǎn)生堿基自發(fā)的突變：堿基自發(fā)的突變：2. 缺失或插入 核苷酸的缺失或插入 堿基的缺失3. 化學修飾 氧化，甲基化，烷化4. DNA分子交聯(lián) 順鉑，順鉑，絲裂酶素絲裂酶素5. DNA分子斷裂DNA單鏈斷裂DNA雙鏈斷裂：射線，重金屬， 病毒整合，DNA重排1. 核苷酸修復(fù) dGTP氧化產(chǎn)生8氧代dGTP 8oxodG 8氧代dGTP三磷酸脂酶 水解 該酶突變：A：TC：G突變高10010000倍2. 直接修復(fù)O6甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT） 光修復(fù)光修復(fù)3. 堿基切除修復(fù)DNA轉(zhuǎn)葡糖基酶轉(zhuǎn)葡糖基酶 4. 核苷酸切除修復(fù)5. 錯配修復(fù)6
47、. DNA鏈斷裂的修復(fù)非同源末端連接 non-homologous end-joining同源重組修復(fù)同源重組修復(fù) homologous recombination7. 大腸桿菌SOS修復(fù)Lex A， Rec A修復(fù)完成后，修復(fù)完成后，DinI蛋白抑制蛋白抑制RecA作用作用 （1）G1期期checkpoint，確保，確保DNA損傷不被復(fù)制。這一階段損傷不被復(fù)制。這一階段，DNA損傷激活蛋白激酶損傷激活蛋白激酶ATM，ATR和和cABL，導致，導致P53的磷酸化，并進一步上調(diào)的磷酸化，并進一步上調(diào)P21 WAF1表達水平。表達水平。P21可以結(jié)合可以結(jié)合cyclin-CDK從而調(diào)節(jié)細胞周期。同
48、時從而調(diào)節(jié)細胞周期。同時DNA損傷誘導損傷誘導Cdc25A的泛素化和降解，從而阻止細胞周期進行；的泛素化和降解，從而阻止細胞周期進行； （2）S期期checkpoint，主要是當，主要是當DNA損傷在損傷在G1期沒有能夠進期沒有能夠進行修復(fù)時防止行修復(fù)時防止DNA復(fù)制；復(fù)制； （3）G2期期checkpoint，主要功能是當細胞在，主要功能是當細胞在S期晚期或者期晚期或者G2期期DNA受到損傷時，阻止細胞分離，從而防止受到損傷時，阻止細胞分離，從而防止DNA損傷傳遞損傷傳遞到子代細胞中；到子代細胞中； （4）M期期checkpoint，細胞在，細胞在M期染色質(zhì)將發(fā)生固縮形成紡期染色質(zhì)將發(fā)生固縮
49、形成紡錘體結(jié)構(gòu)，在后期姐妹染色體發(fā)生分離。當染色體受到損傷錘體結(jié)構(gòu)，在后期姐妹染色體發(fā)生分離。當染色體受到損傷時，細胞停滯在時，細胞停滯在M期，染色體重新恢復(fù)到染色質(zhì)，從而使細期，染色體重新恢復(fù)到染色質(zhì)，從而使細胞有機會對胞有機會對DNA損傷進行修復(fù)后再進入損傷進行修復(fù)后再進入M期。期。 DNA損傷損傷ATM/ATR絲絲/蘇氨酸激酶蘇氨酸激酶CHK1，CHK2，P53等等抗凋亡基因抗凋亡基因 凋亡相關(guān)基因凋亡相關(guān)基因線粒體膜通透性升高，細胞線粒體膜通透性升高，細胞色素色素C釋放，激活釋放，激活Caspase細胞凋亡細胞凋亡 外源性因素：UV，射線，化學試劑等 內(nèi)源性因素：線粒體呼吸鏈產(chǎn)生活性氧
50、 reactive oxygen species（ROS），NO 50000個損傷/天細胞 小分子如谷胱甘肽清除自由基 超氧化物歧化酶（SOD）：清除羥基自由基等 缺失導致腫瘤發(fā)生 遺傳基因的突變，造成出生缺陷 腫瘤 影響細胞代謝，衰老 DNA損傷修復(fù)缺陷：胚胎致死或嚴重疾病 MEF細胞體外培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化：DNA氧化損傷 NIH3T3成纖維細胞過表達NADPH 氧化酶增加細胞內(nèi)過氧化物等產(chǎn)生，將促進細胞轉(zhuǎn)化 過氧化物攻擊過氧化物攻擊DNADNA， 合成前體合成前體 隱性遺傳性疾病 核苷酸切除修復(fù)相關(guān)基因突變核苷酸切除修復(fù)相關(guān)基因突變 對于光照極度敏感 患皮膚癌的幾率比常人高2000倍 同源重組修復(fù)的缺陷同源重組修復(fù)的缺陷 DNA斷裂或者交聯(lián)形成損傷進行修復(fù)，其中FANC蛋白的突變將導致貧血 造血功能降低，并伴有身體的畸形 對DNA交聯(lián)試劑如絲裂霉素C，順鉑敏感
分子遺傳學：第三章DNA的生物合成
