熒光蛋白基因在大腸桿菌中的表達(dá)與檢測.doc

綠色熒光蛋白基因在大腸桿菌中的表達(dá)與檢測一、 背景介紹1綠色熒光蛋白1955年，Davenport和Nicol 在太平洋海里的一種發(fā)光生物維多利亞水母(Aequorea victoria)中發(fā)現(xiàn)并發(fā)表了熒光蛋白的生物發(fā)光現(xiàn)象，但是對生物發(fā)光現(xiàn)象的機(jī)理并不了解。1962年，日本科學(xué)家下村修在水母中純化鑒定出了一種能催化化學(xué)發(fā)光的蛋白質(zhì)分子并將其命名為aequorin，aequorin能將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能，從而產(chǎn)生出波長為470nm的藍(lán)色光(lmax=470nm)，但是水母發(fā)出的光是獨(dú)有的綠色，因此水母發(fā)光的蛋白質(zhì)并非 aequorin。與此同時(shí)，發(fā)現(xiàn)和分離了一個(gè)受紫外線激發(fā)能發(fā)出綠色熒光的蛋白質(zhì)綠色熒光蛋白(GFP)。1971年，Morin和Hastings提出了GFP這個(gè)名稱。1985到1992年間，科學(xué)家 Douglas Prasher 測定完成了aequorin 和GFP的基因和蛋白質(zhì)序列，并通過蛋白質(zhì)序列分析和核磁共振分光術(shù)(NMR spectroscopy)確定了GFP發(fā)光位點(diǎn)。1994年，美國科學(xué)家錢永健開始改造GFP，目前所用的大多數(shù)是錢永健實(shí)驗(yàn)室改造后的變種，有的熒光更強(qiáng)，有的可激活、變色。1996年，解析得到了GFP的晶體結(jié)構(gòu)，它的發(fā)光過程是也在日后的應(yīng)用中得到了解答?？v觀整個(gè)過程，從1961年到1974年，下村修的研究遙遙領(lǐng)先，卻很少有人注意。在1974年以后，特別是八十年代后，綠色熒光蛋白的研究得到了廣泛的重視和發(fā)展。綠色熒光蛋白，分子質(zhì)量約為28kDa，由238個(gè)氨基酸構(gòu)成，第6567位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成發(fā)光團(tuán)，經(jīng)共價(jià)鍵連接而成對羥苯甲基咪唑烷酮，它可以被光激發(fā)產(chǎn)生熒光，是主要發(fā)光的位置。綠色熒光蛋白分子的形狀呈圓柱形，就像一個(gè)桶，發(fā)光的基團(tuán)位于桶中央，因此，它可形象地比喻成一個(gè)裝有色素的“油漆桶”。其發(fā)光團(tuán)的形成不具有物種專一性，發(fā)出的熒光穩(wěn)定，且不需要依賴其他基質(zhì)而發(fā)光。GFP的優(yōu)點(diǎn)很多：首先，它本身穩(wěn)定，不需要任何反應(yīng)底物和輔助因子，且無種屬限制，可在多種生物細(xì)胞中表達(dá)發(fā)出穩(wěn)定熒光，在450490nm 藍(lán)光激發(fā)下,發(fā)光能保持 10min 以上。其次，其分子量小，對目的基因的功能無任何影響，融合蛋白具有與GFP一樣的熒光性質(zhì)，對細(xì)胞沒有毒性。最后，GFP觀察方便，利用激光掃描共聚焦顯微鏡，甚至普通顯微鏡都可以觀察到活細(xì)胞內(nèi)蛋白的變化、活動(dòng)，用肉眼就可對辨別細(xì)胞是否表達(dá)及其表達(dá)水平。作為一種新型的報(bào)告基因， 綠色熒光蛋白在生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用：利用綠色熒光蛋白的特有發(fā)光機(jī)制，可將GFP作為蛋白標(biāo)簽。就是利用 DNA 重組技術(shù)，將目的基因與GFP基因構(gòu)成融合基因，轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化至合適的細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，而后借助熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)活體中標(biāo)記的蛋白質(zhì)。綠色熒光蛋白也可用于大規(guī)模藥物篩選。另外，由于綠色熒光蛋白獨(dú)特的光信號傳導(dǎo)機(jī)制及其在表達(dá)后易被周圍化學(xué)環(huán)境和蛋白之間的相互作用影響的特性，極適用于成為活細(xì)胞體內(nèi)的光學(xué)感受器。近年來，由于融合抗體具有發(fā)射熒光和與抗原結(jié)合兩種特性，所以將其用做免疫染色的檢測試劑，直接用于流式細(xì)胞儀、免疫熒光的標(biāo)記、腫瘤的檢測等。目前應(yīng)用較多的是GFP的突變體增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein，簡稱EGFP）。EGFP將GFP的第64位氨基酸苯丙氨酸突變成為亮氨酸，從而發(fā)射出的熒光強(qiáng)度比GFP大6倍以上。所以，EGFP比GFP更適合作為報(bào)告基因來研究基因表達(dá)、調(diào)控、細(xì)胞分化及蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)的定位和轉(zhuǎn)運(yùn)等EGFP (720bp)的基因片段: ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA2.大腸桿菌表達(dá)載體及表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌質(zhì)粒是一類獨(dú)立于染色體外自主復(fù)制的雙鏈、閉環(huán)DNA分子，大腸桿菌質(zhì)粒可分為結(jié)合轉(zhuǎn)移型和非結(jié)合轉(zhuǎn)移型兩種，非結(jié)合轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒在通常培養(yǎng)條件下不在宿主間轉(zhuǎn)移，整合到染色體上的頻率也很低，具有遺傳學(xué)上的穩(wěn)定性和安全性。又因其大小一般在250kb范圍內(nèi)，適合于制備和重組DNA的體外操作，因此幾乎所有的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)都選用非結(jié)合轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒作為運(yùn)載外源基因的載體，這些表達(dá)載體通過對天然質(zhì)粒的改造獲得。理想的大腸桿菌表達(dá)載體要求具有以下特征：（1）穩(wěn)定的遺傳復(fù)制、傳代能力，在無選擇壓力下能存在于大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)。（2）具有顯性的轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記。（3）啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄是可以調(diào)控的，抑制時(shí)本底轉(zhuǎn)錄水平較低。（4）啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄的mRNA能夠在適當(dāng)?shù)奈恢媒K止，轉(zhuǎn)錄過程不影響表達(dá)載體的復(fù)制。（5）具備適用于外源基因插入的酶切位點(diǎn)。復(fù)制子、篩選標(biāo)志、啟動(dòng)子、終止子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)是構(gòu)成表達(dá)載體的最基本元件。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是基因表達(dá)技術(shù)中發(fā)展最早，目前應(yīng)用最廣泛的經(jīng)典表達(dá)系統(tǒng)。一個(gè)完整的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)至少要有表達(dá)載體和宿主菌兩部分構(gòu)成。為了改善表達(dá)系統(tǒng)的性能和對各類外源基因的適應(yīng)能力，表達(dá)系統(tǒng)有時(shí)還需要有特定功能基因的質(zhì)粒或溶源化噬箘體參與。到目前為止已經(jīng)成功發(fā)展了許多表達(dá)載體和相應(yīng)的宿主菌。由于大腸桿菌本身的蛋白質(zhì)翻譯后修飾加工體系相當(dāng)不完善，因此不能對重組蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾加工，這是大腸桿菌系統(tǒng)與其它表達(dá)系統(tǒng)相比存在的一個(gè)比較突出的缺陷。大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)包括：Lac和Tac表達(dá)系統(tǒng)，這是最早建立并得到廣泛應(yīng)用的表達(dá)系統(tǒng)，它是以大腸桿菌lac操縱子調(diào)控機(jī)理為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)、構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)。PL和PR表達(dá)系統(tǒng)，它是以噬箘體早期轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子PL、PR為核心構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)稱為PL和PR表達(dá)系統(tǒng)。T7表達(dá)系統(tǒng)，大腸桿菌T7噬箘體具有一套專一性非常強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄體系，利用這一體系中的元件為基礎(chǔ)構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)稱為T7表達(dá)系統(tǒng)。此外還有其他表達(dá)系統(tǒng)，如營養(yǎng)調(diào)控型、糖原調(diào)控型、pH調(diào)控型等。3SDS-PAGE原理SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS，SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進(jìn)行電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。SDS- 聚丙烯酰胺凝膠使用一種不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)。在這一系統(tǒng)中，一般凝膠分為低濃度的成層膠（濃縮膠）和較高濃度的分離膠。在電泳時(shí)， SDS-多肽復(fù)合物向兩膠界面遷移，在分離膠表面形成了一個(gè)極薄的層，極大地濃縮了樣品的體積，使樣品在分離之前處于同一起跑線。一般來說，在被分析的蛋白質(zhì)穩(wěn)定的pH范圍，凡是不與SDS發(fā)生相互作用的緩沖液都可以使用，但緩沖液的選擇對蛋白帶的分離和電泳的速度是非常關(guān)鍵的。Tris-甘氨酸系統(tǒng)是目前使用最多的緩沖系統(tǒng)。如果要測定糖蛋白的分子量，最好采用Tris-硼酸鹽緩沖系統(tǒng)，對于分子質(zhì)量小于15kDa的蛋白樣品，可以使用SDS-尿素系統(tǒng)，也可以采用Tris-tricine緩沖系統(tǒng)。4.蛋白分離與檢測蛋白質(zhì)的分離方法很多，依據(jù)分子大小分離的方法包括：透析和超過濾，透析指利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜而與小分子分離；超濾是利用壓力或離心力使小分子溶質(zhì)通過半透膜而蛋白質(zhì)被截留在膜上而分離。密度梯度離心，蛋白質(zhì)顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時(shí)，質(zhì)量和密度大的顆粒比質(zhì)量和密度小的顆粒沉降得快，且每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與其自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時(shí)，即停止不前，最后各種蛋白質(zhì)在離心管中被分離成不同的區(qū)帶。凝膠過濾，即分子排阻層析。凝膠顆粒內(nèi)部為多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。大分子最先流出層析柱。根據(jù)溶解度分離的方法包括：鹽溶和鹽析，中性鹽在低濃度時(shí)可增加蛋白質(zhì)的溶解度，即鹽溶。原因是蛋白質(zhì)分子吸附鹽類離子后，帶電層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而與水分子相互作用加強(qiáng)；當(dāng)離子強(qiáng)度增大到足夠高時(shí)，此時(shí)與蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)接觸的自由水被移去以溶劑化鹽離子，導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)暴露，使蛋白質(zhì)因疏水作用凝聚沉淀。根據(jù)所帶電荷分離的方法包括：電泳（凈電荷、分子大小、形狀），區(qū)帶電泳、聚丙烯酰氨凝膠電泳（PAGE）、毛細(xì)管電泳離子交換層析。其余的方法還有吸附層析、親和層析、高效液相層析（HPLC）,快速蛋白液相層析（FPLC）等。蛋白質(zhì)的檢測方法包括：凱氏定氮法，它是樣品與濃硫酸共熱。含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度可計(jì)算得樣品之氮含量。雙縮尿法，雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個(gè)分子脲經(jīng)180左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能過一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。Folin酚試劑法，此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深藍(lán)色的原因是：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。Folin酚試劑中的磷鉬酸鹽磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深藍(lán)色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，藍(lán)色深度與蛋白的量成正比。紫外吸收法，蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定。5. pET28a 質(zhì)粒pET28a 質(zhì)粒作為表達(dá)載體, 該質(zhì)粒含有強(qiáng)啟動(dòng)子T7 啟動(dòng)子, 可以使目的基因得到高效表達(dá)。其N端含有Thrombin蛋白酶切位點(diǎn)。 Pet28a的抗性是kana抗性，通常所用的表達(dá)菌株是BL21（DE3），BL21（DE3）Gold等BL21（DE3）系列的宿主菌。pET28a, b, c的差異僅僅存在于多克隆位點(diǎn)處，Pet28a和pET28b，pet28c的載體的區(qū)別是差了一個(gè)核苷酸堿基，目的是便于在進(jìn)行克隆構(gòu)建的時(shí)候調(diào)整氨基酸讀碼框，使得基因都可以克隆到這個(gè)系列目的載體中去。pET28a：5 測序引物及序列:T7: 5-TAATACGACTCACTATAGGG-33 測序引物序列:T7t: 5-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3二 試驗(yàn)流程1. 實(shí)驗(yàn)器材及試劑超低溫冰箱、電熱恒溫培養(yǎng)箱、恒溫調(diào)速搖床、PCR 擴(kuò)增儀、電泳儀、高速冷凍離心機(jī)、電子天平、水浴鍋、低溫高速離心機(jī)、快速混勻器、EGFP-N3 模板、菌株E. coli DH5、E. coli BL21、質(zhì)粒 pET28a、限制性內(nèi)切酶 EcoR, Hind 、T4 DNA 連接酶、DNA 凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒、小提試劑盒、DNA 純化試劑盒及 IPTG、PCR用試劑、卡那霉素、瓊脂糖及 PCR 合成引物等、蛋白胨、酵母浸出粉、瓊脂粉等2. 實(shí)驗(yàn)流程（實(shí)驗(yàn)中樣品用量根據(jù)提取的各種載體、質(zhì)粒的濃度相應(yīng)的改變）2.1堿裂變法提質(zhì)粒2.1.1細(xì)菌的培養(yǎng) 1) 添加適量的抗菌素（Ap: 20 mg/mL母液終濃度50100 ug/mL）（避免雜菌污染，防止質(zhì)粒的丟失） 2) 接種（20 mL+Ap50 mL+Ap）3) 控制菌體的生長狀態(tài)（37過夜培養(yǎng)或轉(zhuǎn)接24菌液至新鮮培養(yǎng)基中， 37繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長中后期）。2.1.2細(xì)胞裂解提取質(zhì)粒DNA（4操作，每100mg菌體量，加入）1）稱離心管重W1，加入約1/2離心管的菌液，與另一組同學(xué)配平，6000r/min離心5min。2）棄去上清液，再加入5ml溶液，混勻，6000r/min離心5min，棄去上清液，稱離心管重量為W2，計(jì)算菌體量W。3）1.0mL溶液，充分渦旋震蕩，用溶液再次配平。4）2.0mL溶液，輕柔顛倒混勻，冰浴3-5min。5）15mL溶液，輕柔顛倒混勻，冰浴5min。6）12000rpm，15min；小心轉(zhuǎn)移上清到新的離心管中，記錄體積V。7）加入2V冰乙醇，顛倒混勻；-20,15min。8）12000rpm，15min，棄上清。9）加入5mL70%乙醇，12000rpm，3min，吸棄上清液。10）重復(fù)乙醇洗滌一次，37風(fēng)干5-10min。11）分次加入1mLTE溶液并轉(zhuǎn)移到Ep管中，得到質(zhì)粒DNA粗提物。12）加入50ulRNase（10mg/ml），終濃度為50ug/ml，37孵育1-2h。2.1.3質(zhì)粒DNA的純化1）1ml粗提物均分于兩個(gè)Ep管中，加入等體積Tris飽和酚，混勻，12000rpm離心5min。2）轉(zhuǎn)移上清V1至新管，加入V1的酚/氯仿/異戊醇混合液，混勻，12000rpm離心5min。3） 轉(zhuǎn)移上清V2至新管，加入V2的氯仿/異戊醇溶液，混勻，12000rpm離心5min。4）轉(zhuǎn)移上清V3至新管，加入1/10V3的3MNaAc溶液（pH=5.2），再加入2V4（V4=V3+1/10V3）的冰乙醇，混勻，-20保存30min。5）12000rpm離心14min，棄上清。 6）加入500ul70%乙醇洗滌，12000rpm離心2min，棄上清。7）重復(fù)洗滌一次，吸棄上清液，37風(fēng)干5min。8）每管加入25ulTE溶解沉淀，合并，得到50ul純化質(zhì)粒DNA。2.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建2.2.1 EGFP和質(zhì)粒DNA的酶切加樣順序?yàn)椋篸dH2O-Buffer（緩沖液）-DNA-限制性內(nèi)切酶 Hind；在不同的1.5ml無菌離心管中，按照表1中、組樣量順序加入各組分（將少量的樣品加在管壁上，確保加樣準(zhǔn)確）。樣品混勻后，4000rpm離心1min，將液體集中于管底。酶切后，可以用電泳檢測一下酶切的效果。表1.限制性內(nèi)切酶反應(yīng)體系加樣順序加樣序號反應(yīng)體系成分pUC19（各組）EGFP（商品）體積（l）體積（l）1ddH2O13.070.0210X M buffer2.010.03DNA4.015.04Hind（15U/l）1.05.0共計(jì)20.0100.0（50+50）備注各組1份全班1份2.2.2載體與外源片段的連接取無菌1.5mlEP管，加樣順序?yàn)椋篸dH2O-Buffer-pUC19/Hind- EGFP /Hind-T4DNA Ligase（見表二） 表2.T4連接酶反應(yīng)體系加樣順序加樣序號成分體積（l）1ddH2O3.2210X T4 Ligase Buffer1.03pUC19/Hind1.54EGFP /Hind3.55T4DNA Ligase08共計(jì)10.02.3 重組DNA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、鑒定與篩選2.3.1 感受態(tài)細(xì)胞的制備（注意冰浴、離心）1倒LB平板，劃線活化E.coliDH5，培養(yǎng)一段時(shí)間。挑取單菌落接種到5mlLB液體中，37震蕩培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物按1%轉(zhuǎn)接至新鮮20mlLB液體，37，220rmp震蕩2-2.5h。2取2個(gè)干凈的Ep管（編號SG-1-1、SG-1-2），各加入上述菌液1.5ml,4000rmp離心5min，棄上清，再各加入1.5ml菌液，4000rmp離心5min，棄上清。3. 利用殘留液體渦旋細(xì)胞，然后加入800l預(yù)冷的0.1M CaCl2，冰浴懸浮細(xì)胞，隨后4000rmp離心5min，棄上清。4. 加入100l冷0.1M CaCl2，輕輕懸浮細(xì)胞，冰浴20min，之后將SG-1-2分裝50l至SG-1-3管中。2.3.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 按表3的序號順序加樣、操作。表3.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化步驟：171234567實(shí)驗(yàn)設(shè)組感受態(tài)細(xì)胞（l/管）DNA（l）冰浴熱擊冰浴復(fù)蘇培養(yǎng)基涂布平板實(shí)驗(yàn)組100連接物5.010min90s5minLB：0.9ml/管，0.5-1h麥+Ap50l2100l2150l2200l2轉(zhuǎn)化對照50pUC19（自提）1.0麥+Ap50l1細(xì)胞對照50麥+Ap50l1麥50l1備注預(yù)留一個(gè)空白麥+Ap平板； 共計(jì)：11（麥+Ap）和1（麥），倒置于37恒溫箱中培養(yǎng)16-20h（本實(shí)驗(yàn)兩天后來觀察結(jié)果）。2.3.3 重組子的篩選與培養(yǎng)1. 觀察幾天前的涂布培養(yǎng)結(jié)果并記錄，著重包括：菌落生長情況、生長的菌落的顏色、菌落數(shù)量的多少，并測量菌落的pH值。2. 從實(shí)驗(yàn)組的2個(gè)50ul的平板中挑出4個(gè)白色單菌落，在事先預(yù)留的空白麥+Ap平板上分區(qū)劃線培養(yǎng)。將接好菌的平板放在恒溫培養(yǎng)箱中。2.4 PCR反應(yīng)2.4.1試劑盒法提質(zhì)粒1. 觀察上次劃線的平板中的菌落是否為白色。用燒好的鑷子夾著無菌牙簽劃取帶有重組質(zhì)粒的E.coliDH5a（白色的菌落），將帶有質(zhì)粒的E.coli接種于5ml LB/抗生素培養(yǎng)液中，37搖床培養(yǎng)1216個(gè)小時(shí)。2. 取1.05.0ml的菌液，室溫下10000xg離心1min收集細(xì)菌。3. 倒棄培養(yǎng)基，加入250ul Solution/RNase A混合液，漩渦震蕩使細(xì)胞完全懸浮。4. 往重懸混合液中加入250ul Solution，輕輕顛倒混勻46次，此操作避免劇烈混勻裂解液且裂解反應(yīng)不要超過5min。5. 加入350ul Solution，溫和顛倒數(shù)次至形成白色絮狀沉淀。6. 室溫下，10000xg離心10min。7. 轉(zhuǎn)移上清液至套有2ml收集管的HiBind DNA結(jié)合柱中，室溫下，10000xg離心1min，倒去收集管中的濾液。8. 把柱子重新裝回收集管，加入500ul HB Buffer，按上述條件離心，棄去濾液。9. 把柱子重新裝回收集管，加入700ul DNA Wash Buffer，按上述條件離心，棄去濾液。注意：濃縮的DNA Wash Buffer在使用之前必須按標(biāo)簽的提示用無水乙醇稀釋。10. 把柱子重新裝回收集管，10000xg離心空柱2min以甩干柱子基質(zhì)。注意:不要忽略次步這對去除柱子中殘留的乙醇至關(guān)重要。11. 把柱子裝在干凈的1.5ml離心管上，加入3050ul Elution Buffer到柱子基質(zhì)中，靜置12分鐘，10000xg離心1min洗脫出DNA。2.4.2 PCR反應(yīng)在進(jìn)行PCR反應(yīng)之前，可以用凝膠電泳檢測重組質(zhì)粒，看一下重組質(zhì)粒的大小，再用PCR擴(kuò)增目的基因。以EGFP 片段為模板, 設(shè)計(jì)上游引物: 5-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3,下游引物: 5- GGCTGATTATGATCTAGAGTC-3。可以先將模板適當(dāng)稀釋，實(shí)驗(yàn)要設(shè)置對照試驗(yàn)，可根據(jù)需求自主設(shè)計(jì)加入各組分后，分別取模板、上游和下游引物、Taq酶（5u/ul）、dd水、10 Buffer、dNTP作為 PCR反應(yīng)體系（可參照表4加），輕彈混勻加入的液體，快速離心集液于管底。將制備好的PCR體系放入PCR機(jī)器中，PCR的反應(yīng)程序如表5。表4. PCR體系的建立編號組分加量（ul）1dd水13.2210Buffer2.03dNTP（2.5mM each）1.64M13F（10uM）15M13R（10uM）16摸板（1-10ng/ul）1.07Taq酶（5u/ul）0.2總體積20.0表5. PCR反應(yīng)程序項(xiàng)目溫度時(shí)間預(yù)變性943min變性9430s復(fù)性5830s延伸7260s終延伸7210min保存42hr整個(gè) PCR 反應(yīng)體系共進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。2.5重組表達(dá)載體的構(gòu)建2.5.1 EGFP 基因和 pET28 a 表達(dá)載體的限制性酶切處理取上述經(jīng)PCR擴(kuò)增后的目的片段作為PCR反應(yīng)的模板, 設(shè)計(jì)引入EcoR酶切位點(diǎn)的上游引物( 5GGAG / AATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG3)和 引 入Hind 酶切位點(diǎn)的下游引物( 5CCGA / AGCTTGGCTGATTATGATCTAGAGTC3)。PCR 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同2.4.2。擴(kuò)增產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。PCR后的EGFP片段進(jìn)行雙酶切, 反應(yīng)體系如下: 30L添加了酶切位點(diǎn)的 EGFP片段、5ul 10buffer、1ul EcoR(20 U/L)、1ul Hind ( 20 U/L) ,用無菌水將反應(yīng)液調(diào)至 50 L 后,于 37下保溫1 h, 然后在 65條件下處理20min 進(jìn)行熱失活。另一方面, 將pET28a 質(zhì)粒載體按上述方法進(jìn)行雙酶切?？梢杂铆傊悄z電泳對上述兩個(gè)酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測。2.5.2 pET28a-EGFP重組表達(dá)載體的構(gòu)建 將上述含酶切位點(diǎn)的EGFP片段與線性pET28a質(zhì)粒按2：1比例、在45下保溫5 min 后, 置于冰浴中冷卻,冷卻后分別加入1ul T4DNA 連接酶、2ul10T4DNA連接酶緩沖液, 37培養(yǎng)過夜。2.6 EGFP 基因的原核表達(dá)及檢測 2.6.1制備E. coli BL21感受態(tài)細(xì)胞1倒LB平板，劃線活化E. coli BL21，培養(yǎng)一段時(shí)間。挑取單菌落接種到5mlLB液體中，37震蕩培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物按1%轉(zhuǎn)接至新鮮20mlLB液體，37，220rmp震蕩2-2.5h。2取2個(gè)干凈的Ep管（編號SG-1-1、SG-1-2），各加入上述菌液1.5ml,4000rmp離心5min，棄上清，再各加入1.5ml菌液，4000rmp離心5min，棄上清。3. 利用殘留液體渦旋細(xì)胞，然后加入800l預(yù)冷的0.1M CaCl2，冰浴懸浮細(xì)胞，隨后4000rmp離心5min，棄上清。4. 加入100l冷0.1M CaCl2，輕輕懸浮細(xì)胞，冰浴20min，之后分裝于管中2.6.2 pET28a-EGFP重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、鑒定 按表6依次加入各物質(zhì)。表6.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化步驟：171234567實(shí)驗(yàn)設(shè)組感受態(tài)細(xì)胞（l/管）DNA（l）冰浴熱擊冰浴復(fù)蘇培養(yǎng)基涂布平板100pET28a-EGFP連接物5.010min90s5minLB：0.9ml/管，0.5-1h麥+卡那霉素50l2100l2150l2在含卡那霉素的培養(yǎng)基上，能生長的菌落均為轉(zhuǎn)化成功的菌落，可以挑選幾個(gè)單菌落，在準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基上劃線，37培養(yǎng)兩天，再從上面挑菌并劃平板，等平板上的菌長出后，在熒光下觀察，若菌落發(fā)綠色熒光，則證明試驗(yàn)成功得到綠色熒光蛋白。 除此之外，還可對挑取的單菌落做菌落 PCR 檢驗(yàn), PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳后,若發(fā)現(xiàn)在約750 bp 處有清晰條帶，則與理論相符, 可以初步確定為陽性克隆。進(jìn)一步對陽性菌落中的質(zhì)粒進(jìn)行提純、用 EcoR和 Hind 對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切, 經(jīng)1. 0%瓊脂糖凝膠電泳判斷。還可以直接將 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序, 通過與 GenBank 序列比對,可以證明目的片段 EGFP 是否已正確連接到 pET28a 表達(dá)載體。 參考文獻(xiàn)：1. 季愛加, 寧喜斌 原核表達(dá)載體 pET28a EGFP 的構(gòu)建與表達(dá) 微生物學(xué)雜志 2011 年7 月第31 卷 第4 期2. 張麗瓊 抗菌肽DCD_1L與增強(qiáng)型綠色熒_省略_菌Transetta中的融合表達(dá)3. 辛國志 王玉英 盧波 王代紅 蛋白質(zhì)的分離提純及鑒定分析方法 中國環(huán)境衛(wèi)生 2005年第8卷第1期4. 劉默芳 王恩多 綠色熒光蛋白 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展 2000：27（3）