利用生物合成原理尋找微生物新藥

第四章 微生物藥物的生物合成 微生物新藥的發(fā)現(xiàn) 根據(jù)微生物藥物的生物合成原理 發(fā)現(xiàn)微生物新藥的方法和途徑 通過非基因定向改變、基因定向改變，以 及組合生物催化的技術(shù)，或是改變原有微 生物藥物的生物合成途徑，或是對原有的 微生物藥物（或先導(dǎo)化合物和中間體）進(jìn) 行生物催化，以發(fā)現(xiàn)微生物新藥 . 產(chǎn)生菌 前體物質(zhì) (1) 誘變處理 化學(xué) 修飾 天然產(chǎn)物 衍生物 天然產(chǎn)物 天然中間物 天然產(chǎn)物 衍生物 化學(xué)修飾 生物轉(zhuǎn)化與 組合生物轉(zhuǎn)化 阻斷或非阻 斷菌株 定向與雜交 生物合成 微生物或 酶轉(zhuǎn)化 天然產(chǎn)物 類似物 雜合 工程菌 突變生物 合成 組合生物合成 (2) 基因操作 天然產(chǎn)物 類似物 (1) (2) 天然產(chǎn)物 類似物 微生物藥物生物合成 與微生物新藥發(fā)現(xiàn)的基本途徑 通過非基因定向改變的方法包括：定向生 物合成、雜交生物合成、突變生物合成， 以及生物轉(zhuǎn)化與組合生物轉(zhuǎn)化； 基因定向改變，即為組合生物合成。 第一節(jié) 生物合成途徑的非基因定向改變 與微生物新藥的發(fā)現(xiàn) 一、非遺傳操作的定向生物合成 與微生物新藥的發(fā)現(xiàn) 已有的研究表明，在抗生素等次級代謝產(chǎn)物生 物合成中酶底物的特異性足以使結(jié)構(gòu)相關(guān)的 代謝產(chǎn)物在其發(fā)酵液中積累； 但由于生物合成酶的底物專一性較低（寬泛 性），其野生型菌株或阻斷突變株的發(fā)酵過程 中添加一些已知結(jié)構(gòu)類似物作為前體物質(zhì)，可 以產(chǎn)生含有與這種已知結(jié)構(gòu)類似的新衍生物； 這種獲得新次級代謝產(chǎn)物的途徑，可以被稱之 為非遺傳操作的定向生物合成 (directed biosynthesis)。 前體（ precursor） 即在微生物培養(yǎng)過程中，外源添加的某一 化學(xué)物質(zhì)，通過微生物的代謝，能夠?qū)⑵?整體地或部分地整合到某一特定的次級代 謝產(chǎn)物的分子中去的化合物，如苯乙酸或 苯乙酰胺及苯氧乙酸等）。 非遺傳操作的定向生物合成 這種在發(fā)酵過程中通過添加某種特定的前體物質(zhì)， 使微生物的生物合成朝著將這些前體物質(zhì)摻入到 產(chǎn)物分子的某一特定部位而產(chǎn)生過量的含有這種 前體的產(chǎn)物的方法，即為非遺傳操作的定向生物 合成。 其基本原理是由于參與這些反應(yīng)的生物合成酶的 底物專一性較差，而能使外源添加的某些前體物 質(zhì)競爭性地?fù)饺氲教囟óa(chǎn)物的分子中去。 定向生物合成與微生物新藥的發(fā)現(xiàn) 次級代謝產(chǎn)物合成酶的特點(diǎn)： 是一個(gè)由一系列酶參與催化的多酶體系。 參與催化反應(yīng)的酶的底物專一性比初級代 謝合成酶要差。 應(yīng)用實(shí)例 應(yīng)用非遺傳操作定向生物合成的方法能夠 制備獲得許多新的抗生素，其中目前已進(jìn) 行工業(yè)化生產(chǎn)的有： 青霉素 G和 V； 培羅霉素； 四環(huán)素和金霉素等。 青霉素定向生物合成 . 序號 側(cè) 鏈 R 學(xué) 名 俗 名 1 對羥基芐青霉素 青霉素 X 2 芐青霉素 青霉素 G 3 戊烯 2青霉素 青霉素 F 4 戊青霉素 青霉素二氫 F 5 庚青霉素 青霉素 K 6 丙烯巰甲基青霉素 青霉素 O 7 苯氧甲基青霉素 青霉素 V 8 4氨基 4羧基 丁基青霉素 青霉素 N N C H S C C H C H 3 C H 3H C C H 2 N O C O O H 青霉素和 6 APA分子結(jié)構(gòu)及各種天然青霉素的結(jié)構(gòu)與名稱 青霉素分子的化學(xué)結(jié)構(gòu) 6 APA的化學(xué)結(jié)構(gòu) 各種天然青霉素具有的側(cè)鏈和名稱 H O C H 2 C H 2 H 3 C C H 2 C H C H C H 2 H 3 C ( C H 2 ) 3 C H 2 H 3 C ( C H 2 ) 5 C H 2 H 2 C C H C H 2 S C H 2 C H 3O C H ( C H 2 ) 2 C H 2 N H 2 H O O C 培羅霉素定向生物合成 . 培羅霉素定向生物合成 可結(jié)合進(jìn)入 BLM的末端胺基部分的非天然胺基化合物 . H 2 N C H 2 C H 2 N H 2 H 2 N C H 2 C H N H 2 C H 3 H 2 N ( C H 2 ) 3 N H C H 3 H 2 N ( C H 2 ) 3 N ( C H 3 ) 2 H 2 N ( C H 2 ) 3 N ( C H 3 ) 2 X - H 2 N ( C H 2 ) 3 N H ( C H 2 ) 3 N ( C H 3 ) 2 H 2 N ( C H 2 ) 3 N ( C H 2 ) 3 N H 2 C H 3 H 2 N ( C H 2 ) 3 N H C H C H 3 ( C H 2 ) 2 N H 2 H 2 N ( C H 2 ) 3 N H ( C H 2 ) 3 O H H 2 N ( C H 2 ) 3 N H ( C H 2 ) 3 O C H 3 H 2 N ( C H 2 ) 3 N H 2 N ( C H 2 ) 3 N H 2 N ( C H 2 ) 3 N O H 2 N ( C H 2 ) 2 N N H H 2 N ( C H 2 ) 3 N H C H 2 * H 2 N ( C H 2 ) 3 N H C H C H 3 H 2 N C H 2 C H 2 N H 2 H N ( C H 2 ) 3 N H * PEP的末端胺基 四環(huán)類抗生素的定向生物合成 R5 R6 R7 6去甲基四環(huán)素 H H H (1) 7氯 6去甲基四環(huán) 素 H H Cl (2) 四環(huán)素 H CH3 H (3) 5羥基四環(huán)素（土霉素） OH CH3 H (4) 7氯四環(huán)素（金霉素） H CH3 Cl (5) O H R 7 O O H N H 2 OO O H H O N ( C H 3 ) 2 H R 6 H R 5 H H 7 8 9 1 0 1 1 6 6 a 1 0 a 5 5 a 1 1 a 4 4 a 1 2 a 1 2 3 1 2 微生物發(fā)酵產(chǎn)生的一些四環(huán)素類抗生素 四環(huán)類抗生素的定向生物合成 在生產(chǎn) 金霉素 時(shí)需添加氯化物作為前體， 而當(dāng)生產(chǎn) 四環(huán)素 時(shí)，則必須要在發(fā)酵培養(yǎng) 基中添加氯離子抑制劑，如溴化物或 M-促 進(jìn)劑等，從而抑制金霉素的合成而得到四 環(huán)素產(chǎn)物。 另外，用金色鏈霉菌在發(fā)酵的金霉素過程 中添加適量的甲基化反應(yīng)抑制劑如磺胺嘧 啶鈉，能夠獲得 去甲基金霉素。 杜拉克丁的定向生物合成 杜拉克丁的定向生物合成 組分 R1 R2 X Y 備注 A1a A1b A2a A2b B1a B2b B2a B2b OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 OH OH OH OH CH=CH CH=CH CH2 CH（ OH） CH2 CH（ OH） CH=CH CH=CH CH2 CH（ OH） CH2 CH（ OH） 25-環(huán)己烷基 -B2 25-環(huán)己烷基 -B1 OH OH CH2CH（ OH） CH=CH 外源添加環(huán) 己烷羧酸鈉 CH3 C2H5 CH3 C2H5 CH3 C2H5 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 非基因改變定向生物合成的研究進(jìn)展 盡管近年來基因改變的定向生物合成 發(fā)展很快，但利用非遺傳操作定向生物合 成原理尋找新的生理活性物質(zhì)的研究還在 不少實(shí)驗(yàn)室繼續(xù)進(jìn)行，特別是對一些肽類 如 環(huán)孢菌素 A、 aureobasidins及糖肽類如 替考拉寧產(chǎn)生菌 的定向生物合成研究取得 二、添加外源酶抑制劑的雜交生物合成 與微生物新藥的發(fā)現(xiàn) 雜交生物全成（ hybrid biosynthesis）似乎可以 理解為是 一種 “ 強(qiáng)化 ” 的非遺傳定向生物合成 ，如 在苦霉素產(chǎn)生菌生酵過程中添加聚乙酰途徑中 -酮 酯?；铣擅敢种苿?線蘭菌素 (cerulenin)，使 其失去合成鏈霉素大環(huán)內(nèi)酯苷元 (picronolide)的 能力而只能合成糖基。同時(shí)在發(fā)酵過程中添加泰樂 菌素大環(huán)內(nèi)酯苷元 (protylonolide)，使其與苦霉 素生產(chǎn)菌產(chǎn)生的糖基結(jié)合，得到一種被稱之為 M4365G1的雜合抗生素 (hybrid antibiotic)。 雜交生物合成與微生物新藥的發(fā)現(xiàn) O H O M e N H O M e M e葡萄糖 1 CH3COOH 6 CH3CH2COOH M e M e O O O H M e O H M e M e O M e 2 CH3COOH 5 CH3CH2COH CH3CH2CH2COOH S.fradia KA 427 NO.261 Protylonolide Picronolide O M e O M e H O M e O H M e M e Desosamine O M e N H O M e M e O M e O M e H O e M e M e O O M e N H O M e M e M e M e O O O H M e O M e M e O M ePicromycin D Desosaminyl Protylonolide （ M4365G1） 在淺藍(lán)菌素存在下，用苦味霉素產(chǎn)生菌（ S.sp.AM 4900） 與 protylonolide 雜交生物合成 M 4365G 雜交生物合成產(chǎn)物工業(yè)化的可能性 盡管通過雜交生物合成能夠得到 一些新的抗生素，但由于所添加的 淺 藍(lán)菌素 本身就是一種昂貴的抗生素， 再則所添加的 苷元的結(jié)構(gòu) 受到限制， 所以這種方法似乎沒有很大的實(shí)際意 義。 三、非定向誘變的突變生物合成 與微生物新藥的發(fā)現(xiàn) 突變生物合成（ mutational biosynthesis）： 突變生物合成是指野生型產(chǎn)生菌經(jīng)化學(xué)或物理等 因素誘變處理后，喪失合成原來次級代謝產(chǎn)物的 能力而成為阻斷突變株，然后在發(fā)酵培養(yǎng)阻斷突 變株時(shí)添加某種外源物質(zhì)，參與生物合成以獲得 新的次級代謝產(chǎn)物的過程。 另外，突變生物合成也包括由于突變而引起產(chǎn)生 新的次級代謝產(chǎn)物。 突變生物合成原理 阻斷突變株的類型 營養(yǎng)缺陷型突變株： 由于編碼菌體生長之必須的酶的基因發(fā)生了突 變，而使菌體不能生長，導(dǎo)致不能合成次級代 謝產(chǎn)物。因此，這類突變株也可以稱為初級代 謝阻斷突變株。 獨(dú)需型突變株： 這種突變株的生長和初級代謝正常，但由于編 碼次級代謝產(chǎn)物合成的某一基因發(fā)生突變，而 使喪失了合成次級代謝產(chǎn)物的能力。這是突變 生物合成所需要的突變株。 雙重阻斷突變株： 即突變既發(fā)生在編碼初級代謝酶的基因上，也 發(fā)生在編碼次級代謝酶的基因上。 突變生物合成與微生物新藥發(fā)現(xiàn) . 野生型產(chǎn)生菌 獨(dú)需型突變株 A B 正常途徑 某抗生素 阻斷變株 A 阻斷變株 B A B + B A + A B A B A， B為某一抗生素分子結(jié)構(gòu)的兩個(gè)部分 A B 為發(fā)酵液培養(yǎng)時(shí)阻斷變株的代謝產(chǎn)物 B A 為發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)添加的 A B 的結(jié)構(gòu)類似物 A B A B 即為新的雜合抗生素 利用獨(dú)需型突變株合成產(chǎn)生新抗生素的基本原理 突變生物合成的 基本流程 . 出發(fā)菌株的選擇 誘變處理 阻斷突變株篩選 瓊脂塊法選擇 有生理活力的突變株 無生理活力的突變株 搖瓶復(fù)篩 有生理活力的突變株 無生理活力的突變株 區(qū)段合成產(chǎn)物 ， 連接 酶等生化特性的研究 有區(qū)段合成產(chǎn)物 、 無 連接酶等活性的突變 株 有區(qū)段產(chǎn)物 A有連接 酶等活性的突變株 有區(qū)段產(chǎn)物 B有連接 酶等活性的突變株 發(fā)酵培養(yǎng) 添加結(jié)構(gòu)類似物 A或 B 樣品收集 TLC、 HPLC檢測及制備 結(jié)構(gòu)檢測 突變生物合成產(chǎn)生的新抗生素 . 菌種 抗生素 特殊營養(yǎng) 增補(bǔ)物 新抗生素 伊尼奧小單孢菌 西梭霉素 DOS 鏈霉胺等 突變霉素 1等 絳紅小單孢菌 慶大霉素 DOS 鏈霉胺等 2羥基 GM等 紅霉素鏈霉菌 紅霉素 Erythronolide 8， 8 deoxyoleanolie 未鑒別 弗氏鏈霉菌 新霉素 DOS 鏈霉胍等 雜交霉素 A， B 加利利鏈霉菌 阿克拉霉素 阿克拉酮 紫紅霉酮等 11羥基阿克拉霉 素 A 灰色鏈霉菌 鏈霉素 紫紅霉酮等 2脫氧鏈霉胍 streptomutin A 卡那霉素鏈霉菌 卡那霉素 DOS 1 N甲基 DOS等 1 N甲基 GM等 雪白鏈霉菌 新生霉素 氨基香豆 氨基香豆素同系物 未鑒明 核糖苷鏈霉菌 核糖霉素 DOS 1 N甲基 DOS等 1 N甲基 RSMC等 普拉特鏈霉菌 普拉特霉素 Platenolide Narbonolide 5 O mycaminosyl narbonolide 龜裂鏈霉菌 巴龍霉素 DOS 鏈霉胍 雜交霉素 C 巴龍鏈霉菌 尼可霉素 尿嘧啶 嘧啶 尼可霉素 Z等 唐德鏈霉菌 紅霉素生物 合成途徑 . 丙酮 CoA 丙酰 S ACP 甲基丙二酰 甲基丙二酰 S ACP 丙酰丙酰 S ACP 聚酮體途徑 6脫氧紅霉內(nèi)脂 B 紅霉內(nèi)脂 B TDP L碳霉糖 葡萄糖 TDP D葡萄糖 3 O碳霉糖基紅霉內(nèi)脂 TDP脫氧氨基己糖 紅霉素 D 紅霉素 C 紅霉素 A 紅霉素 E 紅霉素 B 縮合酶 突變株產(chǎn)生的 新蒽環(huán)類抗生素 . O O OR R 1 O H O H R 2 N H 2 O H H 3 C 1 2 3 4 5 6 7 8 91 01 11 2 1 2 3 4 5 6 4 O C H O C H 2 C H O H C H 3 C H C H 3 C H 2 O H R R1 R2 道若霉素（原株產(chǎn)生） OCH3 COCH3 OH 亞德里亞霉素（變株產(chǎn)生） OCH3 COCH2OH OH 13雙氫道若霉素（變株產(chǎn)生） OCH3 CHOHCH3 OH 13雙氫洋紅霉素 OH COCH3 OH 11去氧道若霉素（變株產(chǎn)生） OCH3 COCH2OH H 11去氧亞德里亞霉素（變株產(chǎn)生） OCH3 CH2CH3 H BaumycinA*（原株產(chǎn)生） OCH3 CH2COCH3 OH Feudomycin A（變株產(chǎn)生） OCH3 CH2CH3 OH Feudomycin B OCH3 CH2COCH3 OH 突變株產(chǎn)生的一些新的次級代謝產(chǎn)物 . 原菌種 原抗生素 突變株產(chǎn)生的新抗生素 普拉特鏈霉菌 普拉特霉素 demycarosyl普拉特霉素 9 dehydromycarosyle普拉特霉素 波賽鏈霉菌 紫產(chǎn)色鏈霉菌 柔紅霉素 燼灰紅菌素 阿霉素 燼灰紅菌素 X 波賽鏈霉菌 baumycin oxaunomycin 棘孢小單孢菌 慶大霉素 小諾霉素 生金鏈霉菌 四環(huán)素 去甲基四環(huán)素 生金鏈霉菌 金霉素 去甲基金霉素 龜裂鏈霉菌 土霉素 去甲基土霉素 吸水鏈霉菌 carriomycin carromycinA 我國應(yīng)用突變生物合成原理找到的小諾霉素 . O O O O H O H O H 3 C H N O H H O H 2 N N H 2 H 2 N C H R 2 R 1 2H2SO4 慶大霉素和小諾霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu) 抗生素 R1 R2 分子式 硫酸慶大霉素 C1 CH3 NHCH3 C21H43N5O72H2SO4 硫酸慶大霉素 C1a H NH2 C19H39N5O72H2SO4 硫酸慶大霉素 C2 CH3 NH2 C20H41N5O72H2SO4 小諾霉素 H NHCH3 C20H41N5O72H2SO4 四、原生質(zhì)體融合與微生物新藥的發(fā)現(xiàn) 微生物原生質(zhì)體融合，即是指將雙新株的微生物 細(xì)胞分別通過酶解脫壁，使之形成原生質(zhì)體，然 后在高滲溶液的條件下混合，并加入物理的（如 電融合）或化學(xué)的 (如聚乙二醇 )或生物的（如仙 臺病毒）助融條件，使雙親株的原生質(zhì)發(fā)生相互 凝集，通過細(xì)胞質(zhì)融合，核融合，爾后發(fā)生基因 組間的交換，重組，進(jìn)而可以在適宜的條件下再 生出微生物細(xì)胞壁，獲得重組子的過程。 四、原生質(zhì)體融合與微生物新藥的發(fā)現(xiàn) 利用微生物厚生質(zhì)融合尋找新抗生素的基 本原理是來源于兩種已知產(chǎn)生不同抗生素 的產(chǎn)生菌的融合子，有可能將它們的部分 生物合成基因整合在一起而產(chǎn)生新的雜合 抗生素；另一個(gè)原理是由于抗生素產(chǎn)生菌 中存在著沈默基因，當(dāng)這些沉默基因受到 外源物質(zhì)刺激后，有可能被激活而產(chǎn)生， 結(jié)構(gòu)與親株完全不同的新的抗生素。 四、原生質(zhì)體融合與微生物新藥的發(fā)現(xiàn) 應(yīng)用這種方法獲得的第一個(gè)新抗生素是吲 哚佐霉素（ indloizomycin）： 其親株為鏈霉素產(chǎn)生菌灰色霉菌和天神霉 素（ istamycin）產(chǎn)生菌天神鏈霉菌 S.tenjimariensis。 （目前的報(bào)道較少） 第二節(jié) 生物合成途徑的基因定向改變 與微生物新藥的發(fā)現(xiàn) 組合生物合成 Combinatorial biosynthesis 是一種通過對天然產(chǎn)物生物合成途徑中的 基因進(jìn)行中斷、置換及重組等操作，改變 原來抗生素產(chǎn)生菌或其他天然產(chǎn)物產(chǎn)生菌 生物合成代謝產(chǎn)物的途徑，產(chǎn)生具有新穎 結(jié)構(gòu)的 “ 非天然的天然雜合產(chǎn)物 （ unnatural natural hybrid compounds） ” 的技術(shù)或方法。 組合生物合成的潛能 potential 重組、組合、互補(bǔ)、替換 R=可利用的基因 n=基因的等位形 式 化合物數(shù) Rn R=4, n=4 Compounds=44=256 組合生物合成的原理 生物合成酶基因的結(jié)構(gòu)和組成 生物合成酶基因的特異性及底物寬容性 生物合成酶基因之間的相互作用 生物合成途徑的研究基礎(chǔ) 一、具有聚酮體生物合成途徑的 微生物藥物產(chǎn)生菌的組合生物合成 基于商業(yè)性的原因，迄今為止，對一些具有 聚 酮體生物合成（ polyketide synthases， PKSs） 途徑的 “ 天然產(chǎn)物 ” ，如紅霉素、阿維菌素、 泰樂菌素、柔紅霉素、阿克拉霉素、西羅莫司 和利福霉素等； 具 PKS途徑的抗生素 藥物類別 化 合 物 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素 紅霉素、螺旋霉素、麥迪霉素 四環(huán)類抗生素 四環(huán)素、金霉素、土霉素 抗腫瘤抗生素 柔紅霉素，阿克拉霉素、 enediynes 抗寄生蟲藥 avermectin， nemadectin 免疫抑制劑 FK506, rapamycin 抗真菌藥 兩性霉素，制霉菌素 心血管藥物 lovastatin,， compactin 獸藥 莫能星 （ monensin） ， 泰樂菌素 (tylosin)， 鹽霉素 1、紅霉素產(chǎn)生菌的組合生物合成 通過操作 PKS的模塊中 單個(gè)基因 的組合生物 合成； 在 非天然產(chǎn)物產(chǎn)生菌 中過量表達(dá)組合生物 合成產(chǎn)物； 通過操作 PKS模塊之間連接 的組合生物合 成 ； 通過操作 脫氧糖途徑基因 的組合生物合成。 紅霉素產(chǎn)生菌的組合生物合成的可能性 參與紅霉素生物合成的 PKSs，或 6脫氧紅霉內(nèi)酯 合成酶（ 6-deoxyerythronolide B synthase， DEBS）有 6個(gè)模塊組成，每個(gè)模塊負(fù)責(zé)合成聚酮體 中的一部分。 由于各模塊之間的協(xié)調(diào)性，以及每個(gè)模塊編碼決 定延伸單位的選擇、功能和立體化學(xué)性質(zhì)的催化 結(jié)構(gòu)域，因此，就有可能通過對 PKSs結(jié)構(gòu)域或模 塊的操作獲得具有新穎結(jié)構(gòu)的化合物。 由于具有聚酮體結(jié)構(gòu)的化合物其結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜和 具有眾多的立體異構(gòu)體，因而，難以用常規(guī)的化 學(xué)方法來獲得。 紅 霉 素 的 生 物 合 成 途 徑 PKS中的每一個(gè)模塊的組成 酮基合成酶（ ketosynthase， KS） 酰基轉(zhuǎn)移酶（ acyl transferase， AT） 酰基載體蛋白（ acyl carrier protein， ACP -酮基修飾酶：包括酮基還原酶 （ ketoreductase， KR）、脫氫酶 （ dehydrogenase， DH）和烯酰還原酶 （ enoylreductase， ER） DEBS含有編碼三個(gè)獨(dú)立的多肽亞單位的 6個(gè)模塊 大多數(shù)典型的聚酮體合成途徑的產(chǎn)物包括對 PKS產(chǎn) 物的修飾，如將脫氧糖或氨基糖進(jìn)行糖苷化以及 通過細(xì)胞色素 P450進(jìn)行氧化。圖中所示的 LD為裝 載域（ loading domains）， TE為硫酯酶 （ esterases）。 1）通過操作 PKS的模塊中單個(gè)基因的組合生物合成 一是用利福霉素 PKS模 塊 2中的 DH/ER/KR結(jié)構(gòu) 域取代紅霉素 PKS模塊 2中的 KR； 二是將模塊 5中的 KR缺 失； 三是用利福霉素模塊 2 中的丙二酰特異性 AT取代模塊 6中的甲基 丙二酰特異性的 AT），將得到一個(gè)發(fā) 生三重突變的 PKS產(chǎn)物。 2）在非天然產(chǎn)物產(chǎn)生菌中過量 表達(dá)組合生物合成產(chǎn)物 將 E.coli 開發(fā)成能夠表達(dá) PKS產(chǎn)物需要解 決的問題主要有三個(gè)方面： 一是能夠功能性表達(dá)巨大的蛋白 （ 330kDa）； 二是 PKS亞單位的 ACP結(jié)構(gòu)域的翻譯后磷酸 泛酰巰基乙胺?；?； 三是聚酮體途徑中的前體物質(zhì)，特別是 （ 2S）甲基丙二酰 CoA在 E.coli中不存 在。 Pfeifer等的工作包括： 運(yùn)用來源于枯草芽孢桿菌非核糖體多肽合成酶 （ NRPS）基因簇的磷酸泛酰巰基乙胺酰轉(zhuǎn)移酶 （ phosphopantetheinyl transferase）基因 sfp， 以對 PKS亞單位的 ACP結(jié)構(gòu)域的翻譯后磷酸泛酰巰 基乙胺?；?； 過量表達(dá) E.coli中的丙酰 CoA合成酶基因 prpE， 擾亂丙酰 CoA代謝途徑，以及過量表達(dá)來自 S.coelicolar的丙酰 CoA羧化酶基因 pcc，使丙 酰 CoA轉(zhuǎn)化為（ 2S）甲基丙二酰 CoA 3）通過操作 PKS模塊之間連接的組合生物合成 通過對 DEBS模塊在 E.coli和體外的表達(dá)研究，發(fā) 現(xiàn)在 PKS裝配過程中那些短的模塊內(nèi)和多肽內(nèi)的 “ 連接件 ” 是至關(guān)重要的成分。研究發(fā)現(xiàn)在相繼 非共價(jià)連接的模塊中，其氨基和羧基末端存在有 多肽內(nèi)連接件，這種連接件與單個(gè)多肽內(nèi)的模塊 之間的連接件不同。 因此，使用一種合適的連接件就有可能允許雜合 的模塊之間進(jìn)行功能性連接。 a：已經(jīng)鑒定了不同的 模塊內(nèi)和多肽內(nèi)的連接 件，并由此指導(dǎo)合成模 塊之間的聚酮體中間體， 這里需要合適的氨基和 羧基末端連接配對，以 產(chǎn)生功能性連接模塊； b：在構(gòu)建功能性互補(bǔ) 體時(shí)，可以使用編碼來 源于不同微生物多個(gè)模 塊的全亞基； 如圖所示：來源于苦霉 素（ picromycin）的 PKS（ PikAI和 PikAII）， 與來源于竹桃霉素 （ oleandomycin）的 PKS（ OleA3）相結(jié)合。 4）通過操作脫氧糖途徑基因的組合生物合成 對已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的由自然界中植物、真菌和細(xì)菌產(chǎn)生 的很多具有生理活性的糖苷類化合物的分析發(fā)現(xiàn)， 連接在苷元上的糖基的結(jié)構(gòu)大多為 6-脫氧己糖 （ 6-deoxyhexoses, 6DOHs）。 據(jù)統(tǒng)計(jì)，這些具有生理活性的糖苷類化合物的結(jié) 構(gòu)上含有 70多種不同的 6-脫氧己糖。 6-脫氧己糖的種類 具有生理活性的化合物 產(chǎn)生菌 * D-Desosamine 紅霉素 竹桃霉素 苦霉素 巨大霉素 Sacc.erythraea S.antibioticus S.Venezuelae M.megalomicea D-Olivose 光輝霉素 烏達(dá)霉素 Landomycin S.argillaceus S.fradiae S.cyanogenus D-Oliose 光輝霉素 S.argillaceus D-Mycarose 光輝霉素 S.argillaceus D-Mycaminose 泰樂星 S.fradiae D-Mycinose 泰樂星 S.fradiae D-Mycosamine 制霉菌素 S.noursei L-Dihydrostreptose 鏈霉素 S.griseus L-Oleandrose 竹桃霉素 阿弗米丁 S.antibioticus S.avermitillis L-Mycarose 紅霉素 巨大霉素 泰樂星 Sacc.erythraea M.megalomicea S.fradiae L-Noviose 新生霉素 S.spheroides L-Rhodinose 烏達(dá)霉素 Landomycin Granaticin S.fradiae S.cyanogenus S.violaceoruber L-Daunosamine 柔紅霉素 S.peucetius L-Nogalose Nogalamycin S.nogalater L-Megosamine* 巨大霉素 M.megalomicea L-Rhodosamine 阿克拉霉素 S.galilaeus L-Epivancosamine Chloroeremomycin A.orientalis 2-Deoxy-L-fucose 阿克拉霉素 S.galilaeus O O O O O O O O O O D - D e o x y h e x o s e s C H 3 N ( C H 3 ) 2 O H O H O H o h O H O H O H O H O H O H C H 3 C H 3 O H C H 3 O H O M e O M e C H 3 N ( C H 3 ) 2 O H O H C H 3 N ( C H 3 ) 2 O H C H 3 C H 3 O H O H O H C H 3 O M e O H C H 3 O H O H C H 3 O H N H 2 O H N H 2 O H C H 3 O H D - F o r o s a m i n e D - O l i o s e D - M y c i n o s e D - M y c a m i n o s e D - D e s o s a m i n e D - M y c a r o s e D - C h a l c o s e D - O l i v o s e D - P e r o s a m i n e D - M y c o s a m i n e O O O O O O O O C H 3 O H O H O H O H O H O H O H O H O H O H O H O M e C H 3 O H C H 3 O H N H 2 O H N ( C H 3 ) 2 C H 3 C H 3 O H O H C H 3 C H 3 O M e O H C H 3 C H 3 C H 3 O H O H O H C H 3 O H O H O H C H 3 O H O H O H N H 2 C H 3 C H 3 O H L - D e o x y h e x o s e s L - O l e a n d r o s e L - R h o d i n o s e L - D a u n o s a m i n e L - R n o d o s a m i n e L - M y c a r o s e L - C l a c i n o s e L - N o g a i o s e L - O l i o s e L - N o v i o s e L - E p i v a n c o s a m i n e 由放線菌產(chǎn)生的具有不同生理活性 的糖苷化合物的結(jié)構(gòu)特性 具有 單糖殘基 的化合物：紅霉素 A、柔紅霉素、 urdamycin A和 rebeccamycin； 具有 雙糖殘基 的化合物：光輝霉素 （ mithramycin）； 具有 三糖殘基 的化合物：烏達(dá)霉素 A（ urdamycin A） 和光輝霉素（前者同時(shí)具有單糖和三糖殘基，后者 同時(shí)具有雙糖和三糖殘基）； 以 O-糖苷鍵連接 的化合物：紅霉素 A、光輝霉素、 柔紅霉素和烏達(dá)霉素 A； 以 C-糖苷鍵連接 的化合物：烏達(dá)霉素 A； 以 N-糖苷鍵連接 的化合物： rebeccamycin。 O O H C H 3 O O H O O C H 3 O H O O H 3 C N H 2 H O D o x o r u b i c i n O O O O O O O O O O C H 3 O H O HO C H 3 H O OO HO H H 3 C H O H 3 C H O H O H 3 C H 3 C H O O H H 3 C H O H 3 C O H C H 3 M i t h r a m y c i n O H O H 3 C C H 3 O O O O C H 3H 3 C H O H 3 C O H C H 3 C H 3 O H O N ( C H 3 ) 2 C H 3 O O M e C H 3 O H C H 3 E r y t h r o m y c i n A H N N N H O O C l C l O O H O H O M e H O R e b e c c a m y c i n O OO H C H 3 O H O H O O O H C H 3 O O C H 3 H O O O H 3 C O O H 3 C H O H O U r d a m y c i n A 由放線 菌產(chǎn)生 的具有 不同生 理活性 的糖苷 化合物 的化學(xué) 結(jié)構(gòu) a）通過將竹桃霉素產(chǎn)生菌 S.antibioticus中齊墩果糖基轉(zhuǎn)移酶基因在不同的 S.erythraea中的表達(dá)，得到了 3 O鼠李糖基紅霉素和 6 dEB衍生物，以及一 個(gè) desosaminylated tylactone； b）改造來源于刺孢霉素（ calicheamicin）產(chǎn)生菌的基因，可以得到一個(gè)新的脫 氧氨基糖，并將其附著在 S.lividans產(chǎn)生的苷元上； c）在 S.lividans產(chǎn)生菌中構(gòu)建 desosamine的途徑，然后導(dǎo) 入通過遺傳操作的 DEBS，可以得到具有新穎結(jié)構(gòu)的 desosaminylated大環(huán)內(nèi)酯類文庫。 ( a ) S . e r y t h r a e a B V 8 8 ( e r y B V - ) ( + o i e G l l ) S u g a r s O l e G i l O C H 3 O H O H C H 3 O H 3 C O C H 3 O H H 3 C C H 3 H 3 C G T F O H 3 C C H 3 O O O O C H 3 C H 3 O H H 3 C C H 3 H 3 C O H O N ( C H 3 ) 2 C H 3 O O H O H C H 3 O H 3 - O - r h a m n o s y l - 6 - d e o x y e r y t h r o m y c i n B 將竹桃霉素產(chǎn)生菌抗生鏈 霉菌中編碼竹桃霉素 oleandrose糖基轉(zhuǎn)移酶的基 因 oleGII，（該酶負(fù)責(zé)將 相應(yīng)的糖基轉(zhuǎn)移到 8， 8a- 脫氧竹桃內(nèi)酯（ 8， 8a- deoxyoleandolide）的 4 位羥基上），整合到紅霉 素產(chǎn)生菌 eryBV缺失突變株 中， eryBV基因編碼的糖 基轉(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)將 L- mycarose糖基轉(zhuǎn)移到 6-脫 氧紅霉內(nèi)酯（ 6- deoxyerythronolide）甙元 的相同位置 ，并進(jìn)行表達(dá)， 結(jié)果得到了將天然糖基 L- rhamnose轉(zhuǎn)移到 6-脫氧紅 霉內(nèi)酯 4位的新紅霉素衍 生物，其具有抗菌活性 ， 將 泰樂菌素產(chǎn)生菌弗氏鏈霉菌中編 碼 mycaminose糖基轉(zhuǎn)移到泰樂菌 素甙元上的轉(zhuǎn)移酶基因 tylM2整合 到紅霉素產(chǎn)生菌三缺失突變株 SGT2，（分別缺失聚酮體合成酶 基因、 mycarose和 desosamine糖基 轉(zhuǎn)移酶基因，但仍然具有合成 L- mycarose和 D-desosamine的能力）， 并使之表達(dá)，同時(shí)在培養(yǎng)過程中外 源加入 16-元環(huán)的泰樂酮 （ tylactone），結(jié)果得到一種新的 泰樂星衍生物 5-O-desosaminyl- tylactone，如圖）所示。說明泰樂 菌素產(chǎn)生菌中的轉(zhuǎn)移酶 TylM2能夠 識別和轉(zhuǎn)移不同的氨基糖。 這兩個(gè)例子同時(shí)也表明抗生素糖基 轉(zhuǎn)移酶具有較寬的底物專一性 。 ( b ) S . e r y t h r a e a S G T 2 ( e r y A - , e r y B V - , e r y C l l l - ) ( + t y l M 2 ) t r y M 2 G T F S u g a r s O O H O H O O C H 3 C H 2 H 3 C C H 3 H 3 C H 3 C O H 3 C O O H O O C H 3 C H 3 H 3 C H 3 C C H 3 O H O N ( C H 3 ) 2 C H 3 5 - O - d e s o s a m i n y l - t y l a c t o n e 5）通過表達(dá)雜合基因方法 的組合生物合成 第一個(gè)例子是應(yīng)用有些大環(huán)內(nèi)酯類抗生素 3或 4位 的羥基?；富?，使某些大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在相 應(yīng)的位置酰化： 1）異戊酰螺旋霉素 （來自碳霉素的 4”異戊酰輔酶 A 轉(zhuǎn)移酶的 carE基因 ）； 2）丙酰螺旋霉素 （來自麥迪霉素的 4”丙?；傅?mpt基因）； 3）乙酰泰樂菌素 等（來自碳霉素的 3 O乙酰轉(zhuǎn)移 酶的 acyA基因）。 引入外源酶基因產(chǎn)生雜合抗生素 丙酰螺旋霉素基因工程菌構(gòu)建圖 必特螺旋霉素的結(jié)構(gòu) R1 H R2 COCH2CH(CH3)2 COCH3 COCH2CH2CH3 COCH2CH3 COCH2CH3 COCH3 2、蒽環(huán)類抗生素產(chǎn)生菌 的組合生物合成 蒽環(huán)類抗生素是一類臨床上非常重要的抗 腫瘤抗生素，它們同樣是 PKS生物合成途徑， 因此，通過以下集中組合生物合成的方法， 可以得到一系列 “ 非天然的天然雜合化合 物 ” 。 1）通過破壞靶基因的組合生物合成 通過基因框內(nèi)的誘變或缺失，或插入抗生 素耐藥基因盒的方法，可以將所選擇的靶 基因特異性地鈍化； 盡管靶基因的破壞可以得到新的化合物， 但會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果，這是因?yàn)橐环矫嬗?于極性效應(yīng)影響下游基因的表達(dá)，另一方 面受到由于外源 DNA片斷的插入造成的反義 RNA合成影響上游基因。 1）通過破壞靶基因的組合生物合成 在光神霉素（ mithramycin）產(chǎn)生菌 S.argillaceus中， 破壞編碼葡萄糖 1磷酸 胸苷 5三磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶的基因 mtmD后，獲 得了兩個(gè)四環(huán)類的光神霉素衍生物： premithramycinone和 4脫甲基 premithramycinone衍生物； Premithramycinone的抗腫瘤生物活性與光神霉 素相似，且有趣的是其化學(xué)結(jié)構(gòu)與來源于黑曲霉 A.niger的神經(jīng)肽受體抑制劑 BMS非常相似，如圖 所示。 通過基因破壞后得到的兩個(gè)光神霉素 衍生物和 BMS-192548 2）通過表達(dá)雜合基因方法 的組合生物合成 來源于 S.fradiae的 urdE基因，編碼一種氧 化酶，其可能涉及到將 1分子氧引入到烏達(dá) 霉素結(jié)構(gòu)中； 在控制啟動(dòng)子 ermE的條件下，將其在丁省 霉素 C產(chǎn)生菌 S.glaucescens中表達(dá)，產(chǎn)生 一種新的雜合化合物， 6羥基丁省霉素 C， 如圖所示。 通過將烏達(dá)霉素產(chǎn)生菌的 urdE基因在丁省霉素 C產(chǎn)生菌 中表達(dá)，得到一種雜合產(chǎn)物 6羥基丁省霉素 C 2）通過表達(dá)雜合基因方法 的組合生物合成 另外一個(gè)實(shí)例是，將柔紅霉素產(chǎn)生菌 S.peucetius中 編碼 11-aklavinone-羥化酶 的基因（ dnrF），在阿克拉霉素產(chǎn)生菌 S.galilaeus中表達(dá)， 結(jié)果得到了一種新的 雜合化合物， 11羥基阿克拉霉素 A，如圖 所示。 這種羥基化的產(chǎn)物，其對白血病細(xì)胞和黑 色素瘤細(xì)胞的生物活性比阿克拉霉素要強(qiáng)。 雜合化合物 11羥基阿克拉霉素 A的組合生物合成 2）通過表達(dá)雜合基因方法 的組合生物合成 通過這種組合生物合成的方法，已經(jīng)獲得了數(shù) 個(gè)雜合糖苷化的丁省霉素，如用含有一個(gè)完整 埃羅霉素（ elloramycin）基因簇（具有產(chǎn)生 8 去甲基丁省霉素 C的能力）的黏粒轉(zhuǎn)化烏達(dá)霉 素產(chǎn)生菌或光神霉素產(chǎn)生菌，可以得到四種新 的糖苷化合物：齊墩果糖基、鼠李糖基、 mycarosyl丁省霉素 C和雙齊墩果糖基丁省霉素 C， 如圖所示。 有趣的是，這些脫氧糖在烏達(dá)霉素和光神霉 素苷元上的附著位置，與在埃羅霉素的附著位 置不同。表明，這些聚酮體的糖基轉(zhuǎn)移酶具有 底物寬泛性。 雜合糖苷化丁省霉素的組合生物合成 能夠被 ElmGT糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移的一些 糖基和 elloramycin甙元的結(jié)構(gòu) O C H 3 OO O O HC H 3 H 3 C O O C R 2 O O H O H O R 1 R 2 R 1 L - R h a m n o s e OH 3 C H O H O O H L - R h o d i n o s e O O H H 3 C L - O l i v o s e O H O H O H 3 C L - O l e a n d r o s e O H 3 C H O M e O O H 3 C M e O M e O O H 3 C H O H O O H 3 C H O H 3 C O H 3 C H O O O H O H O H 3 C 3 , 4 - D i m e t h o x y - L - o l i v o s e D - O l i v o s e D - M y c a r o s e D - D i o l i v o s e 表柔紅霉素和表阿霉素基因工程菌的構(gòu)建 O OO C H 3 O H O H O H O H C H 3 O O H 3 C O H H 2 N D a u n o m y c i n o n e D a u n o s a m i n e 柔 紅 霉 素 O O O H O HO C H 3 O O H H C H 3 O O H O H 3 C H 2 N 表 柔 紅 霉 素 O OO C H 3 O H O H O O H H O O H 3 C O H O H N H 2 A d r i a m y c i n o n e D a u n o s a m i n e 阿 霉 素 O O O HO C H 3 O H O O H H O H O O H 2 N H O H 3 C 表 阿 霉 素 表柔紅霉素和表阿霉素基因工程菌的構(gòu)建 通過 鈍化 dnmV基因 ，得到一個(gè)柔紅霉素和阿霉素產(chǎn) 生菌的阻斷突變株， dnmV基因編碼 4酮基還原酶， 其與合成這類抗生素結(jié)構(gòu)中的脫氧糖，柔毛霉胺的 合成有關(guān)。 分別將阿維菌素產(chǎn)生菌中編碼 合成齊墩果糖的基因 avrE，以及紅霉素產(chǎn)生菌中編碼 合成 mycarose的基 因 eryBIV，克隆到 dnmV基因阻斷突變株中。 由于重組工程菌中的外源基因表達(dá)的 4-酮基還原酶 的特性與柔紅霉素產(chǎn)生菌中的 4-酮基還原酶不同， 前者具有非對映立體催化特性而能夠形成 L- epidaunosamine（表柔毛霉氨） 。而突變株 dnmV生 物合成甙元的能力和合成糖基轉(zhuǎn)移酶的能力仍然保 持，且由于糖基轉(zhuǎn)移酶的底物專一性較差而不影響 將表柔毛霉氨連接在原來的蒽環(huán)酮上，從而得到 4- 表柔紅霉素和 4-表阿霉素 ，如圖所示。 表柔紅霉素和表阿霉素基因工程菌的構(gòu)建 O O H O O H O O O H O H O O M e N H 2 C H 3 O H O O H O O H O O O H O H O O M e N H 2 C H 3OH a ve E e r yE I V 阿霉素 4 - 表阿霉素 二、具有非核糖體生物合成肽類途徑的 微生物藥物產(chǎn)生菌的組合生物合成 具有 非核糖體生物合成途徑（ none ribosomal peptide synthases， NRPSs） 的環(huán)肽或糖肽類 “ 天然產(chǎn)物 ” ，如萬古霉 素、博萊霉素、環(huán)孢菌素 A和埃坡霉素等進(jìn) 行了大量的研究工作，并取得了令人注目 的成果。 Chloroeremomycin 生物合成 （ 1）小分子準(zhǔn)備 在酶的催化下生成裝配過程中 需要的小分子化合物，對于萬古霉素族糖肽類抗 生素而言包括： 非蛋白氨基酸和 TDP-L-b- epivancosamine； （ 2）裝配 上步準(zhǔn)備好的氨基酸通過腺苷化反應(yīng) （ adenylation）轉(zhuǎn)換成為腺苷酸，而后與鄰近肽 載體蛋白（ peptide carrier protein, PCP）上 的巰基形成硫酯（ thiolation）， PCP之間的縮合 功能域（ condensation）催化肽鍵形成。經(jīng)過幾 個(gè)延伸過程，最后 TE域?qū)⑼瓿傻碾那邢隆Ｓ袝r(shí)過 程中還會(huì)有差向異構(gòu)作用 (epimerisation)。 （ 3）裝配后修飾 在這步反應(yīng)中通常進(jìn)行氧化反 應(yīng)和糖基化，對于有的化合物還存在 N端甲基化反 應(yīng)。 萬古霉素的生物合成 另據(jù)研究，天然的萬古霉素生物合成共有 35 步，其先以 五種自由的氨基酸單體合成一線 形的七肽 ，然后芳基邊鏈在交聯(lián)酶的催化下 適時(shí)地組合、交聯(lián)，形成復(fù)雜的七肽骨架， 最后 UDP-glucose和 UDP-4-epi-vancosamine 在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下連接到七肽骨架上。 萬古霉素生物合成的五種起始自由氨基酸單體 萬古霉素生物合成的逆向合成分析圖 在萬古霉素家族中發(fā)現(xiàn)的糖基 GtfE糖基轉(zhuǎn)移酶識別并將 UDP-glucose 轉(zhuǎn)移至七肽骨架上 GtfD糖基 轉(zhuǎn)移酶 識別并 將 4 epi vancosamine 連接至 萬古霉 素骨架上 2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀 糖肽類抗生素的組合生物合成主要有 4條途經(jīng) : 第一，提供新的氨基酸單體，或者是利用已知生物合成途 經(jīng)中的酶來催化生成新的我們所需要的氨基酸單體，使合 成新的七肽骨架 ; 第二，改變七肽 NRPS裝配線上的基因，從而達(dá)到重新設(shè)計(jì) 生物合成途經(jīng)的目的 ; 第三，在七肽裝配之后，干預(yù)修飾酶（ tailoring）作用 的步驟，包括 N甲基化、酪氨酸的 羥化等 ; 第四，利用糖基轉(zhuǎn)移酶將不同結(jié)構(gòu)的糖基與不同苷元連接 以及連接不同的個(gè)數(shù)，從而產(chǎn)生具有不同生理活性的最終 產(chǎn)物。因此糖苷化酶可以作為一種制備各種不同糖苷化合 物的催化劑，有可能從中找到具有潛在應(yīng)用價(jià)值的新活性 物質(zhì)。 2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀 Solenberg等從萬古霉素產(chǎn)生菌東方擬無枝酸菌 C329.4中克隆到了兩個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因 gtfE和 gtfD，并從 chloroeremomycin產(chǎn)生菌中克隆到了 3 個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因 gtfA、 gtfB和 gtfC; 將 gtfB和 gtfE在大腸埃希氏菌中表達(dá)，研究了其 體外活性。結(jié)果表明當(dāng) TDP-葡萄糖存在時(shí)，從大 腸埃希氏菌中表達(dá)的糖基轉(zhuǎn)移酶 GtfB和 GtfE能夠 在體外將葡萄糖轉(zhuǎn)移到萬古霉素糖苷上，從而得 到中間體 DVV（ desvancosaminyl vancomycin） ; 當(dāng)?shù)孜飺Q為 UDP葡萄糖， UDP-D-木糖時(shí)，仍然能 夠轉(zhuǎn)移到萬古霉素糖苷上 ; GtfE也能夠?qū)?TDP/UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移到無糖基化的 化合物 A47934和 A41030上，而 GtfB不能將化合物 A47934糖基化，表明 GtfE相對于 GtfB底物特異性 差。 2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀 在 Matsushima等建立地?zé)o糖基化合物 A47934產(chǎn)生菌豐加鏈霉菌（ Streptomyces toyocanesis）基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的基礎(chǔ)上， Solenberg等還成功地將含有糖基轉(zhuǎn)移酶基 因 gtfE的質(zhì)粒導(dǎo)入到豐加鏈霉菌中，得到 了糖基化的 A47934衍生物。 GtfE和 GtfB在體內(nèi)進(jìn)行的糖苷化反應(yīng) 2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀 Losey等采用化學(xué)酶法合成了很多 NDP-葡萄糖的類 似物來研究 GtfD和 GtfE的催化活性。結(jié)果表明， GtfE不但能用 UDP-葡萄糖類似物， TDP-葡萄糖類 似物作為糖基供體，同時(shí)還可以采用脫氧葡萄糖 類似物以及氨基在 2、 3、 4、或 6位的 TDP/UDP-葡 萄糖類似物作為糖基供體 ; 更值得注意的是，一般來講 GtfD將 vancosamine連 接至萬古霉素的假糖苷的葡萄糖配基上，試驗(yàn)結(jié) 果表明 GtfD還可以將 4-epi-vancosamine連接至 GtfE以不同的糖基供體為底物所催化生成的衍生 物上（糖基化位點(diǎn)在 2-脫氧的除外）。這樣產(chǎn)生 的帶有兩個(gè)氨基糖的萬古霉素衍生物就提供了一 種新的結(jié)構(gòu)，以便于繼續(xù)進(jìn)行類似于 oritavancin 的烷基化從而提高生物活性。 2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀 Chen等從 chloroeremomycin 的生物合成基因 簇中克隆到了 L-epivancosamine的合成基因， 在大腸埃希氏菌中表達(dá)，并成功地在體外重建了 從 TDP-4-酮基 -6-脫氧 D-葡萄糖經(jīng)過 C-2脫氧合作 用 (deoxygenation)、 C-3胺化 (amination)、甲 基化 (methylation)、 C-4酮基還原、 C-5表構(gòu)異化 等步驟得到了 TDP-L epivancosamine。這個(gè)糖 基的基因克隆和表達(dá)為以后組合生物合成提供了 信息。 2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀 對萬古霉素等糖肽類抗生素進(jìn)行的組合生 物合成，不單單可以通過外源添加不同的 糖基供體，還可以通過將產(chǎn)生菌體內(nèi)原有 的糖合成途徑進(jìn)行破壞或置換、以及對糖 基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行改造等改變糖基化方式產(chǎn)生 新的化合物 ; 另外，對肽骨架裝配時(shí)所需的氨基酸生物 合成的了解以及相關(guān)基因的分離和表達(dá)， 也為萬古霉素等糖肽類抗生素的組合生物 合成提供了有益的信息。 2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀 目前對于研發(fā)新的萬古霉素等糖肽類雜合抗生素 主要集中在對糖基化方式的研究和改造，但至今 為止絕大多數(shù)的研究是在大腸埃希氏菌中或在 S. toyocanesis等鏈霉菌中進(jìn)行異源表達(dá) ; 美國 Christopher領(lǐng)導(dǎo)的小組以及德國 Wohlleben 所領(lǐng)導(dǎo)的小組對萬古霉素生物合成途徑中的很多 酶進(jìn)行了體外表達(dá)，并對酶學(xué)性質(zhì)，立體結(jié)構(gòu)等 進(jìn)行了詳細(xì)的研究，為萬古霉素等糖肽類抗生素 的組合生物合成做了充分的準(zhǔn)備 ; 但目前在萬古霉素等糖肽類抗生素產(chǎn)生菌體內(nèi)進(jìn) 行組合生物合成還未見報(bào)道，關(guān)鍵可能是缺乏完 善的擬無枝酸菌遺傳操作系統(tǒng)。 3、類胡蘿卜素的組合生物合成 作為抗氧化劑，類胡蘿卜素具有很大的藥物應(yīng)用 前景，如已經(jīng)顯示這類化合物對心血管疾病和腫 瘤具有相當(dāng)?shù)寞熜?; 迄今為止，已有 600多種類胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)被確證， 但由于化學(xué)合成的困難，以及從微生物代謝產(chǎn)物 和植物組織中分離困難而難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化 ; 但是，近年來發(fā)展的組合生物合成技術(shù)，有可能 通過外源基因在 E.coli中的雜合表達(dá)，來制備這 些稀少的衍生物甚至產(chǎn)生新的類胡蘿卜素化合物。 第三節(jié) 組合生物催化與 微生物新藥的發(fā)現(xiàn) 組合生物轉(zhuǎn)化（催化） （ combinatorial biocatalysis） 是指利用一種以上的具有特殊轉(zhuǎn)化功能的 微生物或酶，對同一個(gè)母體化合物進(jìn)行組 合轉(zhuǎn)化，以得到化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性，它是 從已知化合物中尋找新型衍生物以及從簡 單化合物制備復(fù)雜化合物的有效手段 ; 從某種角度講，它比化學(xué)合成的方法更為 簡單和有效 ; 這是一個(gè)新的研究領(lǐng)域。 模擬生物體的生命過程，利用組合生物 催化技術(shù)構(gòu)建先導(dǎo)化合物庫 可用 于組 合合 成的 生物 催化 反應(yīng) 反應(yīng)類型 特異性反應(yīng) 引進(jìn)功能基團(tuán) CC鍵的形成 羥化反應(yīng) 鹵化反應(yīng) 鹵代醇的形成 環(huán)加成 加入胺 對已有功能基團(tuán)的改造 氧化醇至醛和酮 還原醛和酮至醇 氧化硫化物至亞砜 氧化氨基至硝基 氧化硫至硫醛 水解腈至羧酸 用羥基置換氨基 內(nèi)酯化 異構(gòu)化 差向異構(gòu)化 脫烷基化 甲基轉(zhuǎn)移 加入基團(tuán)至功能基團(tuán) 酯化作用 酯的形成 氨基甲酸酯的形成 環(huán)化 胺化 磷酸化 利用生物催化發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物的優(yōu)越性 可能進(jìn)行反應(yīng)的范圍廣； 能夠定向進(jìn)行區(qū)域選擇性和立體選擇性； 不需基團(tuán)保護(hù)和脫保護(hù)，一步實(shí)現(xiàn)所需的反應(yīng)； 在溫和和均一的條件下可容易地實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和一 步反應(yīng)的重現(xiàn)性； 溫和的反應(yīng)條件復(fù)雜易變的分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性； 高的催化活性可以降低催化劑的用量； 酶的固定化可以使催化劑反復(fù)和循環(huán)使用； 生物催化劑在環(huán)境中完全被降解。 生物催化產(chǎn)生的分子庫 前導(dǎo)化合物 庫容量 內(nèi)容 腺苷 92 2代 3