動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)和專用生物反應器

上節(jié)課我們學了什么？ 問題 生物反應器 生物反應器的一些概念 生物反應器的基本類型 第二章 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)和專用 生物反應器 學時： 2節(jié)課 主要內(nèi)容： 常用培養(yǎng)方法 動物細胞培養(yǎng)的操作方式 細胞培養(yǎng)過程的放大 動物細胞培養(yǎng)生物放大器 動物細胞培養(yǎng) 開始于 上世紀初 1962年 , 其 規(guī)模逐漸擴大 , 發(fā)展至今已成為生物、醫(yī) 學研究和應用中廣泛采用的技術方法 (生產(chǎn) 酶、生長因子、疫苗和單抗 等 )。 相關知識介紹 利用動物細胞培養(yǎng)技術生產(chǎn)的 生物制品 已占 世界生物高技術產(chǎn)品市場份額的 50% 。 發(fā)展： 在過去幾十年來，從使用轉(zhuǎn)瓶 (roller bottle) 、 CellCube等貼壁細胞培養(yǎng)，發(fā)展為生 物反應器（ Bioreactor）進行大規(guī)模細胞培養(yǎng)。 一是在工藝生產(chǎn)時不能大規(guī)模制備產(chǎn)品； 二是非批量生產(chǎn)容易導致產(chǎn)品質(zhì)量的不均一性 三是難以對同批生產(chǎn)進行生產(chǎn)和質(zhì)量控制。 第一代細胞培養(yǎng)技術核心問題：難以產(chǎn)業(yè)化！ 隨著生物技術的發(fā)展， 迫切需要大規(guī)模的細胞 培養(yǎng) ，以便獲得大量有用的細胞表達產(chǎn)物。 采用 玻璃瓶靜置或旋轉(zhuǎn)瓶的培養(yǎng) 方法， 已不能 滿足 所需細胞數(shù)量及其分泌產(chǎn)物。 自 70年代以來，較常見的細胞培養(yǎng)生物反應器 有 空氣提升反應器，中空纖維管反應器，無泡 攪拌反應器及籃式生物反應器 等。 80年代以來，人們逐漸開始 以生物反應器培養(yǎng) 代替鼠腹水 的方法獲得單克隆抗體。 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術 ： （ large-scale culture technology） 定義： 指在人工條件下（設定 pH、溫度、 溶氧等），在細胞生物反應器中高密度大 量培養(yǎng)動物細胞用于生產(chǎn)生物制品的技術 。 通過大規(guī)模體外培養(yǎng)技術培養(yǎng)哺乳類 動物細胞是生產(chǎn)生物制品的有效方法 雞胚、豬腎、猴腎、地鼠腎等多種原代細 胞 人二倍體細胞 cho（中華倉鼠卵巢）細胞 BHK-21(倉鼠腎細胞 ) Vero細胞 (非洲綠猴腎傳代細胞，是貼壁依 賴的成纖維細胞 )等。 可大規(guī)模培養(yǎng)的動物細胞 個性化培養(yǎng)基是胞細培養(yǎng)基的發(fā)展方向 圖 8.1 細胞培養(yǎng)瓶 圖 8.3 細胞工廠 Spinner培養(yǎng)系統(tǒng) 口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、 脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、皰瘡病毒 疫苗、巨細胞病毒疫苗、 及 干擾素、血纖維 蛋白溶酶原激活劑、凝血因子 和 、促紅細胞 素、松弛素、生長激素、蛋白 C、免疫球蛋白、 尿激酶、激肽釋放酶及 200種單克隆抗體等。 目前已實現(xiàn)商業(yè)化的產(chǎn)品： 6.原代培養(yǎng)細胞一般繁殖 50代即退化死亡 第一節(jié) 常用的培養(yǎng)方法 動物細胞生長特性： 1.細胞生長緩慢，易污染，培養(yǎng)需用抗生素 2.細胞大，無細胞壁，機械強度低，環(huán)境適應性差 3.需氧少，不耐受強力通風與攪拌 4.群體生長效應，貼壁生長（錨地依賴性） 5.培養(yǎng)過程產(chǎn)品分布細胞內(nèi)外，成本高 非貼壁依賴型細胞： 無需附著于固相表面 即可生長，包括血液、淋巴組織細胞、許 多腫瘤細胞及某些轉(zhuǎn)化細胞。 依據(jù)在體外培養(yǎng)時對生長基質(zhì)依賴性差異， 動物細胞可分為兩類： 貼壁依賴型細胞： 需要附著于帶適量電荷 的固體或半固體表面才能生長，大多數(shù)動物 細胞，包括非淋巴組織細胞和許多異倍體細 胞均屬于這一類。 “貼壁單核”細胞培養(yǎng) 貼壁的單核細胞 貼壁細胞 細胞培養(yǎng)的人參愈傷組織 知識回顧 一般步驟： 無菌取出目的細胞所在組織，用培養(yǎng)液漂洗干凈 以鋒利無菌刀具割舍多余部分，切成小組織塊 將小組織塊置解離液（含蛋白酶類）離散細胞。 低速離心洗滌細胞后，將目的細胞吸移培養(yǎng)瓶培養(yǎng) 動物細胞培養(yǎng)步驟 植物細胞（組織）培養(yǎng)流程 懸浮細胞培養(yǎng) 提取純化 產(chǎn)物 脫分化： 離體植物器官、組織或細胞，在培養(yǎng)了一段時間 后，會通過細胞分裂，形成愈傷組織（細胞排列疏松而無 規(guī)則，是一種高度液泡化的呈無定形狀態(tài)的薄壁細胞）。 收集細胞 藥物制劑 通過植物組織培養(yǎng)的藥物：奎寧、長春堿、洋地黃、 紫草素、人參皂甙等 大 規(guī) 模 動 物 細 胞 培 養(yǎng) 工 藝 流 程 圖 細胞培養(yǎng)反應器 提取 細胞 誘生劑 細胞 產(chǎn)品（腫瘤抗原） 純化 產(chǎn)品（干擾素） 純化 提取 產(chǎn)品（單克隆抗體） 濃縮純化 7 9 8 6 5 4 3 2 1 10 大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞的方法： 貼壁培養(yǎng) 懸浮培養(yǎng) 固定化培養(yǎng) 一、貼壁培養(yǎng)（ attachment culture） 細胞貼附在一定的固相表面進行的培養(yǎng)。 1、 生長特性 ：貼壁依賴型細胞在 培養(yǎng)時要貼附于培養(yǎng)（瓶）器皿壁上， 細胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開始 有絲分裂，并很快進入對數(shù)生長期。 一般數(shù)天后就鋪滿培養(yǎng)表面，并形成 致密的細胞單層。 貼壁培養(yǎng)細 胞轉(zhuǎn)瓶機 2、貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點： 容易更換培養(yǎng)液： 細胞緊密黏附于固相表面， 可直接傾去舊培養(yǎng)液，清洗后直接加入新培養(yǎng)液。 容易采用 灌注培養(yǎng) ，從而達到提高細胞密度的 目的；因細胞固定表面，不需過濾系統(tǒng)。 當細胞貼壁于生長基質(zhì)時， 很多細胞將更有效 的表達一種產(chǎn)品 。 同一設備可采用不同的培養(yǎng)液 /細胞的比例 。 適用于所有類型細胞 。 灌注培養(yǎng) 3、貼壁培養(yǎng)的 缺點： 與懸浮培養(yǎng)法相比， 擴大培養(yǎng)比較困難，投資大； 占地面積大； 不能有效監(jiān)測細胞的生長； 4、 細胞貼壁的表面： 要求具有 凈陽電荷和高度表面活性 。 對微載體而言還要求具一定電荷密 度；若為有機物表面，必須具有親 水性，并帶陽電荷。 5、 貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)： 主要有 轉(zhuǎn)瓶 、 中空纖維 （后面專題介紹）、 玻璃珠 、 微載體系統(tǒng) （后面介紹）等。 貼壁培養(yǎng)細 胞轉(zhuǎn)瓶機 細胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)器 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)： 為 最初采用 系統(tǒng)，一般用 于小量培養(yǎng)到大規(guī)模培養(yǎng)的 過 渡階段 ，或作為生物反應器接 種細胞準備的一條途徑。細胞 接種在旋轉(zhuǎn)的圓筒形培養(yǎng)器 轉(zhuǎn)瓶中，培養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)瓶不 斷旋轉(zhuǎn)，使細胞交替接觸培養(yǎng) 液和空氣，從而提供較好的傳 質(zhì)和傳熱條件。 轉(zhuǎn)瓶機 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的優(yōu)、缺點 勞動強度大，占地空間大，單 位體積提供細胞生長的表面積 小，細胞生長密度低，培養(yǎng)時 監(jiān)測和控制環(huán)境條件受到限制。 優(yōu)點： 結(jié)構簡單，投資少，技術 成熟，重復性好，放大只 需簡單的增加轉(zhuǎn)瓶數(shù)量等。 缺點： 二、 懸浮培養(yǎng) （ suspension culture） 指細胞在反應器中自由懸浮生長的過 程。主要用于 非貼壁依賴型細胞培養(yǎng) ， 如雜交瘤細胞等，是在微生物發(fā)酵的基 礎上發(fā)展起來的。 小規(guī)模懸浮培養(yǎng) 懸浮培養(yǎng)瓶 用 已知人源或動物來源的蛋白或激素代 替動物血清 的一種細胞培養(yǎng)方式，它能 減少后期純化工作，提高產(chǎn)品質(zhì)量，正 逐漸成為動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的新方向。 無血清懸浮培養(yǎng) 三、固定化培養(yǎng) （ immobilization culture） ： 將 動物細胞與水不溶性載體結(jié)合起來 ， 再進行培養(yǎng)。上述兩大類細胞都適用，具 有 細胞生長密度高，抗剪切力和抗污染能 力強 等優(yōu)點，細胞易與產(chǎn)物分開，有利于 產(chǎn)物分離純化。制備方法很多，包括 吸附 法、共價貼附法、離子 /共價交聯(lián)法、包 埋法、微囊法 等。 1、吸附法 : 用 固體吸附劑將細胞吸附在其表面而使 細胞固定化 的方法稱為吸附法（ adhesion）。 操作簡便、條件溫和、是動物細胞固定化中 最早研究使用的方法。 缺點： 載體的負荷能力低，細胞易脫落 。 微載體培養(yǎng)和中空纖維培養(yǎng)是該方法的代表， 稍后專門介紹。 2、共價貼附法 : 利用 共價鍵將動物細胞與固相載體結(jié)合 的固定化方法 稱為共價貼附法 （ attachment by covalent bonding）。 此法可減少細胞的泄漏，但須 引入化學試 劑，對細胞活性有影響 ，且因貼附而導致 擴散限制小，細胞得不到保護。 3、離子 /共價交聯(lián)法 : 雙功能試劑處理細胞懸浮液，會在細 胞間形成橋而絮結(jié)產(chǎn)生交聯(lián)作用 ，此固定 化細胞方法稱為離子 /共價交聯(lián)法 （ cross-linking by covalent bonding）。交聯(lián)試劑會使一些細胞死亡， 也會產(chǎn)生擴散限制。 4、包埋法 : 將細胞包埋在多孔載體內(nèi)部制成固定化細胞 的 方法稱為包埋法（ entrapment）。 優(yōu)點 ：步驟簡便、條件溫和、負荷量大、細胞 泄漏少，抗機械剪切。 缺點 ：擴散限制，并非所有細胞都處于最佳基 質(zhì)濃度，且大分子基質(zhì)不能滲透到高聚物網(wǎng)絡內(nèi) 部。一般適用于非貼壁依賴型細胞的固定化，常 用載體為多孔凝膠，如 瓊脂糖凝膠、海藻酸鈣凝 膠和血纖維蛋白 。 石蠟切片中底部薄層軟蠟包埋法 甲基丙烯酸甲酯包埋標本 微囊型包埋法 5、微囊法（ microencapsulation） : 用一層親水的半透膜將細胞包圍在珠狀 的微囊里，細胞不能逸出，但小分子物質(zhì)及 營養(yǎng)物質(zhì)可自由出入半透膜 ；囊內(nèi)是種微小 培養(yǎng)環(huán)境，與液體培養(yǎng)相似，能保護細胞少 受損傷，故細胞生長好、密度高。微囊直徑 控制在 200-400m 為宜。 第二節(jié) 大規(guī)模培養(yǎng)技術的操作方式 深層培養(yǎng)可分為 : 分批式 流加式 半連續(xù)式 連續(xù)式 連續(xù)式 灌注式 一、分批式培養(yǎng)（ batch culture） 較早期 的方式，采用 機械攪拌式生物 反應器 ，將細胞擴大培養(yǎng)后， 一次性轉(zhuǎn)入 生物反應器內(nèi)進行培養(yǎng) 一次性收獲 細 胞、產(chǎn)物、培養(yǎng)基。 特點 : 操作簡單，培養(yǎng)周期短，染菌和細胞突變的風險小 直觀反映細胞生長代謝的過程。 可直接放大。 細胞的生長分：延滯期、對數(shù)生長期、減 速期、平穩(wěn)期和衰退期 五個階段 。 分批培養(yǎng)的 周期多在 3-5天 ， 細胞生長動力 學表現(xiàn)為細胞先經(jīng)歷對數(shù)生長期（ 48-72h） 細胞密度達到最高值后，由于營養(yǎng)物質(zhì)耗 竭或代謝毒副產(chǎn)物的累積細胞生長進入衰 退期進而死亡，表現(xiàn)出典型的生長周期。 收獲產(chǎn)物通常是在細胞快要死亡前或已經(jīng) 死亡后進行 。 二、流加式培養(yǎng) （ feeding culture） 細胞初始接種的培養(yǎng)基體積一般為 終體積的 1/2 1/3，在培養(yǎng)過程中根據(jù) 細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗和需求，流 加濃縮的營養(yǎng)物或培養(yǎng)基， 通常在細胞 進入衰亡期或衰亡期后進行終止回收整 個反應體系，分離細胞和細胞碎片，濃 縮、純化目標蛋白 。 1、流加培養(yǎng)物的方式 流加的時間通常在 指數(shù)生長后期 ，細胞進入衰退 期之前，添加高濃度的營養(yǎng)物質(zhì)。 可以添加一次， 也可添加多次，凡是促細胞生長的物質(zhì)均可以進 行添加 。 流加的總體原則是維持細胞生長相對穩(wěn) 定的培養(yǎng)環(huán)境 ， 營養(yǎng)成分既不過剩 而產(chǎn)生大量的 代謝副產(chǎn)物造成營養(yǎng)利用效率下降而成為無效的 利用； 也不缺乏 導致細胞生長抑制或死亡。 2、流加工藝中的營養(yǎng)成分（三大類）： 葡萄糖 ： 供能物質(zhì)、碳源物質(zhì) ， 濃度較高則產(chǎn) 生大量的代謝產(chǎn)物乳酸，因而需要控制濃度，以 足夠維持細胞生長而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物的 濃度為佳。 谷氨酰胺 ： 供能物質(zhì)、氮源物質(zhì) ， 需要控制濃度。 大規(guī)模培養(yǎng)中細胞凋亡， 谷氨酰胺的耗竭是最常 見的凋亡原因 。 氨基酸、維生素及其他： 必需氨基酸、非必需氨 基酸、一些特殊的氨基酸如羥脯氨酸、羧基谷氨 酸和磷酸絲氨酸；此外還包括其他營養(yǎng)成分如膽 堿、生長刺激因子。 三、 半連續(xù)式培養(yǎng) （ semi-continuous culture） 1、又稱重復分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。 采用機 械攪拌式生物反應器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)形式。 在細胞增長和產(chǎn)物形成過程中， 每間隔一 段時間， 從中取出部分培養(yǎng)物 ， 再用新的 培養(yǎng)液補足到原有體積 ，使反應器內(nèi)的總 體積不變 。 2、半連續(xù)式特點： 培養(yǎng)物的體積逐步增加； 可進行多次收獲； 細胞可持續(xù)指數(shù)生長，并可保持產(chǎn)物和細胞在 一較高的濃度水平，培養(yǎng)過程可延續(xù)到很長時間。 優(yōu)點： 操作簡便，生產(chǎn)效率高，可長時期進行生 產(chǎn)，反復收獲產(chǎn)品，可使細胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一 直保持在較高的水平。在動物細胞培養(yǎng)和藥品生 產(chǎn)中被廣泛應用。 四、連續(xù)式培養(yǎng) （ continuous culture） 1、 常見的懸浮培養(yǎng)模式： 采用機械攪拌式 生物反應器系統(tǒng) 。 在細胞達最大密度之前， 以一定速度向生物反應器連續(xù)添加新鮮培 養(yǎng)基 （ 防止衰退期出現(xiàn) ）；同時， 含有細 胞的培養(yǎng)物以相同的速度連續(xù)從反應器流 出，以保持培養(yǎng)體積的恒定 。理論上講， 該過程可無限延續(xù)下去。 2、連續(xù)式培養(yǎng)的 特點 ： 細胞維持持續(xù)指數(shù)增長； 產(chǎn)物體積不斷增長； 可控制衰退期與下降期。 連續(xù)式培養(yǎng) 3、 優(yōu)點： 培養(yǎng)狀態(tài)恒定 ，細胞在穩(wěn)定狀態(tài)下生長。 穩(wěn)定狀態(tài)可有效的延長 分批培養(yǎng)中的 對數(shù)生長期 。 在穩(wěn)定狀態(tài)下 細胞所處的環(huán)境條件可維持不變 （ 如 營養(yǎng)物質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度、 pH值可保持恒定，細胞濃度以 及細胞比生長速率） 。 細胞很少受到培養(yǎng)環(huán)境變化帶來的生理影響 ，特 別是生物反應器的主要營養(yǎng)物質(zhì)葡萄糖和谷氨酰 胺，維持在一個較低的水平，從而使他們的利用 效率提高，有害產(chǎn)物積累有所減少。 4、 不足 ： 由于是開放式操作，加上培養(yǎng)周期較長， 容易 造成污染 ； 在長周期的連續(xù)培養(yǎng)中，細胞的生長特性以及 分泌產(chǎn)物 容易變異 ； 對設備、儀器的 控制技術 要求較 高 。 五、灌流式培養(yǎng) （ perfusion culture） 1、把細胞和培養(yǎng)基一起加入反應器后，在細胞 增長和產(chǎn)物形成過程中， 不斷地將 部分條件培 養(yǎng)基取出 ， 同時又連續(xù)不斷地灌注新的培養(yǎng)基 。 它與半連續(xù)式操作的不同之處在于 取出部分條件培 養(yǎng)基時，絕大部分細胞均保留在反應器內(nèi) ，而半連 續(xù)培養(yǎng)在取培養(yǎng)物時同時也取出了部分細胞。 一種是用攪拌式生物反應器懸浮培養(yǎng)細胞， 這種反應器必須具有細胞截流裝置，細胞 截留系統(tǒng)開始多采用 微孔膜過濾或旋轉(zhuǎn)膜 系統(tǒng) ，最近開發(fā)的有各種形式的沉降系統(tǒng) 或透析系統(tǒng)。 如：中空纖維生物反應器 灌流式培養(yǎng)用生物反應器主要有兩種形式： 中空纖維半透膜 可透過小分子量的產(chǎn)物和底物 ， 截流細胞和分子量較大的產(chǎn)物 ，在連續(xù)灌流過程 中將絕大部分細胞截留在反應器內(nèi)；近年中空纖 維生物反應器被廣泛用于產(chǎn)物分泌性動物細胞的 生產(chǎn)，主要用于培養(yǎng)雜交瘤細胞生產(chǎn)單克隆抗體。 中空纖維反應器示意圖 細胞 培養(yǎng)基出口 空氣與 CO2出口 空氣與 CO2入口 培養(yǎng)基入口 固定床 是在反應器中裝配固定的籃筐， 中間裝填聚脂纖維載體，細胞可附著 在載體上生長，也可固定在載體纖維 之間，靠上攪拌中產(chǎn)生的負壓，迫使 培養(yǎng)基不斷流經(jīng)填料，有利于營養(yǎng)成 分和氧的傳遞，這種形式的灌流速度 較大，細胞在載體中高密度生長。 流 化床生物反應器 是通過流體的上升運 動使固體顆粒維持在懸浮狀態(tài)進行反 應，適合于固定化細胞的培養(yǎng)。 另一種形式是固定床或流化床生物反應器 軸向絕熱式 徑向絕熱式 列管式 固定床反應器 ： 氣體流經(jīng)固定不動的催 化劑床層進行催化反應 的裝置 流化床反應器： 固體顆粒被流體吹起呈懸浮狀態(tài)，可作上下左 右劇烈運動和翻動，好象是液體沸騰一樣，故 流化床反應器又稱沸騰床反應器。 1 旋風分離器 2 筒體擴大段 3 催化劑入口 4 筒體 5 冷卻介質(zhì)出口 6 換熱器 7 冷卻介質(zhì)進口 8 氣體分布板 9 催化劑出口 10 反應氣入口 2、灌流式培養(yǎng)的優(yōu)點： 細胞截流系統(tǒng)可使 細胞或酶 保留在反應器 內(nèi)， 維持較高的細胞密度 ， 一般可達 107- 109/ml，從而較大的 提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量 ； 連續(xù)灌流系統(tǒng)，使細胞穩(wěn)定的處在較好的 營養(yǎng)環(huán)境中， 有害代謝廢物濃度積累較低 ； 反應速率容易控制 ， 培養(yǎng)周期較長，可提 高生產(chǎn)率，目標產(chǎn)品回收率高； 產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時間短，可及時回收到低 溫下保存， 有利于保持產(chǎn)品的活性。 六、細胞工廠培養(yǎng) 聚苯乙烯材料，無菌， 長度 335mm，寬度 205mm 這套系統(tǒng)使用很方便，可產(chǎn)生類似塑料培 養(yǎng)瓶的效果。由組織培養(yǎng)級聚苯乙烯制成， 使用后可隨意處理。其最大缺點是：經(jīng)胰 酶消化后，很難將細胞完全洗出。 第四節(jié) 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)用生物反應器簡介 動物細胞培養(yǎng)技術能否大 規(guī)模工業(yè)化、商業(yè)化，關 鍵在于能否設計出合適的 生物反應器。首先 必須滿 足在低剪切力及良好的混 合狀態(tài)下，能夠提供充足 的氧以供細胞生長及細胞 進行產(chǎn)物的合成 。 細 胞 培 養(yǎng) 罐 一、生物反應器分類 1.懸浮培養(yǎng)用反應器 ：如攪拌反應器、中 空纖維反應器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應器、 氣升式反應器； 2.貼壁培養(yǎng)用反應器 ：如攪拌反應器（微 載體培養(yǎng)）、玻璃珠床反應器、中空纖維反 應器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應器； 3.包埋培養(yǎng)用反應器 ：如流化床反應器、 固化床反應器。 按其培養(yǎng)細胞的方式不同，可分 三類 ： 二、 攪拌罐生長反應器 最經(jīng)典、最早被采用。針 對動物細胞培養(yǎng)的特點， 采用了不同的攪拌器及通 氣方式。通過攪拌器的作 用 使細胞和養(yǎng)分在培養(yǎng)液 中均勻分布，使養(yǎng)分充分 被細胞利用，并增大氣液 接觸面，有利于氧的傳遞 。 三、氣升式生物反應器 1979年首次成功應用氣升式生物反應器進行了動 物細胞的懸浮培養(yǎng)。氣升式生物反應器的優(yōu)點： 罐內(nèi)液體流動溫和均勻，產(chǎn)生 剪切力小 ，對細 胞損傷較??； 可直接噴射空氣供氧，因而 氧傳遞率較高 ； 液體循環(huán)量大， 細胞和養(yǎng)分都能均勻分布 于培 養(yǎng)液中； 結(jié)構簡單，利于密封并 降低了造價 。 四、鼓泡式生物反應器 與氣升式反應器相類似， 是 利用氣體鼓泡來進行 供氧及混合 ，其設計原 理與氣升式生物反應器 也相同。 五、中空纖維生物反應器 用途較廣，既可用于懸浮細胞的培養(yǎng)，又可用于 貼壁細胞的培養(yǎng)。 優(yōu)點： 占地空間少； 細胞產(chǎn)量高，細胞密 度可達 109數(shù)量級； 生產(chǎn)成本低，且細胞 培養(yǎng)維持時間長，適用 于長期分泌的細胞。 板框式中空纖維反應器 液營養(yǎng) 中空纖維板 注意幾個問題： (一 )細胞培養(yǎng)環(huán)境 (1)氨離子 ：細胞培養(yǎng)環(huán)境中抑制因素的積聚是 提高細胞密度的主要限制因素。 (2)乳酸 ：高乳酸濃度必將抑制細胞生長 (3)二氧化碳 ：二氧化碳積聚，對細胞產(chǎn)生毒性 作用或者改變細胞代謝水平。 (4)甲基乙二醛 (Mc)： 對細胞有潛在的損傷作用 (5)滲透壓 ：恒定、適宜 (6)載體 ：可考慮 采用多孔徑載體 替代容易使細 胞受機械攪拌與噴氣損傷的常規(guī)載體。 (二 )細胞死亡與凋亡 大規(guī)模細胞培養(yǎng)的后期，維持細胞高的活力是 個富有挑戰(zhàn)性的課題。最初的研究似乎表明細 胞死亡大多由于壞死，而人們逐漸認識到至少 是一些細胞系在生物反應器中死亡主要原因是 細胞凋亡。 用基因工程方法將 bcl 2基因這種細胞凋 亡抑制基因?qū)爰毎?bcl 2基因的過量表達 能抑制細胞凋亡，提高細胞密度和目的蛋白產(chǎn) 量。 大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)條件下，可通過“細胞靜止 ”過程來降低營養(yǎng)成分消耗和代謝毒物產(chǎn)生。 (三 ) 培養(yǎng)基與細胞系 動物細胞培養(yǎng)基是細胞賴以生長、增殖的重要 因素。天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基后， 無血清培養(yǎng) 基開發(fā)成為當今細胞領域的一大課題 。 無血清培養(yǎng)基的優(yōu)勢在于避免血清的批次、質(zhì)量 、成分等對細胞造成的污染、毒性和不利于產(chǎn)品 純化等不良影響。 在生產(chǎn)疫苗、單抗和各種生物活性蛋白等生物制 品的應用領域中， 優(yōu)化無血清培養(yǎng)基的成分 可使 不同的細胞在最有利于細胞生長和表達目的產(chǎn)物 的環(huán)境中維持高密度培養(yǎng)。 (四 )過程監(jiān)控 測量在線氧吸收速率確定從細胞生長期生產(chǎn)病毒 到病毒感染期和細胞死亡后終止感染的轉(zhuǎn)換時間 ； 用在線葡萄糖分析儀的測定調(diào)整灌流速度； 測定氧消耗估計營養(yǎng)供應率的代謝負荷； 測定氧吸收速率估測 ATP的形成； 測量在線氧化還原能力作為活細胞濃度的指標等 均得以應用。 測定在線氧吸收速率并用質(zhì)譜儀分析廢氣中 二氧化碳呼出率計算呼吸商。一般來說，呼吸商 應接近 1.0，這就要求細胞培養(yǎng)中盡量降低氧消 耗和二氧化碳排出。 用親和層析與在線取樣系統(tǒng)偶聯(lián)進行在線蛋 白質(zhì)含量測定。另外，用在線蛋白分解與反相色 譜監(jiān)測重組蛋白的糖基化以了解產(chǎn)品的一致性。 計數(shù)法 (細胞運輸 ) 當前培養(yǎng)細胞既在國內(nèi)進行寄贈、交換和購買，也在國 際交流，為此需要裝運細胞的方法。 一種是用液氮或干冰貯存運輸，需要特殊容器，較麻煩 ，且不適于長時間運行。另一方法為充液法，方便當行，是 當前多采用的方法。 具體方法： 選生長狀態(tài)良好的細胞，待培養(yǎng)近單層后，去掉培養(yǎng)液 充滿新培養(yǎng)液。液量要達培養(yǎng)瓶頸部，擰緊螺帽或塞一吸塞 ，保留微量空氣?？諝饬袅窟^多，運輸時大氣泡來回流動 對細胞有干擾作用。 一般經(jīng) 4 5天運輸對細胞活力無大影響。時間過長 ,細 胞活力下降。到達后，倒出大部分培養(yǎng)液，保留維持細胞生 長所需的液體量。置 37攝氏度培養(yǎng)，次日傳代。 十一 動物細胞體外培養(yǎng)舉例 腫瘤細胞的體外培養(yǎng)與建系過程 體外培養(yǎng)腫瘤細胞的歷史一定程度上代表 了動物細胞體外培養(yǎng)的發(fā)展歷史。 1952年，蓋爾 (Gey)首先成功地建立世界 上第一個細胞系 子宮頸癌細胞的細胞系， 并且使惡性腫瘤細胞的培養(yǎng)從間葉組織源性的 細胞轉(zhuǎn)向上皮源性細胞。 腫瘤細胞培養(yǎng)的發(fā)展成就主要體現(xiàn)在以 下幾個方面： (1)在培養(yǎng)的腫瘤 細胞類型 上，從間充質(zhì)源性的細胞 轉(zhuǎn)向上皮源性細胞，再由神經(jīng)外胚層源性到造血 細胞源性的發(fā)展歷程。 (2)在 方法 上，從原代培養(yǎng)到傳代培養(yǎng)、再到細胞系 的建立的發(fā)展過程。 (3)培養(yǎng)液成分 上，由純血清培養(yǎng)基到含血清、再到 無血清培養(yǎng)基三個階段。 (4) 生物學特性 上，經(jīng)歷了從細胞水平到亞細胞水 平，再到酶和分子水平的發(fā)展。 原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代后，能在體外繼續(xù)生長繁殖的細胞即為細胞系。然而，這并 不意味著細胞能永久生長?？赡苓^了若干代 后，由于微生物污染、細胞分化成熟、細胞 不適應外界環(huán)境等因素影響而喪失分裂能力 。根據(jù)細胞分裂能力，可分為有限細胞系與 無限細胞系兩類。一般認為，如果細胞能在 體外培養(yǎng)超過 50代，培養(yǎng)時間超過一年，而 且細胞的倍增時間保持穩(wěn)定時，就可以認為 建系成功 。 人上皮型鼻咽癌 CNE-2細胞系為例 建系過程： (1)取材 (2)原代培養(yǎng) (3)建 系過程 組織塊在接種 1周后，上皮細胞從組織塊周圍向外迅速遷 移和生長。 2周后，可見成纖維細胞生長。 8周后，上皮細 胞生長開始明顯加快 . 細胞在傳代三次后 貼壁生長的細胞呈現(xiàn)上皮 狀。 2周后細胞形成群落。第 4代后細胞開始呈單層生長 , 命名為 CNE-2。 經(jīng)生物學特性分析后確定細胞系建立成功 . 六、生物反應器的設計和放大設計的總體考慮 結(jié)構嚴密，能耐受蒸汽滅菌，采用對生物催化劑無害 和耐蝕材料制作，內(nèi)壁光滑無死角，內(nèi)部附件盡量減少， 以 維持純種培養(yǎng)需要 ； 有良好的氣 -液接觸和液 -固混和性能和熱量交換性能， 使質(zhì)量與熱量傳遞有效地進行 ； 保證產(chǎn)物質(zhì)量和產(chǎn)量前提下， 盡量節(jié)省能源消耗 ； 減少泡沫產(chǎn)生，或附有消沫裝置以 提高裝料系數(shù) ，并 有必要可靠的 參數(shù)檢測和控制儀表 并能與計算機聯(lián)機。 一種新的生物技術產(chǎn)品從實驗室到工業(yè)生 產(chǎn)的開發(fā)過程中，會遇到生物反應器的逐 級放大問題，每一級約放大 10 100倍。生 物反應器的放大，表面看來僅是一個體積 或尺度放大問題，實際上并不是那么簡單。 半理論半經(jīng)驗 氧傳遞問題 傳熱