分解纖維素的微生物的分離公開課

JLSSYJLSSYBYHBYH一、基礎(chǔ)知識一、基礎(chǔ)知識 纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)，纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)，植物每年產(chǎn)生的纖維素超過植物每年產(chǎn)生的纖維素超過7070億噸，其中億噸，其中40%-40%-60%60%能被土壤中能產(chǎn)生纖維素酶的微生物所利用，能被土壤中能產(chǎn)生纖維素酶的微生物所利用，不會大量積累。不會大量積累。 在草食性動物等的消化道內(nèi)，也在草食性動物等的消化道內(nèi)，也共生有共生有分解纖維素的微生物分解纖維素的微生物，其原理也是產(chǎn)生纖維，其原理也是產(chǎn)生纖維素酶而分解纖維素，而人沒有分解纖維素的素酶而分解纖維素，而人沒有分解纖維素的能力。能力。纖維二糖纖維二糖C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纖維素纖維素CX酶：酶：內(nèi)切酶，使纖維素斷裂成片斷。內(nèi)切酶，使纖維素斷裂成片斷。C1酶：酶：外切酶，從糖鏈末端開始切掉兩個葡萄糖外切酶，從糖鏈末端開始切掉兩個葡萄糖 分子，產(chǎn)生纖維二糖分子，產(chǎn)生纖維二糖葡萄糖苷酶：葡萄糖苷酶：將纖維二糖分解成葡萄糖。將纖維二糖分解成葡萄糖。取二支取二支20mL20mL的試管的試管實驗：纖維素酶分解纖維素的實驗實驗：纖維素酶分解纖維素的實驗 濾紙崩潰法濾紙崩潰法各加入一張濾紙條各加入一張濾紙條各加入各加入pH4.8pH4.8，物質(zhì)量為，物質(zhì)量為0.1mol/L0.1mol/L的醋酸醋酸鈉緩沖液的醋酸醋酸鈉緩沖液1111mlml和和1010mlml甲甲 乙乙在乙試管中加入在乙試管中加入1 1mLmL纖維素酶纖維素酶兩支試管固定在錐形瓶中，放在兩支試管固定在錐形瓶中，放在140r/min140r/min的搖床上振蕩的搖床上振蕩1h1h結(jié)果：乙試管的濾紙條消失結(jié)果：乙試管的濾紙條消失 討論討論：乙試管的濾紙條為什么會消失？甲試管的作用是：乙試管的濾紙條為什么會消失？甲試管的作用是什么？什么？提示：提示： 本實驗的本實驗的自變量是纖維素酶的有無自變量是纖維素酶的有無，自變，自變量的操縱方法是：在一支試管中添加適量（量的操縱方法是：在一支試管中添加適量（1mL1mL）的纖維素酶溶液，在另一支試管不添加纖維素的纖維素酶溶液，在另一支試管不添加纖維素酶，但需加入等量的緩沖液，不能加入蒸餾水，酶，但需加入等量的緩沖液，不能加入蒸餾水，否則會影響溶液的否則會影響溶液的pHpH。實驗分析：實驗分析：P P2727的小實驗是如何構(gòu)成對照的小實驗是如何構(gòu)成對照的？的？ 剛果紅剛果紅能與能與纖維素形成紅色復(fù)合物纖維素形成紅色復(fù)合物，而不與，而不與水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。 （二）纖維素分解菌的篩選（二）纖維素分解菌的篩選 當我們在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅當我們在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時，剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成時，剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復(fù)紅色復(fù)合物合物。當纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅。當纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅- -纖纖維素的復(fù)合物就無法形成，培養(yǎng)基中就會出現(xiàn)維素的復(fù)合物就無法形成，培養(yǎng)基中就會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈以纖維素分解菌為中心的透明圈，這樣我們就，這樣我們就可以通過可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。二、實二、實 驗驗 設(shè)設(shè) 計計 請你根據(jù)實驗流程圖和提供的三個資料以及請你根據(jù)實驗流程圖和提供的三個資料以及“操作操作提示提示”，在思考有關(guān)問題的基礎(chǔ)上，設(shè)計出一個詳細的，在思考有關(guān)問題的基礎(chǔ)上，設(shè)計出一個詳細的實驗方案。實驗方案。土壤取樣土壤取樣選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)梯度稀釋梯度稀釋 將樣品涂布在鑒別纖將樣品涂布在鑒別纖 維素分解菌的培養(yǎng)基上維素分解菌的培養(yǎng)基上 篩選產(chǎn)生透篩選產(chǎn)生透 明圈的菌落明圈的菌落 生物與環(huán)境的互相依存關(guān)系，在富含纖維素生物與環(huán)境的互相依存關(guān)系，在富含纖維素的環(huán)境中的環(huán)境中纖維素分解菌的含量相對提高纖維素分解菌的含量相對提高，因此從，因此從這種土壤中這種土壤中獲得獲得目的微生物的目的微生物的幾率要高幾率要高于普通環(huán)于普通環(huán)境。境。將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對集中，實際上是集中，實際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境適宜環(huán)境。一般應(yīng)將濾紙埋于深約。一般應(yīng)將濾紙埋于深約10cm10cm左右的左右的土壤中。土壤中。 培養(yǎng)基成分分析培養(yǎng)基成分分析 培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基組成 提供主要的營養(yǎng)物質(zhì)提供主要的營養(yǎng)物質(zhì)纖維素粉纖維素粉 5g 碳源（能源）碳源（能源）NaNO3 1g 氮源、無機鹽氮源、無機鹽KCl 0.5g Na2HPO47H2O 1.2gKH2PO4 0.9g MgSO4 7H2O 0.5g 無機鹽無機鹽酵母膏酵母膏 0.5g生長因子、碳源、氮源生長因子、碳源、氮源水解酵素水解酵素 0.5g氮素、生長因子氮素、生長因子溶解后，蒸餾水定容至溶解后，蒸餾水定容至1000mL水水提示：自變量為培養(yǎng)基的種類，即普通培養(yǎng)基和選擇提示：自變量為培養(yǎng)基的種類，即普通培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基?？捎门Ｈ飧嗟鞍纂伺囵B(yǎng)基與之對照培養(yǎng)基。可用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基與之對照,或者將纖或者將纖維素改為葡萄糖。維素改為葡萄糖。有選擇作用，本配方中纖維素作為主要碳源，只有能有選擇作用，本配方中纖維素作為主要碳源，只有能分解纖維素的微生物可以大量繁殖。分解纖維素的微生物可以大量繁殖。比較項目比較項目分解尿素的細菌分解尿素的細菌纖維素分解菌纖維素分解菌選選擇擇培培養(yǎng)養(yǎng)基基原理原理培養(yǎng)基培養(yǎng)基類型類型目的目的鑒鑒定定培培養(yǎng)養(yǎng)基基原理原理現(xiàn)象現(xiàn)象方法方法將細菌涂布在只有將細菌涂布在只有尿素尿素做氮源的選擇做氮源的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)基上將細菌涂布在只有將細菌涂布在只有纖維素粉纖維素粉做碳源的做碳源的選擇培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)基上固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基篩選菌株篩選菌株選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)思考：本實驗的流程與課題思考：本實驗的流程與課題2 2中的實驗流程有哪些中的實驗流程有哪些異同？異同？ 本實驗流程與課題本實驗流程與課題2 2的流程的區(qū)別如下。課的流程的區(qū)別如下。課題題2 2是將土樣制成的菌懸液直接涂布在是將土樣制成的菌懸液直接涂布在以尿素為以尿素為唯一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離唯一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離得到菌得到菌落。本課題通過落。本課題通過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖后，到增殖后，再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其他步驟基本一致。他步驟基本一致。 101102103104105106培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基組成提供的主要營養(yǎng)物質(zhì)提供的主要營養(yǎng)物質(zhì)CMC-Na 510g碳源碳源酵母膏酵母膏 1g碳源、氮源、生長因子碳源、氮源、生長因子KH2PO4 0.25g無機鹽無機鹽土豆汁土豆汁 100mL碳源、生長因子碳源、生長因子瓊脂瓊脂 15g凝固劑凝固劑上述物質(zhì)溶解后，加蒸上述物質(zhì)溶解后，加蒸餾水定容至餾水定容至1000mL氫元素、氧元素氫元素、氧元素鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基(水溶性羧甲基纖維素鈉水溶性羧甲基纖維素鈉)比較比較項目項目分解尿素的細菌分解尿素的細菌纖維素分解菌纖維素分解菌選選擇擇培培養(yǎng)養(yǎng)原理原理培養(yǎng)基類培養(yǎng)基類型型目的目的鑒鑒定定培培養(yǎng)養(yǎng)基基原原理理現(xiàn)現(xiàn)象象方方法法在細菌分解尿素的化學反應(yīng)在細菌分解尿素的化學反應(yīng)中，細菌合成的脲酶將尿素中，細菌合成的脲酶將尿素分解成了氨，氨會使培養(yǎng)基分解成了氨，氨會使培養(yǎng)基的堿性增強，的堿性增強，pHpH升高。在培升高。在培養(yǎng)基中加入養(yǎng)基中加入酚紅指示劑酚紅指示劑，如，如果果pHpH升高指示劑會升高指示劑會變紅變紅剛果紅剛果紅可以與纖維素形成可以與纖維素形成紅色復(fù)合物紅色復(fù)合物，當纖維素被，當纖維素被纖維素酶催化分解后紅色纖維素酶催化分解后紅色復(fù)合物無法形成，培養(yǎng)基復(fù)合物無法形成，培養(yǎng)基上就會出現(xiàn)以纖維素分解上就會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的菌為中心的透明圈透明圈觀察菌落周圍是否有觀察菌落周圍是否有著色的著色的環(huán)帶環(huán)帶出現(xiàn)來鑒定尿素分解菌出現(xiàn)來鑒定尿素分解菌觀察菌落周圍是否出現(xiàn)觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈透明圈來篩選纖維素分解菌來篩選纖維素分解菌脲酶檢測法脲酶檢測法剛果紅染色法剛果紅染色法方法一中方法一中NaCl溶液的作用？溶液的作用？思考：思考： 漂洗作用漂洗作用，洗去與纖維素結(jié)合不牢的剛果紅，洗去與纖維素結(jié)合不牢的剛果紅，以免出現(xiàn)的透明圈不夠清晰。用這方法可以判斷酶以免出現(xiàn)的透明圈不夠清晰。用這方法可以判斷酶活力的大小，實際上剛果紅是結(jié)合到培養(yǎng)基的多糖活力的大小，實際上剛果紅是結(jié)合到培養(yǎng)基的多糖底物，但分解纖維素的細菌可以產(chǎn)生纖維素酶，能底物，但分解纖維素的細菌可以產(chǎn)生纖維素酶，能分解這個多糖底物成為單糖，這樣剛果紅就不能結(jié)分解這個多糖底物成為單糖，這樣剛果紅就不能結(jié)合上去了，氯化鈉溶液就可以使結(jié)合不牢的剛果紅合上去了，氯化鈉溶液就可以使結(jié)合不牢的剛果紅洗去，這樣就留下大大小小的透明圈，大的透明圈洗去，這樣就留下大大小小的透明圈，大的透明圈當然分解纖維素的能就強！當然分解纖維素的能就強！ 四、結(jié)果分析與評價四、結(jié)果分析與評價 1.1.培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落出菌落 對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。培養(yǎng)基制作合格。 如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。了分解纖維素的微生物。 2.2.分離的結(jié)果是否一致分離的結(jié)果是否一致 由于在土壤中細菌的數(shù)量遠遠高于真菌和放線菌由于在土壤中細菌的數(shù)量遠遠高于真菌和放線菌的數(shù)量，因此最容易分離得到的是細菌。但由于所取的數(shù)量，因此最容易分離得到的是細菌。但由于所取土樣的環(huán)境不同，不同同學也可能得到真菌和放線菌土樣的環(huán)境不同，不同同學也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結(jié)果。等不同的分離結(jié)果。 為了確定分離得到的是纖維素分解菌，為了確定分離得到的是纖維素分解菌，還需要進行還需要進行_ _實驗，纖維素酶實驗，纖維素酶的發(fā)酵方法有的發(fā)酵方法有_ _ 發(fā)酵和發(fā)酵和_ _ 發(fā)酵。發(fā)酵。纖維素酶測定方法是對纖維素酶分解濾紙等纖維素酶測定方法是對纖維素酶分解濾紙等纖維素所產(chǎn)生的纖維素所產(chǎn)生的_ _ 含量進行定量測定。含量進行定量測定。發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶 液體液體 固體固體 五、課題延伸五、課題延伸分解分解纖維纖維素的素的微生微生物的物的分離分離纖維素酶纖維素酶種類、作用、催化活力種類、作用、催化活力剛果紅染色剛果紅染色篩選原理篩選原理實實驗驗設(shè)設(shè)計計土壤取樣土壤取樣選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)涂布培養(yǎng)涂布培養(yǎng)純化培養(yǎng)純化培養(yǎng)前置染色法前置染色法后置染色法后置染色法富含纖維素土壤富含纖維素土壤增大分解菌含量增大分解菌含量染色鑒別染色鑒別分離出分解菌分離出分解菌課堂總結(jié)課堂總結(jié)