《生物化學：第10章 DNA的生物合成(復制)》由會員分享，可在線閱讀，更多相關《生物化學：第10章 DNA的生物合成(復制)（122頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。
1、目目 錄錄DNA的生物合成的生物合成( (復制復制) ) DNA Biosynthesis，Replication 第第 十十 章章目目 錄錄目目 錄錄復制復制( (replication)是指遺傳物質的傳代，以母鏈是指遺傳物質的傳代，以母鏈DNA為模板為模板合成子鏈合成子鏈DNA的過程。的過程。復制復制親代親代DNA子代子代DNA目目 錄錄復制的基本規(guī)律復制的基本規(guī)律Basic Rules of DNA Replication 第一節(jié)第一節(jié)目目 錄錄l復制的方式復制的方式半保留復制半保留復制(semi-conservative replication)l復制的高保真性復制的高保真性(high
2、 fidelity) l雙向復制雙向復制(bidirectional replication)l半不連續(xù)復制半不連續(xù)復制(semi-discontinuous replication) 目目 錄錄一、半保留復制的實驗依據(jù)和意義一、半保留復制的實驗依據(jù)和意義 DNA生物合成時，母鏈生物合成時，母鏈DNA解開為兩股單鏈，解開為兩股單鏈，各自作為模板各自作為模板(template)按堿基配對規(guī)律，合成與模按堿基配對規(guī)律，合成與模板互補的子鏈。子代細胞的板互補的子鏈。子代細胞的DNA，一股單鏈從親代，一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股單鏈則完全從新合成。兩完整地接受過來，另一股單鏈則完全從新合成。兩
3、個子細胞的個子細胞的DNA都和親代都和親代DNA堿基序列一致。這種堿基序列一致。這種復制方式稱為復制方式稱為半保留復制半保留復制(semi-conservativereplication。半保留復制的概念半保留復制的概念 definition of DNA semi-conservative replicationAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈母鏈D
4、NA 復制過程中形成復制過程中形成的復制叉的復制叉子代子代DNA 目目 錄錄目目 錄錄子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 目目 錄錄密度梯度實驗密度梯度實驗 實驗結果支持實驗結果支持半保留復制半保留復制的設想。的設想。含重氮含重氮-DNA的細菌的細菌培養(yǎng)于普培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液通培養(yǎng)液 第一代第一代繼續(xù)培養(yǎng)于繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液普通培養(yǎng)液 第二代第二代梯度離心結果梯度離心結果目目 錄錄按半保留復制方式，子代按半保留復制方式，子代DNA與親代與親代DNA A的的堿基序列一致堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺，即子
5、代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性保守性。半保留復制的意義半保留復制的意義 Significance ofDNA semi-conservative replication 遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎，遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎，但但不是絕對的不是絕對的。目目 錄錄目目 錄錄原核生物復制時，原核生物復制時，DNA從從起始點起始點(origin)向兩個向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向相反的復制叉，稱為方向解鏈，形成兩個延伸方向相反的復制叉，稱為雙向復制雙向復制 bidirectional replication。 二、雙向復制二、雙向復制 bi
6、directional replication復制中的放射自顯影圖象復制中的放射自顯影圖象目目 錄錄A. 環(huán)狀雙鏈環(huán)狀雙鏈DNA及復制起始點及復制起始點B. 復制中的兩個復制叉復制中的兩個復制叉C. 復制接近終止點復制接近終止點(termination, ter)oriterA B C目目 錄錄真核生物每個染色體有多個起始點，是多真核生物每個染色體有多個起始點，是多復制子的復制。復制子的復制。習慣上把兩個相鄰起始點之間的距離定為習慣上把兩個相鄰起始點之間的距離定為一個一個復制子復制子(replicon) 。復制子是獨立完成復。復制子是獨立完成復制的功能單位。制的功能單位。 目目 錄錄53ori
7、orioriori535533553復制子復制子3目目 錄錄三、復制的半不連續(xù)性三、復制的半不連續(xù)性semi-discontinuous replication3 5 3 5 解鏈方向解鏈方向3 5 3 3 5 領頭鏈領頭鏈(leading strand)隨從鏈隨從鏈(lagging strand)目目 錄錄順著解鏈方向生成的子鏈，復制是連續(xù)進行的，順著解鏈方向生成的子鏈，復制是連續(xù)進行的，這股鏈稱為這股鏈稱為領頭鏈領頭鏈(leading strand)。另一股鏈因為復制的方向與解鏈方向相反，不能另一股鏈因為復制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復制的鏈稱順著解鏈方向連
8、續(xù)延長，這股不連續(xù)復制的鏈稱為為隨從鏈隨從鏈(lagging strand)。復制中的不連續(xù)片段。復制中的不連續(xù)片段稱為稱為岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment)。 領頭鏈連續(xù)復制而隨從鏈不連續(xù)復制，就是復制領頭鏈連續(xù)復制而隨從鏈不連續(xù)復制，就是復制的的半不連續(xù)性半不連續(xù)性(semi-discontinuous replication 。 目目 錄錄目目 錄錄 DNA復制的酶學復制的酶學The Enzymology of DNA Replication第二節(jié)第二節(jié)目目 錄錄參與參與DNA復制的物質復制的物質 底物底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, d
9、TTP聚合酶聚合酶(polymerase): 依賴依賴DNA的的DNA聚合酶，簡寫聚合酶，簡寫 為為 DNA-pol模板模板(template) : 解開成單鏈的解開成單鏈的DNA母鏈母鏈引物引物(primer): 提供提供3 -OH末端使末端使dNTP可以依次聚合可以依次聚合 其他的酶和蛋白質因子其他的酶和蛋白質因子 一、復制的化學反應一、復制的化學反應 chemical reaction of replication(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi 目目 錄錄目目 錄錄聚合反應的特點聚合反應的特點DNA 新鏈生成需新鏈生成需引物引物和和模板模板； 新鏈的延長只可
10、沿新鏈的延長只可沿5 3 方向進行方向進行 。目目 錄錄二、二、DNA聚合酶聚合酶全稱：全稱：依賴依賴DNA的的DNA聚合酶聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)簡稱：簡稱：DNA-pol活性：活性：1. 53 的聚合活性的聚合活性2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性 5 3 外切酶活性外切酶活性?能切除突變的能切除突變的 DNA片段。片段。能辨認錯配的堿基對，并將其水解
11、。能辨認錯配的堿基對，并將其水解。 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 目目 錄錄目目 錄錄（一）原核生物的（一）原核生物的DNA聚合酶聚合酶DNA-pol DNA-pol DNA-pol 目目 錄錄（一）原核生物（一）原核生物( (prokaryotic)的的DNA聚合酶聚合酶可能可能不可能不可能可能可能基因突變后的致死性基因突變后的致死性無無無無有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性20？400分子數(shù)分子數(shù)/細胞細胞多亞基不對稱多亞基不對稱二聚體二聚體？單肽鏈單肽鏈組成組成250120109分子量分子量(kD)DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I可能可能不可能不可能可能
12、可能基因突變后的致死性基因突變后的致死性無無無無有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性20？400分子數(shù)分子數(shù)/細胞細胞多亞基不對稱多亞基不對稱二聚體二聚體？單肽鏈單肽鏈組成組成250120109分子量分子量(kD)DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I目目 錄錄功能功能：對復制中的錯誤進行校讀，對復制和對復制中的錯誤進行校讀，對復制和修復中出現(xiàn)的空隙進行填補。修復中出現(xiàn)的空隙進行填補。DNA-pol （109kD）目目 錄錄323個氨基酸個氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604個氨基酸個氨基酸DNA聚合酶活性聚合
13、酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是實驗室合成片段是實驗室合成DNA，進行，進行分子生物學研究中常用的工具酶。分子生物學研究中常用的工具酶。 目目 錄錄DNA-pol （120kD） DNA-pol II基因發(fā)生突變，細菌依然能存活?；虬l(fā)生突變，細菌依然能存活。 它參與它參與DNA損傷的應急狀態(tài)修復。損傷的應急狀態(tài)修復。 目目 錄錄功能功能是原核生物復制延長中真正起催化作用的酶。是原核生物復制延長中真正起催化作用的酶。 DNA-pol (250kD)目目 錄錄（二）真核生物（二）真核生物( (eukaryotic)的的
14、DNADNA聚合酶聚合酶DNA-pol 起始引發(fā)，有引物酶活性。起始引發(fā)，有引物酶活性。延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。參與低保真度的復制參與低保真度的復制 。在復制過程中起校讀、修復和填補缺在復制過程中起校讀、修復和填補缺口的作用?？诘淖饔谩Ｔ谠诰€粒體線粒體DNA復制中起催化作用。復制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 目目 錄錄（二）真核生物的（二）真核生物的DNA聚合酶聚合酶填補引物填補引物空隙，切空隙，切除修復，除修復，重組重組延長子延長子鏈的主鏈的主要酶，要酶，解螺旋解螺旋酶活性酶活性線粒體線粒體DNA復復
15、制制低保低保真度真度的復的復制制起始引起始引發(fā)，引發(fā)，引物酶活物酶活性性功能功能+-3 5 核酸外切核酸外切酶活性酶活性高高高高高高？中中5 3 聚合活性聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（分子量（kD）DNA-pol填補引物填補引物空隙，切空隙，切除修復，除修復，重組重組延長子延長子鏈的主鏈的主要酶，要酶，解螺旋解螺旋酶活性酶活性線粒體線粒體DNA復復制制低保低保真度真度的復的復制制起始引起始引發(fā)，引發(fā)，引物酶活物酶活性性功能功能+-3 5 核酸外切核酸外切酶活性酶活性高高高高高高？中中5 3 聚合活性聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（分子量（kD）DN
16、A-pol目目 錄錄目目 錄錄三、復制保真性的酶學依據(jù)三、復制保真性的酶學依據(jù)復制按照堿基配對規(guī)律進行，是遺傳信息能準復制按照堿基配對規(guī)律進行，是遺傳信息能準確傳代的基本原理。確傳代的基本原理。復制保真性的酶學機制：復制保真性的酶學機制：（一）（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及時校讀的核酸外切酶活性和及時校讀 （二）復制的保真性和堿基選擇（二）復制的保真性和堿基選擇目目 錄錄（一）（一）DNA-pol的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性 和及時校讀和及時校讀(A：DNA-pol的外切酶活性切除錯配堿基；并用的外切酶活性切除錯配堿基；并用其聚合活性摻入正確配對的底物。其聚合活性摻入正確配對的底
17、物。B：堿基配對正確，：堿基配對正確， DNA-pol不表現(xiàn)活性。不表現(xiàn)活性。目目 錄錄（二）復制的保真性和堿基選擇（二）復制的保真性和堿基選擇 DNA聚合酶靠其大分子結構協(xié)調非共價（氫鍵）聚合酶靠其大分子結構協(xié)調非共價（氫鍵）與共價（磷酸二酯鍵）鍵的有序形成。與共價（磷酸二酯鍵）鍵的有序形成。 嘌呤的化學結構能形成順式和反式構型，與相應嘌呤的化學結構能形成順式和反式構型，與相應的嘧啶形成氫鍵配對，嘌呤應處于的嘧啶形成氫鍵配對，嘌呤應處于反式構型反式構型。 目目 錄錄1. 遵守嚴格的堿基配對規(guī)律；遵守嚴格的堿基配對規(guī)律；2. 聚合酶在復制延長時對堿基的選擇功能；聚合酶在復制延長時對堿基的選擇功
18、能；3. 復制出錯時復制出錯時DNA-pol的及時校讀功能。的及時校讀功能。DNA復制的保真性至少要依賴三種機制復制的保真性至少要依賴三種機制 目目 錄錄目目 錄錄四、復制中的分子解鏈及四、復制中的分子解鏈及DNA 分子拓撲學變化分子拓撲學變化 strands separating and topo-structure change of DNADNA分子的堿基埋在雙螺旋內部，只有把分子的堿基埋在雙螺旋內部，只有把DNA解成單鏈，它才能起模板作用。解成單鏈，它才能起模板作用。目目 錄錄（一）解螺旋酶（一）解螺旋酶(helicase) 、引物酶、引物酶(primase) 和單鏈和單鏈DNA結合蛋
19、白結合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB)理順理順DNA鏈鏈拓撲異構酶拓撲異構酶 (gyrA, B)穩(wěn)定已解開的單鏈穩(wěn)定已解開的單鏈單鏈單鏈DNA結合蛋白結合蛋白SSB催化催化RNA引物生成引物生成引物酶引物酶DnaG (dnaG)運送和協(xié)同運送和協(xié)同DnaBDnaC (dnaC)解開解開DNA雙鏈雙鏈解螺旋酶解螺旋酶DnaB (dnaB)辨認起始點辨認起始點DnaA (dnaA)蛋白質（基因）蛋白質（基因）通用名通用名功能功能原核生物復制起始的相關蛋白質原核生物復制起始的相關蛋白質E. Coli 基因圖基因圖目目 錄錄目目 錄錄 解螺旋酶解
20、螺旋酶(helicase)利用利用ATP供能，作用于氫鍵，使供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈雙鏈解開成為兩條單鏈解開成為兩條單鏈 引物酶引物酶(primase)復制起始時催化生成復制起始時催化生成RNA引物的酶引物的酶 單鏈單鏈DNA結合蛋白結合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB)在復制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護單在復制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護單鏈的完整鏈的完整 目目 錄錄目目 錄錄1010 8 8 局部解鏈后局部解鏈后（二）（二）DNA拓撲異構酶拓撲異構酶(DNA topoisomerase) 解鏈過程中正超螺旋的形成解鏈過程中正超螺旋
21、的形成目目 錄錄目目 錄錄拓撲異構酶作用特點拓撲異構酶作用特點既能水解既能水解 、又能連接磷酸二酯鍵、又能連接磷酸二酯鍵 拓撲異構酶拓撲異構酶拓撲異構酶拓撲異構酶分分 類類目目 錄錄拓撲異拓撲異構酶構酶切斷切斷DNA雙鏈中雙鏈中一股一股鏈，使鏈，使DNA解鏈旋轉不致打結；適當時候封解鏈旋轉不致打結；適當時候封閉切口，閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應反應不需不需ATP。拓撲異拓撲異構酶構酶切斷切斷DNA分子分子兩股兩股鏈，斷端通過鏈，斷端通過切口旋轉使超螺旋松弛。切口旋轉使超螺旋松弛。利用利用ATP供能，連接斷端，供能，連接斷端， DNA分子進入負超螺旋狀態(tài)。分子進入負超螺旋狀態(tài)。作
22、用機制作用機制 目目 錄錄目目 錄錄五、五、DNA連接酶連接酶(DNA ligase)連接連接DNA鏈鏈3 -OH末端和相鄰末端和相鄰DNA鏈鏈5 -P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。鏈連接成一條完整的鏈。 DNA連接酶連接酶(DNA ligase)作用方式作用方式POO-O-OHO5POO-O-O335DNA連接酶連接酶ATPADP5353目目 錄錄目目 錄錄DNA連接酶在復制中起最后接合缺口的連接酶在復制中起最后接合缺口的作用。作用。在在DNA修復、重組及剪接中也起縫合缺修復、重組及剪接中也起縫合缺口作用。
23、口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。也是基因工程的重要工具酶之一。功能功能目目 錄錄目目 錄錄DNA生物合成過程生物合成過程The Process of DNA Replication第三節(jié)第三節(jié)目目 錄錄（一）復制的起始（一）復制的起始initiation of DNA replication需要解決兩個問題：需要解決兩個問題：1. DNA解開成單鏈，提供模板。解開成單鏈，提供模板。2. 合成引物，提供合成引物，提供3 -OH末端。末端。一、原核生物的一、原核生物的DNA生物合成生物合成 prokaryotic DNA replication process目目 錄錄E.coli復制起始點
24、復制起始點 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串聯(lián)重復序列串聯(lián)重復序列 反向重復序列反向重復序列5 3 5 3 1. DNA解鏈解鏈(strands separating目目 錄錄 Dna A Dna B、 Dna CDNA拓撲異構酶拓撲異構酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5
25、2. 引發(fā)體和引物引發(fā)體和引物 (prisome含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNA復制起始區(qū)域的復合結構稱為引發(fā)體。復制起始區(qū)域的復合結構稱為引發(fā)體。 目目 錄錄3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短鏈引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。分子。 引物引物3 HO5引物引物酶酶目目 錄錄（二）復制的延長（二）復制的延長 (elongation of DNA replication復制的延長指在復制的延長指在DNA-pol催化下，催化下，dNTP以以dNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，其化學本質是磷酸二酯鍵的不
26、斷生成。其化學本質是磷酸二酯鍵的不斷生成。 目目 錄錄 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-pol目目 錄錄領頭鏈領頭鏈(leading strand )(leading strand )的合成的合成目目 錄錄隨從鏈隨從鏈(lagging strand)(lagging strand)的合成的合成目目 錄錄目目 錄錄目目 錄錄階段一階段一階段二階段二目目 錄錄階段三階段三階段四階段四復復制制過過程程簡簡圖圖目目 錄錄目目 錄錄復復 制制 過過 程程 動動 畫畫目目 錄錄 原核生物基因是環(huán)狀原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復制的
27、復制，雙向復制的復制片段在復制的終止點片段在復制的終止點(ter)處匯合。處匯合。oriter E.coli8232 ori terSV40500（三）復制的終止（三）復制的終止 ( (termination of DNA replication目目 錄錄5 5 5 RNA酶酶OHP5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA連接酶連接酶 隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接目目 錄錄目目 錄錄目目 錄錄哺乳動物的哺乳動物的細胞周期細胞周期DNA合成期合成期G1G2SM二、真核生物的二、真核生物的DNA生物合成生物合成eukaryotic DNA r
28、eplication process 細胞能否分裂，決定于進入細胞能否分裂，決定于進入S期及期及M期這兩個關期這兩個關鍵點。鍵點。G1S及及G2M的調節(jié)，與蛋白激酶活的調節(jié)，與蛋白激酶活性有關。性有關。 蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復制因子而蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復制因子而實施調控作用。實施調控作用。 目目 錄錄 真核生物每個染色體有多個起始點，是多復制子真核生物每個染色體有多個起始點，是多復制子復制。復制。復制有時序性復制有時序性，即復制子以分組方式激活，即復制子以分組方式激活而不是同步起動。而不是同步起動。 復制的起始需要復制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）和（引物酶活
29、性）和pol（解螺旋酶活性）參與。還需拓撲酶和復制因子（解螺旋酶活性）參與。還需拓撲酶和復制因子(replication factor, RF)。 增殖細胞核抗原增殖細胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在復制起始和延長中起關鍵作用。在復制起始和延長中起關鍵作用。 （一）復制的起始（一）復制的起始 ( (initiation of DNA replication目目 錄錄3 5 5 3 領頭鏈領頭鏈3 5 3 5 親代親代DNA隨從鏈隨從鏈引物引物核小體核小體（二）復制的延長（二）復制的延長 ( (elongation of DNA re
30、plication目目 錄錄 染色體染色體DNA呈線狀，復制在末端停止。呈線狀，復制在末端停止。 復制中岡崎片段的連接，復制子之間的連接。復制中岡崎片段的連接，復制子之間的連接。 染色體兩端染色體兩端DNA子鏈上最后復制的子鏈上最后復制的RNA引物，引物，去除后留下空隙。去除后留下空隙。（三）復制的終止（三）復制的終止 ( (termination of DNA replication5 3 3 5 5 3 3 5 +5 3 3 3 3 5 5 目目 錄錄目目 錄錄目目 錄錄切除引物的兩種機制切除引物的兩種機制目目 錄錄目目 錄錄目目 錄錄目目 錄錄目目 錄錄 端粒端粒(telomere)指真
31、核生物染色體線性指真核生物染色體線性DNA分子末端的結構。分子末端的結構。功能功能 維持染色體的穩(wěn)定性維持染色體的穩(wěn)定性 維持維持DNA復制的完整性復制的完整性結構特點結構特點 由末端單鏈由末端單鏈DNA序列和蛋白質構成。序列和蛋白質構成。 末端末端DNA序列是多次重復的富含序列是多次重復的富含G、C堿基堿基的短的短 序列。序列。TTTTGGGGTTTTGGGG目目 錄錄端粒酶端粒酶(telomerase) 端粒酶端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶協(xié)同蛋白端粒酶協(xié)同蛋白(human telomerase associated protein 1, hT
32、P1) 端粒酶逆轉錄酶端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 組成組成端粒酶的催端粒酶的催化延長作用化延長作用爬爬行行模模型型目目 錄錄DNADNA聚合酶復制子鏈聚合酶復制子鏈進一步加工進一步加工目目 錄錄目目 錄錄目目 錄錄目目 錄錄逆轉錄和其他復制方式逆轉錄和其他復制方式Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways第四節(jié)第四節(jié)目目 錄錄逆轉錄酶逆轉錄酶(reverse transcriptase) 逆轉錄逆轉錄(reverse transcription) 逆轉錄
33、逆轉錄酶酶一、逆轉錄病毒和逆轉錄酶一、逆轉錄病毒和逆轉錄酶( (reverse transcription virus and reverse transcriptase目目 錄錄逆轉錄病毒細胞內的逆轉錄現(xiàn)象逆轉錄病毒細胞內的逆轉錄現(xiàn)象RNA 模板模板逆轉錄酶逆轉錄酶DNA-RNA 雜雜化雙鏈化雙鏈RNA酶酶單鏈單鏈DNA逆轉錄酶逆轉錄酶雙鏈雙鏈DNA目目 錄錄逆轉錄酶逆轉錄酶 A AA A T T T TAAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶堿水解堿水解 T T T T分子生物學研究可應用逆分子生物學研究可應用逆轉錄酶，作為獲取基因工程目轉錄酶，作為獲取基因工程目的基因的重要方法之
34、一，此法的基因的重要方法之一，此法稱為稱為cDNA法。法。 以以mRNA為模板，經(jīng)逆轉為模板，經(jīng)逆轉錄合成的與錄合成的與mRNA堿基序列互堿基序列互補的補的DNA鏈。鏈。 試管內合成試管內合成cDNAcDNA complementary DNA 目目 錄錄 二、逆轉錄研究的意義二、逆轉錄研究的意義 significance of study on reverse transcription逆轉錄酶和逆轉錄現(xiàn)象，是分子生物學研究中逆轉錄酶和逆轉錄現(xiàn)象，是分子生物學研究中的重大發(fā)現(xiàn)。的重大發(fā)現(xiàn)。 逆轉錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，逆轉錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，RNA同樣同樣兼有遺傳信息傳代與表達功
35、能。兼有遺傳信息傳代與表達功能。對逆轉錄病毒的研究，拓寬了對逆轉錄病毒的研究，拓寬了20世紀初已注意世紀初已注意到的病毒致癌理論。到的病毒致癌理論。 目目 錄錄目目 錄錄 滾環(huán)復制滾環(huán)復制(rolling circle replication) 三、滾環(huán)復制和三、滾環(huán)復制和D環(huán)復制環(huán)復制 (rolling circle replication and D-loop replication是某些低等生物的復制形式，如是某些低等生物的復制形式，如 X174和和M13噬菌體等。噬菌體等。3 -OH5 -P5 5 5 3 3 3 3 5滾環(huán)復制滾環(huán)復制5 5 3 3 5 目目 錄錄目目 錄錄dNTPD
36、NA-pol D環(huán)復制環(huán)復制(D-loop replication) 是線粒體是線粒體DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)的復制形式。的復制形式。 目目 錄錄目目 錄錄DNA損傷（突變）與修復損傷（突變）與修復DNA Damage (Mutation) and Repair第五節(jié)第五節(jié)目目 錄錄遺傳物質的結構改變而引起的遺傳信息遺傳物質的結構改變而引起的遺傳信息改變，均可稱為改變，均可稱為突變突變(mutation)。在復制過程中發(fā)生的在復制過程中發(fā)生的DNA突變稱為突變稱為DNA損傷損傷(DNA damage)。從分子水平來看，突變就是從分子水平來看，突變就是DNA分子
37、上分子上堿基的改變。堿基的改變。 目目 錄錄目目 錄錄一、突變的意義一、突變的意義significance of mutation（一）突變是進化、分化的分子基礎（一）突變是進化、分化的分子基礎（二）突變導致基因型改變（二）突變導致基因型改變（三）突變導致死亡（三）突變導致死亡（四）突變是某些疾病的發(fā)病基礎（四）突變是某些疾病的發(fā)病基礎 目目 錄錄二、引發(fā)突變的因素二、引發(fā)突變的因素factors causing mutation物理因素物理因素 紫外線紫外線(ultra violet, UV)、各種輻射、各種輻射 UV化學因素化學因素 chemical factors常見的化學誘變劑常見的化
38、學誘變劑化合物類別化合物類別作作 用用 點點分子改變分子改變堿基類似物堿基類似物如：如：5-BUA 5-BU G- A - T - G - C -羥胺類（羥胺類（NH2OH）T C- T - A - C - G -亞硝酸鹽（亞硝酸鹽（NO2）C U- G - C - A - T -烷化劑烷化劑如：氮芥類，如：氮芥類，NitrominsG mGG mGDNA缺失缺失G目目 錄錄目目 錄錄三、突變的分子改變類型三、突變的分子改變類型kinds of mutated molecules changing錯配錯配 (mismatch)缺失缺失 (deletion)插入插入 (insertion)重排重
39、排 (rearrangement)框移框移(frame-shift) 目目 錄錄DNA分子上的堿基錯配稱分子上的堿基錯配稱點突變點突變(point mutation)。發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。 1. 轉換轉換發(fā)生在異型堿基之間，即嘌呤變嘧啶發(fā)生在異型堿基之間，即嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤?；蜞奏ぷ冟堰?。 2. 顛換顛換（一）錯配（一）錯配( (mismatch)目目 錄錄鐮形紅細胞貧血病人鐮形紅細胞貧血病人Hb (HbS) 亞基亞基N-val his leu thr pro val glu C 肽鏈肽鏈
40、CAC GTG基因基因正常成人正常成人Hb (HbA)亞基亞基N-val his leu thr pro glu glu C 肽鏈肽鏈CTC GAG基因基因目目 錄錄（二）缺失（二）缺失、插入插入和框移和框移 deletion, insertion and frame-shift缺失缺失(deletion)：一個堿基或一段核苷酸鏈從一個堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上消失。大分子上消失。插入插入(insertion) ：原來沒有的一個堿基或一段核原來沒有的一個堿基或一段核苷酸鏈插入到苷酸鏈插入到DNA大分子中間。大分子中間?？蛞仆蛔兛蛞仆蛔兪侵溉?lián)體密碼的閱讀方式改變，造是指三聯(lián)體密碼的閱讀
41、方式改變，造成蛋白質氨基酸排列順序發(fā)生改變。成蛋白質氨基酸排列順序發(fā)生改變。 缺失或插入都可導致缺失或插入都可導致框移突變框移突變(frame-shift mution) 目目 錄錄谷谷 酪酪 蛋蛋 絲絲5 G C A G U A C A U G U C 丙丙 纈纈 組組 纈纈正常正常5 G A G U A C A U G U C 缺失缺失C缺失缺失(deletion)(deletion)引起引起框移突變框移突變(frame-shift mution)(frame-shift mution)目目 錄錄目目 錄錄（三）重排（三）重排(rearrangement)DNA分子內較大片段的交換，稱為分
42、子內較大片段的交換，稱為重組或重排。重組或重排。 由基因重排引起的兩種地中海貧血基因型由基因重排引起的兩種地中海貧血基因型目目 錄錄目目 錄錄 四、四、DNA損傷的修復損傷的修復 DNA damage repairing修復修復(repairing) 是對已發(fā)生分子改變的補償措施，使其是對已發(fā)生分子改變的補償措施，使其回復為原有的天然狀態(tài)。回復為原有的天然狀態(tài)。光修復光修復(light repairing)切除修復切除修復(excision repairing)重組修復重組修復(recombination repairing)SOS修復修復 修復的主要類型修復的主要類型目目 錄錄（一）光修復（
43、一）光修復(light repairing)(light repairing)光修復酶光修復酶(photolyase) UV目目 錄錄UvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶聚合酶OHP （二）切除修復（二）切除修復(excision repairing)(excision repairing)是細胞內最重要和是細胞內最重要和有效的修復機制，主要有效的修復機制，主要由由DNA-pol和連接酶和連接酶完成。完成。DNA連接酶連接酶ATPE.coli的切除的切除修復機制修復機制目目 錄錄目目 錄錄切切 除除 修修 復復 動動 畫畫目目 錄錄 （三）重組修復（三）重組修復(recombinatio
44、n repairing)(recombination repairing)目目 錄錄目目 錄錄（四）（四）SOS修復修復(SOSrepairing)(SOSrepairing) 當當DNA損傷廣泛難以繼續(xù)復制時，由此而誘損傷廣泛難以繼續(xù)復制時，由此而誘發(fā)出一系列復雜的反應。發(fā)出一系列復雜的反應。 在在E. coli，各種與修復有關的基因，組成一個，各種與修復有關的基因，組成一個稱為稱為調節(jié)子調節(jié)子(regulon)的網(wǎng)絡式調控系統(tǒng)。的網(wǎng)絡式調控系統(tǒng)。 這種修復特異性低，對堿基的識別、選擇能這種修復特異性低，對堿基的識別、選擇能力差。通過力差。通過SOS修復，復制如能繼續(xù)，細胞是修復，復制如能繼續(xù)，細胞是可存活的。然而可存活的。然而DNA保留的錯誤較多，導致保留的錯誤較多，導致較廣泛、長期的突變。較廣泛、長期的突變。目目 錄錄目目 錄錄目目 錄錄 附附 錄錄APPENDIX目目 錄錄催化催化DNA聚合聚合參與參與DNA損損傷的應急狀傷的應急狀態(tài)修復態(tài)修復修復合成、修復合成、切除引物、切除引物、填補空隙填補空隙功能功能2040400分子數(shù)分子數(shù)/細胞細胞1011亞基數(shù)亞基數(shù)+-+5 外切酶活性外切酶活性+ 5 外切酶活性外切酶活性+5 聚合酶活性聚合酶活性pol IIIpol IIpol I E. Coli中的中的DNA聚合酶聚合酶(DNA (DNA in in E. Coli)
生物化學：第10章 DNA的生物合成(復制)
