高考生物總復(fù)習(xí) 第9單元 生物技術(shù)實(shí)踐 第33講 微生物的利用

第33講 微生物的利用 考綱要求1.大腸桿菌的培養(yǎng)和分離(加試)。2.分離以尿素為氮源的微生物(加試)?？键c(diǎn)一微生物的培養(yǎng)和分離1大腸桿菌(1)特性：大腸桿菌是革蘭氏陰性、兼性厭氧(代謝類型)的腸道桿菌，在腸道中一般對(duì)人無害，但若進(jìn)入人的泌尿系統(tǒng)，就會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害。(2)用途：是基因工程技術(shù)中被廣泛采用的工具。2細(xì)菌的培養(yǎng)和分離(1)細(xì)菌的繁殖：以分裂的方式繁殖，分裂速度很快，約20 min分裂一次。(2)培養(yǎng)的方法：需要將已有細(xì)菌的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基中，一般用接種環(huán)(工具)轉(zhuǎn)移帶菌的培養(yǎng)物。(3)細(xì)菌分離的方法與特點(diǎn)分離方法特點(diǎn)劃線分離法操作簡(jiǎn)單涂布分離法操作復(fù)雜，單菌落更易分開3.消毒和滅菌的區(qū)別項(xiàng)目條件結(jié)果常用的方法消毒較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害的微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外線或化學(xué)藥物消毒法滅菌強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌4.大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實(shí)驗(yàn)(1)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：將大腸桿菌擴(kuò)大培養(yǎng)和劃線分離，即用LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)大腸桿菌，培養(yǎng)后再在LB固體平面培養(yǎng)基上劃線進(jìn)行分離，隨后培養(yǎng)基上就會(huì)形成一個(gè)個(gè)單獨(dú)的菌落。(2)實(shí)驗(yàn)步驟培養(yǎng)基滅菌倒平板接種劃線分離培養(yǎng)觀察50 mL LB液體培養(yǎng)基和50 mL LB固體培養(yǎng)基及培養(yǎng)皿高壓蒸汽滅菌將培養(yǎng)基分別倒至4個(gè)滅菌后的培養(yǎng)皿中，水平放置，使之形成平面在裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶中接種大腸桿菌，培養(yǎng)12 h用接種環(huán)在接種有大腸桿菌的三角瓶中蘸菌液一次，在固體培養(yǎng)基的平板上連續(xù)劃線，蓋好培養(yǎng)皿培養(yǎng)皿倒置(蓋在下面)，放在37 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1224 h后，可看到劃線的末端出現(xiàn)不連續(xù)的單個(gè)菌落(3)大腸桿菌分離的用途：?jiǎn)尉涞姆蛛x是消除污染雜菌的通用方法，也是用于篩選高表達(dá)量菌株的最簡(jiǎn)便方法之一。5微生物接種的兩種常用方法比較比較劃線分離法涂布分離法工具接種環(huán)玻璃刮刀原理通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離到由一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的細(xì)胞群體，即菌落將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個(gè)的菌落特點(diǎn)方法簡(jiǎn)單，但不適宜計(jì)數(shù)單菌落更易分開，但操作復(fù)雜些目的使培養(yǎng)基上形成單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞繁殖而來的子細(xì)胞群體菌落思考診斷1連線無菌技術(shù)的方法、類型及對(duì)象2觀察甲、乙、丙、丁四幅圖，熟悉倒平板的操作流程，請(qǐng)?zhí)羁眨?1)請(qǐng)用文字和箭頭寫出正確的倒平板操作流程：丙乙甲丁。(2)甲、乙、丙中的滅菌方法是灼燒滅菌。(3)丁中的操作需要等待平板冷卻凝固才能進(jìn)行。3下圖中甲為劃線分離法中最重要的環(huán)節(jié)，乙為操作的結(jié)果：(1)每一次劃線后都要將接種環(huán)灼燒()(2)除第一次劃線外，每一次劃線的起點(diǎn)都是第一次劃線的末端()提示平板劃線時(shí)除第一次劃線外，每一次劃線的起點(diǎn)都是上一次劃線的末端，而不是第一次。4如圖是采用純化微生物培養(yǎng)的兩種接種方法接種后培養(yǎng)的效果圖，請(qǐng)思考：(1)獲得圖A效果和B效果的接種方法分別是什么？提示獲得效果A的接種方法為涂布分離法，獲得效果B的接種方法為劃線分離法。(2)某同學(xué)在純化土壤中的細(xì)菌時(shí)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基上的菌落連成了一片，最可能的原因是什么？應(yīng)當(dāng)怎樣操作才可避免此種現(xiàn)象？提示最可能的原因是菌液濃度過高或劃線時(shí)在劃下一區(qū)域前未將接種環(huán)灼燒滅菌；采取的措施是增大稀釋倍數(shù)或每次劃新區(qū)域前先將接種環(huán)灼燒滅菌。1下圖為“大腸桿菌的培養(yǎng)和分離”實(shí)驗(yàn)的基本流程，請(qǐng)回答下列問題：(1)A過程配制的是通用細(xì)菌培養(yǎng)基，稱為_培養(yǎng)基。配制時(shí)除了加入特定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以外，還要加入一定量的氯化鈉，以維持_。對(duì)培養(yǎng)基酸堿度的調(diào)節(jié)，應(yīng)該在B過程的_(填“前面”或“后面”)。(2)D過程與C過程相比，培養(yǎng)基中增加的物質(zhì)是_，E過程所需的溫度是_。(3)D過程后，一個(gè)菌體便會(huì)形成一個(gè)_，這種分離方法是_的通用方法，也是篩選特定菌株的最簡(jiǎn)便方法之一。(4)植物組織培養(yǎng)時(shí)，先配制MS培養(yǎng)基，再加入一定比例的植物激素，當(dāng)生長(zhǎng)素相對(duì)較多時(shí)，可促進(jìn)_。(5)植物組織培養(yǎng)和微生物培養(yǎng)都需要無菌操作，下列不適宜用高壓蒸汽滅菌的是()A接種環(huán)和鑷子B三角瓶和廣口瓶C發(fā)芽培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基D用于培養(yǎng)的幼莖和幼芽答案(1)LB液體滲透壓前面(2)瓊脂4 (3)(單)菌落消除污染雜菌(或純化菌種)(4)生根(5)D解析(1)LB液體培養(yǎng)基是通用的細(xì)菌培養(yǎng)基，LB固體平面培養(yǎng)基則用于劃線分離形成單菌落。氯化鈉的作用是維持培養(yǎng)基的滲透壓。調(diào)節(jié)好酸堿度后才能進(jìn)行滅菌，若滅菌后再進(jìn)行酸堿度調(diào)節(jié)，又會(huì)產(chǎn)生新的污染。(2)在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入一定量的瓊脂可形成固體培養(yǎng)基。菌種應(yīng)置于4 C冰箱中保存。(3)通過劃線分離后，一個(gè)菌體就會(huì)繁殖出一個(gè)菌落。(4)植物組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)素相對(duì)較多時(shí)，有利于生根，而細(xì)胞分裂素相對(duì)較多時(shí)，則有利于生芽。(5)高壓蒸汽滅菌常用于培養(yǎng)基、培養(yǎng)器材等的滅菌，而用于培養(yǎng)的幼莖和幼芽則不能進(jìn)行任何滅菌操作，否則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。2檢驗(yàn)飲用水的細(xì)菌含量是有效監(jiān)控疾病發(fā)生的必要措施。請(qǐng)回答下列與檢驗(yàn)飲用水有關(guān)的問題：(1)要測(cè)定飲用水中大腸桿菌的數(shù)量，常采用_法，通常將水樣進(jìn)行一系列的梯度_，然后將上述的水樣用玻璃刮刀分別涂布到_的表面進(jìn)行培養(yǎng)，記錄菌落數(shù)量。用該方法統(tǒng)計(jì)樣本菌落數(shù)時(shí)_(填“是”或“否”)需要對(duì)照組。原因是_。(2)下面所示的四種菌落分布圖中，不可能由上述方法得到的是_。(3)大腸桿菌的培養(yǎng)條件是無菌，培養(yǎng)基配制時(shí)需加入氯化鈉，以維持_。配制培養(yǎng)基時(shí)先_后_。A調(diào)節(jié)pH B. 滅菌C消毒 D調(diào)節(jié)溫度答案(1)涂布分離稀釋LB固體培養(yǎng)基是需要判斷培養(yǎng)基使用之前是否被雜菌污染(培養(yǎng)基滅菌是否合格)(2)D(3)滲透壓AB3請(qǐng)回答微生物培養(yǎng)和分離的有關(guān)問題：(1)欲從土壤中分離出能利用尿素的細(xì)菌：以_為唯一氮源且加入了_指示劑的培養(yǎng)基，用_法分離細(xì)菌。若培養(yǎng)基平板上有菌落存活且顏色變_，則說明分離成功。(2)分離以尿素為氮源的細(xì)菌和分離大腸桿菌都使用了LB培養(yǎng)基，其成分_。A前者含瓊脂，后者不含瓊脂和瓊脂糖B兩者都含有瓊脂C前者含有瓊脂糖，后者不含瓊脂糖但含瓊脂D兩者都不含瓊脂和瓊脂糖答案(1)尿素酚紅涂布分離(或涂布)紅(2)C解析(1)分離能利用尿素的細(xì)菌，只需以尿素為唯一氮源，加酚紅指示劑，采用涂布分離法分離細(xì)菌，只要培養(yǎng)基中的指示劑變紅，標(biāo)志著存在脲酶水解尿素的反應(yīng)，證明菌株可以以尿素為氮源。(2)分離以尿素為氮源的細(xì)菌所用培養(yǎng)基應(yīng)含有瓊脂糖，而分離大腸桿菌所用培養(yǎng)基則不含瓊脂糖而含瓊脂?？键c(diǎn)二分離以尿素為氮源的微生物1菌種特點(diǎn)含有脲酶，可以通過降解尿素作為其生長(zhǎng)的氮源。2培養(yǎng)基用以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基培養(yǎng)，以LB全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基為對(duì)照。3實(shí)驗(yàn)原理(1)篩選以尿素為氮源的微生物，可使用以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)選擇。(2)細(xì)菌合成的脲酶能將尿素分解成NH3，致使pH升高，使酚紅指示劑變紅。4實(shí)驗(yàn)步驟制備培養(yǎng)基：將已滅菌的LB固體培養(yǎng)基和尿素固體培養(yǎng)基分別倒入兩個(gè)培養(yǎng)皿中，搖勻，平放至凝固制備細(xì)菌懸液：用1 g土樣配制不同濃度的細(xì)菌懸液用涂布分離法分離細(xì)菌：將不同濃度的土壤稀釋液分別加到有LB培養(yǎng)基和尿素培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，并用玻璃刮刀涂布到整個(gè)平面上培養(yǎng)：將培養(yǎng)皿倒置，在37 恒溫箱中培養(yǎng)2448 h觀察：培養(yǎng)基中菌落數(shù)量5反應(yīng)的鑒定在配制培養(yǎng)基時(shí)，加入指示劑酚紅，培養(yǎng)時(shí)細(xì)菌將尿素分解并產(chǎn)生堿性的氨，使培養(yǎng)基上菌落周圍出現(xiàn)紅色的環(huán)帶。思考診斷1分析下表所示培養(yǎng)基的配方，回答下列問題。成分含量成分含量KH2PO41.4 g葡萄糖10.0 gNa2HPO42.1 g尿素1.0 gMgSO47H2O0.2 g瓊脂糖15.0 g將上述物質(zhì)溶解后，用自來水定容到1 000 mL(1)在該培養(yǎng)基的配方中，為微生物提供碳源的物質(zhì)是葡萄糖，提供氮源的物質(zhì)是尿素。(2)該培養(yǎng)基是(填“是”或“否”)具有選擇作用，因?yàn)橹挥心芊纸饽蛩氐奈⑸锊拍苌L(zhǎng)。2如圖為分離以尿素為氮源的微生物的實(shí)驗(yàn)，思考回答問題。(1)實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖鞘褂煤心蛩氐呐囵B(yǎng)基分離能產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌；使用酚紅作為指示劑，由顏色變化檢測(cè)知酶所催化的反應(yīng)，相關(guān)的反應(yīng)式為(NH2)2COH2O2NH3CO2。(2)制備尿素固體培養(yǎng)基過程中采用的滅菌方法有高壓蒸汽滅菌法、G6玻璃漏斗過濾法。(3)從上圖所示實(shí)驗(yàn)過程中可判斷出細(xì)菌懸液C的稀釋度為104，用涂布分離法分離細(xì)菌。3判斷下列敘述的正誤(1)土樣應(yīng)從有哺乳動(dòng)物排泄物的地方取()提示有哺乳動(dòng)物排泄物的地方含脲酶的細(xì)菌較多。(2)取104、105的土壤稀釋液各0.1 mL，分別涂布于全營(yíng)養(yǎng)LB固體培養(yǎng)基、尿素固體培養(yǎng)基上()(3)將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組平板倒置，37 C恒溫培養(yǎng)2448 h()(4)在尿素固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌都是以尿素為氮源的細(xì)菌()42013年11月22日凌晨3點(diǎn)，青島黃島區(qū)發(fā)生石油泄漏事件，一些微生物可以有效地分解石油，如何配制選擇培養(yǎng)基將這類微生物選擇出來？提示配制的選擇培養(yǎng)基中，石油作為唯一的碳源，然后用這種培養(yǎng)基培養(yǎng)多種微生物，凡是能在該種培養(yǎng)基上生存的就是能分解石油的微生物。1現(xiàn)從土壤中分離以尿素為氮源的細(xì)菌，實(shí)驗(yàn)過程如下圖所示：請(qǐng)回答：(1)欲從土壤中分離出能分解尿素的細(xì)菌，將土壤用_進(jìn)行一系列的梯度稀釋，同一濃度的土壤稀釋液應(yīng)至少涂布_個(gè)平板，通常以每個(gè)培養(yǎng)皿中有_個(gè)以內(nèi)的單菌落的那一組稀釋倍數(shù)為最合適。(2)接種后的培養(yǎng)皿_于37 的恒溫箱中培養(yǎng)。若培養(yǎng)基中存在含脲酶的細(xì)菌，其菌落周圍會(huì)出現(xiàn)_，這是由于尿素被分解產(chǎn)生氨氣，遇培養(yǎng)基中的_產(chǎn)生的顏色變化，從而證明這一菌株能以尿素為氮源。(3)分離能利用尿素的細(xì)菌時(shí)所用的培養(yǎng)基成分上最主要的特點(diǎn)是_。(4)下列操作需要在酒精燈火焰旁進(jìn)行的是_(多選)。A稱取葡萄糖、瓊脂糖等培養(yǎng)基成分B倒平板C涂布平板D微生物的培養(yǎng)(5)與LB全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上的菌落數(shù)相比，尿素培養(yǎng)基上只有少數(shù)菌落的原因是_。答案(1)無菌水320(2)倒置紅色環(huán)帶酚紅指示劑(3)以尿素作為唯一氮源的(固體)培養(yǎng)基(4)BC(5)土壤中能利用尿素的細(xì)菌在土壤菌群中只占極少數(shù)2如圖是從土壤中篩選產(chǎn)脲酶細(xì)菌的過程。(1)圖中選擇培養(yǎng)基應(yīng)以_為唯一氮源；鑒別培養(yǎng)基還需添加_作為指示劑，產(chǎn)脲酶細(xì)菌在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)一段時(shí)間后，其菌落周圍的指示劑將變成_色。(2)在5個(gè)細(xì)菌培養(yǎng)基平板上，均接種稀釋倍數(shù)為105的土壤樣品溶液0.1 mL，培養(yǎng)一段時(shí)間后，平板上長(zhǎng)出的細(xì)菌菌落數(shù)分別為13、156、462、178和191。該過程采取的接種方法是_，每克土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)量為_108個(gè)；與血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法相比，此計(jì)數(shù)方法測(cè)得的細(xì)菌數(shù)較_。答案(1)尿素酚紅紅(2)涂布分離法1.75少解析(1)脲酶能夠催化尿素分解為氨，故圖中選擇培養(yǎng)基應(yīng)以尿素作為唯一氮源。由于尿素被分解成了氨，氨會(huì)使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)，pH升高，使酚紅指示劑變紅色。(2)用于計(jì)數(shù)細(xì)菌菌落數(shù)的接種方法是涂布分離法，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)應(yīng)介于30300之間，故選擇細(xì)菌菌落數(shù)為156、178和191的平板計(jì)數(shù)，每克土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)量為(156178191)/30.11051.75108個(gè)。由于兩個(gè)或多個(gè)細(xì)菌連接在一起時(shí)，往往統(tǒng)計(jì)的是一個(gè)菌落，故用此方法測(cè)得的細(xì)菌數(shù)偏少。歸納整合1培養(yǎng)基中觀測(cè)指標(biāo)的分析(1)培養(yǎng)基中的酚紅指示劑產(chǎn)生顏色變化(變紅)，標(biāo)志著存在脲酶水解尿素的作用，從而證明這一菌株能以尿素為氮源。紅色環(huán)狀區(qū)域的大小代表脲酶活性的強(qiáng)弱和含量的多少。紅色區(qū)域越大，表明菌株利用尿素的能力越強(qiáng)。(2)與全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上的菌落數(shù)比較，尿素培養(yǎng)基上只有少數(shù)菌落，這一現(xiàn)象表明能利用尿素的細(xì)菌在土壤菌群中只占極少部分。2微生物篩選過程中必要的兩種對(duì)照培養(yǎng)基及其作用對(duì)照組作用現(xiàn)象結(jié)論未接種培養(yǎng)基有無雜菌污染的判斷未接種的培養(yǎng)皿中無菌落生長(zhǎng)未被雜菌污染接種的LB全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基篩選作用的確認(rèn)LB全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上的菌落數(shù)大于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目選擇培養(yǎng)基具有篩選作用做模擬練預(yù)測(cè)1(2016溫州中學(xué)期末測(cè)試)下圖是微生物平板劃線示意圖。劃線的順序?yàn)?、2、3、4、5。下列操作方法正確的是()A操作前要將接種環(huán)放在火焰旁滅菌B劃線操作須在火焰上進(jìn)行C在5區(qū)域中才有可能得到所需菌落D在1、2、3、4、5區(qū)域中劃線前后都要對(duì)接種環(huán)進(jìn)行滅菌答案D解析操作前要將接種環(huán)放在火焰上灼燒滅菌，A項(xiàng)錯(cuò)誤；劃線操作須在火焰旁進(jìn)行，B項(xiàng)錯(cuò)誤；在5區(qū)域中最有可能得到所需菌落，C項(xiàng)錯(cuò)誤；在1、2、3、4、5區(qū)域中劃線前后都要對(duì)接種環(huán)進(jìn)行滅菌，D項(xiàng)正確。2在細(xì)菌培養(yǎng)過程中，下列有關(guān)操作正確的是()A涂布器用火焰灼燒進(jìn)行滅菌B培養(yǎng)基分裝到培養(yǎng)皿后進(jìn)行滅菌C倒平板和取菌液都必須要在酒精燈火焰旁進(jìn)行D分離得到的菌落應(yīng)先接種在平板上，培養(yǎng)24 h后，置于4 冰箱中保存答案C解析涂布器應(yīng)該用高壓蒸汽滅菌，A項(xiàng)錯(cuò)誤；培養(yǎng)基應(yīng)該先滅菌后分裝，B項(xiàng)錯(cuò)誤；倒平板和取菌液都必須要在酒精燈火焰旁進(jìn)行，以防止雜菌污染，C項(xiàng)正確；分離得到的菌落應(yīng)先接種在斜面上，置于37 的恒溫箱培養(yǎng)24 h后，再置于4 冰箱中保存，D項(xiàng)錯(cuò)誤。3下圖是“分離以尿素為氮源的微生物”實(shí)驗(yàn)的基本流程，請(qǐng)回答下列問題：(1)該實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基不能含有_。A尿素 B氯化鈉C葡萄糖 D瓊脂(2)尿素溶液可用_使之無菌。若要檢查B過程滅菌是否徹底，可以采用的方法是_。(3)圖中步驟C為_。相對(duì)于劃線分離法，過程D涂布分離法的優(yōu)點(diǎn)是_。(4)如果菌落周圍出現(xiàn)_色環(huán)帶，說明該菌落能分泌脲酶。答案(1)D(2)G6玻璃漏斗過濾將空白培養(yǎng)基放在適宜溫度下培養(yǎng)一段時(shí)間， 觀察有無菌落出現(xiàn)(3)倒平板單菌落更易分開(4)紅解析(1)分離以尿素為氮源的微生物，應(yīng)該以尿素為唯一氮源，所以不應(yīng)有瓊脂。(2)尿素用G6玻璃漏斗過濾除去其中細(xì)菌等微生物。(4)若菌落能分泌脲酶，則菌落周圍會(huì)出現(xiàn)紅色環(huán)帶。4(2014浙江自選，17節(jié)選)(1)現(xiàn)有一份污水樣品，某興趣小組欲檢測(cè)其中的細(xì)菌數(shù)，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。將一定量的污水樣品進(jìn)行濃度梯度稀釋。取適量不同稀釋度的稀釋液，用_法分別接種于固體平面培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后進(jìn)行計(jì)數(shù)。該實(shí)驗(yàn)應(yīng)注意，接種前，從盛有_的容器中將玻璃刮刀取出，放在酒精燈火焰上灼燒，冷卻后待用；分組時(shí)，需用_作為對(duì)照。(2)在上述細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)，應(yīng)計(jì)數(shù)的是接種了()A各個(gè)稀釋度樣品的培養(yǎng)基上的細(xì)菌數(shù)B合理稀釋度樣品的培養(yǎng)基上的細(xì)菌數(shù)C各個(gè)稀釋度樣品的培養(yǎng)基上的菌落數(shù)D合理稀釋度樣品的培養(yǎng)基上的菌落數(shù)答案(1)涂布分離70%酒精未接種的培養(yǎng)基(2)D解析(1)細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)常用涂布分離法，即用玻璃刮刀將一定體積的稀釋液涂布到固體平面培養(yǎng)基上。玻璃刮刀在使用前需進(jìn)行滅菌處理，即將其浸入體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精中，隨后取出放在酒精燈火焰上灼燒，冷卻后待用。為排除其他因素的影響，提高實(shí)驗(yàn)的可信度，實(shí)驗(yàn)中要設(shè)置空白對(duì)照。(2)將菌液涂布到固體平面培養(yǎng)基上后，倒置放在恒溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時(shí)間后，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落，來源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌，這樣通過統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)就可估算出待測(cè)樣品的細(xì)菌數(shù)目，所以要選擇合理稀釋度樣品的培養(yǎng)基上的菌落數(shù)。課時(shí)訓(xùn)練一、選擇題1下圖為實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和純化大腸桿菌過程中的部分操作步驟，下列說法錯(cuò)誤的是()A步驟操作時(shí)需要在酒精燈火焰旁進(jìn)行B步驟中，待倒入的培養(yǎng)基冷卻后蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋C步驟中，每次劃線前后都需對(duì)接種環(huán)進(jìn)行灼燒處理D劃線接種結(jié)束后，將圖平板倒置后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)答案B解析由圖可知，步驟是倒平板，步驟是用接種環(huán)蘸取菌液，步驟是進(jìn)行平板劃線，步驟是培養(yǎng)。步驟操作時(shí)需要在酒精燈火焰旁進(jìn)行，防止被雜菌污染，A項(xiàng)正確；倒完平板后應(yīng)立即蓋上培養(yǎng)皿蓋，冷卻后將平板倒過來放置，B項(xiàng)錯(cuò)誤；每次劃線前后灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到單菌落，C項(xiàng)正確；劃線接種結(jié)束后，將平板倒置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，有利于培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)和防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基造成污染，D項(xiàng)正確。2(2016舟山中學(xué)期末測(cè)試)下列有關(guān)微生物培養(yǎng)的敘述中，不正確的是()A獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止雜菌污染B單菌落的分離是消除污染的雜菌的通用方法C培養(yǎng)基都必須使用高壓蒸汽滅菌法滅菌D倒置平板防止培養(yǎng)皿蓋上的冷凝水滴落答案C解析微生物培養(yǎng)中獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止雜菌污染，A項(xiàng)正確；通?？梢圆捎猛坎挤蛛x法或劃線分離法進(jìn)行單菌落的分離，以消除污染的雜菌，B項(xiàng)正確；培養(yǎng)基通?？梢赃M(jìn)行高壓蒸汽滅菌，但對(duì)于培養(yǎng)基中有高溫易分解的成分，就不能用此方法，如培養(yǎng)基中的尿素等物質(zhì)，C項(xiàng)錯(cuò)誤；劃線接種結(jié)束后需要將培養(yǎng)皿倒置，以防止培養(yǎng)基蒸發(fā)冷凝成的水滴入培養(yǎng)基而造成污染，D項(xiàng)正確。3(2015普陀中學(xué)期末測(cè)試)在分解尿素的細(xì)菌的分離和鑒定中，對(duì)先后用到的兩種培養(yǎng)基的敘述正確的是()A加入酚紅指示劑作為鑒別培養(yǎng)基，再加入唯一碳源作為選擇培養(yǎng)基B加入唯一氮源作為鑒別培養(yǎng)基，再加入酚紅指示劑作為選擇培養(yǎng)基C加入唯一氮源作為選擇培養(yǎng)基，再加入酚紅指示劑作為鑒別培養(yǎng)基D加入酚紅指示劑作為選擇培養(yǎng)基，再加入唯一碳源作為鑒別培養(yǎng)基答案C解析能合成脲酶的細(xì)菌才能分解尿素。配制以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基，能夠生長(zhǎng)的細(xì)菌就是能分解尿素的細(xì)菌；細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解成氨，氨會(huì)使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)，在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑培養(yǎng)細(xì)菌，若指示劑變紅，可確定該種細(xì)菌能夠分解尿素。4在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑的目的是()A篩選出能分解尿素的細(xì)菌B對(duì)分離的菌種作進(jìn)一步鑒定C作細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)成分D若指示劑變藍(lán)就能準(zhǔn)確地認(rèn)定該菌能分解尿素答案B解析篩選出能分解尿素的細(xì)菌用選擇培養(yǎng)基即可，不需要加指示劑。加入指示劑的培養(yǎng)基，目的都是對(duì)要分離的菌種作進(jìn)一步的鑒定。二、非選擇題5幽門螺桿菌(Hp)感染是急慢性胃炎和消化性潰瘍的主要致病因素。在患者體內(nèi)采集樣本并制成菌液后，進(jìn)行分離培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)基本步驟如下：請(qǐng)回答：(1)在配制培養(yǎng)基時(shí)，要加入尿素和酚紅指示劑，這是因?yàn)镠p含有_，它能以尿素作為氮源；若有Hp，則菌落周圍會(huì)出現(xiàn)_色環(huán)帶。(2)下列對(duì)尿素溶液進(jìn)行滅菌的最適方法是_滅菌。A高壓蒸汽 B紫外燈照射C70%酒精浸泡 D過濾(3)步驟X表示_。在無菌條件下操作時(shí)，先將菌液稀釋，然后將菌液_到培養(yǎng)基平面上。菌液稀釋的目的是為了獲得_菌落。(4)在培養(yǎng)時(shí)，需將培養(yǎng)皿倒置并放在_中，若不倒置培養(yǎng)，將導(dǎo)致_。(5)臨床上用14C呼氣試驗(yàn)檢測(cè)人體是否感染Hp，其基本原理是Hp能將14C標(biāo)記的_分解為NH3和14CO2。答案(1)脲酶紅(2)D(3)接種涂布單(4)恒溫培養(yǎng)箱無法形成單菌落(5)尿素解析(1)幽門螺桿菌(Hp)含有脲酶，能以尿素為氮源，在加入尿素和酚紅指示劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)Hp，由于尿素經(jīng)脲酶的降解可產(chǎn)生堿性的NH3，NH3能使培養(yǎng)基中的酚紅由紅黃色變成紅色，故菌落周圍會(huì)出現(xiàn)紅色環(huán)帶。(2)由于尿素加熱會(huì)分解，對(duì)尿素溶液進(jìn)行滅菌最好用G6玻璃砂漏斗過濾。(3)微生物的分離和培養(yǎng)步驟：配制培養(yǎng)基滅菌、倒平板接種培養(yǎng)。為獲得單菌落，接種操作前應(yīng)先將菌液稀釋，然后將菌液涂布到培養(yǎng)基平面上即可。(4)微生物培養(yǎng)時(shí)需將培養(yǎng)皿倒置并放在恒溫培養(yǎng)箱中，若不倒置培養(yǎng)，則無法形成單菌落。(5)幽門螺桿菌能將14C標(biāo)記的尿素分解為NH3和14CO2，故臨床上常用14C呼氣試驗(yàn)檢測(cè)人體內(nèi)幽門螺桿菌的存在。6從土壤中分離以尿素為氮源的細(xì)菌，實(shí)驗(yàn)過程如圖所示：請(qǐng)回答：(1)圖中物質(zhì)A為_，若要統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中以尿素為氮源的細(xì)菌的活菌數(shù)目，宜采用_法接種到尿素培養(yǎng)基上，對(duì)照組配制的培養(yǎng)基為_培養(yǎng)基，若用同濃度的土壤稀釋液接種，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)皿中菌落數(shù)_(大于、等于或小于)對(duì)照組。在能利用尿素的細(xì)菌菌落周圍，有紅色環(huán)帶出現(xiàn)的原因是_。(2)下列培養(yǎng)基中，能分離出分解尿素的細(xì)菌的是()A葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚紅、瓊脂糖、水B葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚紅、瓊脂糖、水、尿素CNaCl、瓊脂糖、水、蛋白胨、酵母提取物、尿素D葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚紅、瓊脂糖、水、蛋白胨、酵母提取物(3)欲將分離得到的以尿素為氮源的細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，應(yīng)使用_培養(yǎng)基。答案(1)無菌水涂布分離LB全營(yíng)養(yǎng)小于因?yàn)槟芾媚蛩氐募?xì)菌產(chǎn)生的脲酶，將培養(yǎng)基中的尿素分解，產(chǎn)生的氨使指示劑呈紅色(2)B(3)LB液體7(原創(chuàng))有些細(xì)菌可分解原油，從而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同學(xué)欲從受原油污染的土壤中篩選出能高效降解原油的菌株。請(qǐng)回答問題：(1)在篩選過程中，應(yīng)將土壤樣品稀釋液接種于以_為唯一碳源的培養(yǎng)基上。從功能上講，該培養(yǎng)基屬于_(A.固體B液體C純化D選擇)培養(yǎng)基。(2)純化菌種時(shí)，為了得到單菌落，常采用的接種方法有兩種，即_。(3)為了篩選出高效菌株，可比較單菌落周圍透明圈的大小，透明圈大說明該菌株的降解能力_。(4)通常情況下，在微生物培養(yǎng)過程中，實(shí)驗(yàn)室常用的滅菌方法有灼燒滅菌、_和高壓蒸汽滅菌。無菌技術(shù)要求實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈_附近進(jìn)行，以避免周圍環(huán)境中微生物的污染。答案(1)原油D(2)劃線分離法和涂布分離法(3)強(qiáng)(4)干熱滅菌火焰解析(1)可以將所需要的微生物從混雜的微生物群中分離出來的培養(yǎng)基為選擇培養(yǎng)基。欲篩選出能降解原油的菌株，培養(yǎng)基中應(yīng)只含有原油而無其他碳源，這樣不能降解原油的細(xì)菌在此培養(yǎng)基上不能生存，可篩選出能分解原油的菌種。(2)分離純化菌種時(shí)，接種的方法有劃線分離法和涂布分離法，其目的都是使聚集在一起的微生物分散成單個(gè)細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單菌落，以便于純化菌種。(3)降解原油能力越強(qiáng)的菌株，在菌落周圍形成的透明圈越大。(4)實(shí)驗(yàn)室常用的滅菌方法有灼燒滅菌(如接種環(huán))、干熱滅菌(如培養(yǎng)皿)和高壓蒸汽滅菌(如培養(yǎng)基)等。無菌技術(shù)要求整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作都要在酒精燈火焰附近進(jìn)行，以避免周圍微生物的污染。8(2016金麗衢十校聯(lián)考)下表是3組生物實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基。請(qǐng)回答下列問題：組別培養(yǎng)基a無機(jī)鹽、蔗糖、維生素和甘氨酸等有機(jī)物、水、瓊脂b葡萄糖、NaCl、K2HPO4、尿素、酚紅、水、瓊脂糖c蛋白胨、酵母提取物、NaCl、水、瓊脂(1)分離以尿素為氮源的細(xì)菌應(yīng)選用培養(yǎng)基_。在含有脲酶的細(xì)菌菌落周圍會(huì)出現(xiàn)_，這是由于尿素被分解產(chǎn)生的_使pH升高，酚紅指示劑產(chǎn)生顏色變化，從而證明這一菌株可以尿素為氮源。變色區(qū)域越大，表明該菌株利用尿素的能力_。(2)用培養(yǎng)基a進(jìn)行植物組織培養(yǎng)，則培養(yǎng)基中還需加入_。一般先用_(填“發(fā)芽”或“生根”)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，使之長(zhǎng)出較多的叢狀苗，然后將叢狀苗分株培養(yǎng)。(3)生產(chǎn)上利用黑曲霉或蘋果青霉來提取果膠酶，在用果膠酶水解果膠的實(shí)驗(yàn)中，下列說法正確的是_。A實(shí)驗(yàn)后滴加酒精的目的是增加果膠酶的活性B沸水浴加熱后果膠酶的活性隨著溫度的下降逐漸恢復(fù)C間歇攪拌2030 min的目的是讓果膠酶與果膠充分接觸D選用黑曲霉提取液是因?yàn)楣z酶只能在生物細(xì)胞內(nèi)起催化作用答案(1)b紅色環(huán)帶氨越強(qiáng)(2)植物激素(植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑)發(fā)芽(3)C解析(1)分離以尿素為氮源的細(xì)菌應(yīng)選用以尿素為唯一氮源并添加酚紅指示劑的培養(yǎng)基。分解尿素的微生物可產(chǎn)生脲酶，脲酶可催化尿素分解產(chǎn)生氨，氨使酚紅指示劑變紅，從而在菌落周圍形成紅色環(huán)帶，形成的紅色環(huán)帶越大，表明該菌株利用尿素的能力越強(qiáng)。(2)植物組織培養(yǎng)所需的MS培養(yǎng)基需加入植物激素。培養(yǎng)過程中一般先用發(fā)芽培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，使之長(zhǎng)出較多的叢狀苗，然后將叢狀苗分株培養(yǎng)，誘導(dǎo)生根。(3)在用果膠酶水解果膠的實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)操作后滴加酒精的目的是檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)過程中果膠是否被水解；沸水浴加熱后果膠酶會(huì)失去活性；只要條件適宜，果膠酶在細(xì)胞內(nèi)外均可發(fā)揮催化作用。9(2015寧波鄞州中學(xué)練習(xí))有機(jī)農(nóng)藥苯磺隆是一種除草劑，長(zhǎng)期使用會(huì)污染環(huán)境，研究發(fā)現(xiàn)，苯磺隆能被土壤中某些微生物降解。分離能降解苯磺隆菌株的實(shí)驗(yàn)過程如下圖所示。請(qǐng)回答問題：(1)微生物生長(zhǎng)繁殖所需的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有碳源、水、_、 _四類，該實(shí)驗(yàn)所用的選擇培養(yǎng)基只能以苯磺隆作為唯一碳源，其原因是_。(2)純化菌株時(shí)，通常使用的劃線工具是_。在第二次及以后劃線時(shí)，總是從上一次的末端開始劃線。這樣做的目的是_。 (3)若要檢測(cè)土樣中的細(xì)菌含量，應(yīng)采用_法。在接種前，隨機(jī)取若干滅菌后的空白平板培養(yǎng)基先行培養(yǎng)了一段時(shí)間，這樣做的目的是_。答案(1)氮源無機(jī)鹽只有能利用苯磺隆的微生物能正常生長(zhǎng)和繁殖(2)接種環(huán)將聚集的菌體逐步減少以便獲得單個(gè)菌落(3)涂布分離檢測(cè)培養(yǎng)基平板滅菌是否合格解析(1)微生物生長(zhǎng)所需要的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括碳源、氮源、水和無機(jī)鹽。使用選擇培養(yǎng)基是因?yàn)檫x擇培養(yǎng)基上只有能利用苯磺隆的微生物能正常生長(zhǎng)和繁殖，同時(shí)又能抑制或阻止其他微生物的生長(zhǎng)。(2)劃線分離法接種時(shí)常使用接種環(huán)劃線。在第二次及以后劃線時(shí)，總是從上一次的末端開始劃線。這樣做的目的是將聚集的菌體逐步減少以便獲得單個(gè)菌落。(3)涂布分離法常常用來進(jìn)行微生物的分離和計(jì)數(shù)。為檢驗(yàn)培養(yǎng)基平板滅菌是否合格，常常需要在接種前，隨機(jī)取若干滅菌后的空白平板培養(yǎng)基先行培養(yǎng)一段時(shí)間，觀察有無菌落形成，若沒有菌落形成則表明培養(yǎng)基滅菌合格，否則不合格。10石油烴是環(huán)境的重要污染源。為了篩選出具有強(qiáng)分解石油烴能力的微生物，進(jìn)行了一系列操作，請(qǐng)回答下列問題：(1)分解石油烴的微生物一般要從土壤中分離，獲取土壤樣品的取樣地點(diǎn)最好選在_。(2)微生物實(shí)驗(yàn)室采用_法對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌處理。A干熱滅菌 B過濾滅菌C灼燒滅菌 D高壓蒸汽滅菌(3)下圖為獲取土壤樣品后的培養(yǎng)研究過程：為了能有效地分離出分解石油烴的微生物，過程所用培養(yǎng)基的成分的特點(diǎn)是_，從而有利于分解石油烴的微生物的生長(zhǎng)。(4)對(duì)進(jìn)行接種常采用的兩種方法分別是_和_。(5)若發(fā)現(xiàn)在中無法區(qū)分菌落，可以將圖中取出的菌液_。(6)若實(shí)驗(yàn)室為分離純化優(yōu)良菌種進(jìn)行了如下操作，排序最合理的是_。A BC D(7)整個(gè)微生物的分離和培養(yǎng)的操作，一定要注意在_條件下進(jìn)行。答案(1)石油污染明顯處(2)D(3)以石油烴為唯一碳源(4)劃線分離法涂布分離法(5)進(jìn)行(梯度)稀釋(6)B(7)無菌解析(1)分解石油烴的微生物在石油污染明顯處分布較多。(2)微生物實(shí)驗(yàn)室常用高壓蒸汽滅菌法對(duì)培養(yǎng)基滅菌。(3)實(shí)驗(yàn)過程中，過程所用培養(yǎng)基應(yīng)用石油烴作為唯一碳源，以抑制其他種類微生物的生長(zhǎng)，從而分離出以石油烴為碳源的微生物。(4)在微生物的分離實(shí)驗(yàn)中，常用劃線分離法或涂布分離法進(jìn)行接種。(5)若發(fā)現(xiàn)在中無法區(qū)分菌落，可能是菌液中細(xì)菌濃度太高，可進(jìn)行梯度稀釋處理后再進(jìn)行接種。(6)圖示為用劃線分離法進(jìn)行接種分離。接種過程中應(yīng)先在酒精燈火焰上灼燒接種環(huán)后，蘸取菌液進(jìn)行接種，整個(gè)操作在酒精燈火焰旁進(jìn)行，接種結(jié)束后還須在酒精燈上灼燒接種環(huán)。(7)為避免污染，整個(gè)微生物的分離和培養(yǎng)的操作，一定要注意在無菌條件下進(jìn)行。