基因分子生物學(xué)實驗：第八節(jié) 細(xì)胞凋亡

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1、基因分子生物學(xué)實驗基因分子生物學(xué)實驗細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡的檢測細(xì)胞凋亡的檢測 凋亡誘導(dǎo)劑（凋亡誘導(dǎo)劑（TRAILTRAIL）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 MTT MTT法定量檢測法定量檢測 Hoechst 33342 Hoechst 33342 熒光染料法定性檢測熒光染料法定性檢測 1. 1. 儀器、用品：儀器、用品： 酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀2. 2. 試劑試劑 細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑 1 1PBSPBS MTT MTT溶液溶液 DMSODMSO3. 3. 細(xì)胞：人宮頸癌細(xì)胞：人宮頸癌HelaHela細(xì)胞細(xì)胞 9696孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔細(xì)胞培養(yǎng)板1 1塊（細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)）塊（細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)）細(xì)胞凋亡的

2、檢測細(xì)胞凋亡的檢測MTTMTT檢測法檢測法 實驗儀器、材料及試劑實驗儀器、材料及試劑細(xì)胞凋亡的檢測細(xì)胞凋亡的檢測Hoechst33342Hoechst33342熒光染料法熒光染料法 實驗儀器、材料及試劑實驗儀器、材料及試劑1.1.儀器、用品：儀器、用品： 光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡2. 2. 試劑試劑 細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑 1 1PBS PBS 4% 4%多聚甲醛多聚甲醛 Hoechst 33342Hoechst 33342染液染液細(xì)胞：人宮頸癌細(xì)胞：人宮頸癌HelaHela細(xì)胞細(xì)胞 9696孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔細(xì)胞培養(yǎng)板1 1塊（細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)）塊（細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)）光學(xué)顯微鏡

3、一臺光學(xué)顯微鏡一臺細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑1 1PBSPBS（一管（一管，室溫）室溫）MTT(MTT(一管，避光，冰浴一管，避光，冰浴) )超凈臺內(nèi)：超凈臺內(nèi)：實驗臺上：實驗臺上：加樣器（加樣器（2020、200200、10001000l l）各一套）各一套槍頭（槍頭（200200、10001000l l ）各一盒）各一盒1.5ml1.5ml離心管一盒、離心管架一個離心管一盒、離心管架一個酒精燈、酒精棉球、火柴、廢液缸、酒精燈、酒精棉球、火柴、廢液缸、markermarker筆等各一筆等各一準(zhǔn)備工作誘導(dǎo)凋亡誘導(dǎo)凋亡（超凈臺操作） ： 96孔板中每孔90 l培養(yǎng)基，按照10 l/孔加入凋亡誘

4、導(dǎo)劑，每個編號加3個平行孔。輕輕晃勻，做好標(biāo)記，繼續(xù)培養(yǎng)。(母液濃度6ug/ml，TRAIL 終濃度600, 300, 150, 75, 0 ng/ml) (9:00置于培養(yǎng)箱中置于培養(yǎng)箱中)1.1.凋亡概念的形成和形態(tài)學(xué)的研究凋亡概念的形成和形態(tài)學(xué)的研究(1972）1842年發(fā)現(xiàn)一種不同于細(xì)胞壞死不同于細(xì)胞壞死的細(xì)胞死亡現(xiàn)象;1887年命名為染色質(zhì)溶解死亡染色質(zhì)溶解死亡；1965年首次提出程序化死亡程序化死亡（programed cell death）的概念；1971年用皺縮死亡皺縮死亡來區(qū)別經(jīng)典的細(xì)胞壞死；1972年首次提出細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡(apotosis)的概念。宣告了對細(xì)胞凋亡的真正

5、探索的開始。2 2DNADNA的降解和內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的參與的降解和內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的參與, ,蛋白質(zhì)水解酶活蛋白質(zhì)水解酶活化化, ,細(xì)胞膜的變化細(xì)胞膜的變化(1987-1997）3. 3. 線粒體的變化和分子生物學(xué)的研究線粒體的變化和分子生物學(xué)的研究(1998-)細(xì)胞凋亡的研究歷史細(xì)胞凋亡的研究歷史 Nobel Prize 2002 in Physiology and Medicine Sydney Brenner John E. Sulston Robert H. Horvitz for their discoveries concerninggenetic regulation of o

6、rgan development and programmed cell death凋亡凋亡(apoptosis)(apoptosis)的形態(tài)學(xué)特征為染色質(zhì)凝集、邊緣化，細(xì)胞皺的形態(tài)學(xué)特征為染色質(zhì)凝集、邊緣化，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸外翻，細(xì)胞出泡形成凋亡小體?？s，細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸外翻，細(xì)胞出泡形成凋亡小體。細(xì)胞凋亡受到一系列相關(guān)基因的嚴(yán)格調(diào)控。細(xì)胞凋亡受到一系列相關(guān)基因的嚴(yán)格調(diào)控。程序性細(xì)胞死亡（程序性細(xì)胞死亡（programmed cell deathprogrammed cell death，PCDPCD），即是指細(xì)），即是指細(xì)胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序

7、，主動結(jié)束其胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，主動結(jié)束其生命的過程，這種死亡由基因決定的。大多數(shù)程序性細(xì)胞死亡，生命的過程，這種死亡由基因決定的。大多數(shù)程序性細(xì)胞死亡，呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征。呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征。 程序性細(xì)胞死亡：細(xì)胞凋亡、程序性壞死程序性細(xì)胞死亡：細(xì)胞凋亡、程序性壞死 （NecroptosisNecroptosis）、細(xì)胞焦亡（）、細(xì)胞焦亡（PyroptosisPyroptosis）、）、 自噬（自噬（AutophagyAutophagy）等）等細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死在形態(tài)上的主要區(qū)別 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞壞死發(fā)生條件 多為生理性 病理性（偶然刺激） 單個細(xì)胞丟失 成

8、群細(xì)胞死亡細(xì)胞膜 發(fā)泡，完整 破裂，不完整細(xì)胞器 結(jié)構(gòu)保留 破壞細(xì)胞核 核凝集斷裂 核破碎溶解 染色質(zhì)均一濃縮細(xì)胞 皺縮形成凋亡小體 細(xì)胞膨脹而溶解 被鄰近正常和巨噬細(xì)胞吞噬 殘余碎片被巨噬細(xì)胞吞噬炎癥反應(yīng) 無，不釋放內(nèi)容物 有，釋放內(nèi)容物細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死在生物化學(xué)方面的主要區(qū)別 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞壞死基因調(diào)節(jié) 由凋亡相關(guān)基因調(diào)控 與基因調(diào)控?zé)o關(guān)發(fā)生條件 多為生理性 病理性（偶然刺激） 能量 需要能量 不需要能量新的基因轉(zhuǎn)錄 有 無大分子合成 需要 不需要Caspase 依賴性 不依賴DNA 降解為180-200bp DNA隨機(jī)性降解成為任意 的整數(shù)倍的DNA Ladder 長度的片段細(xì)胞膜 磷

9、脂酰絲氨酸外翻Morphology of Apoptotic CellApoptosisNecrosisApoptosis Apoptosis VS.VS. Necrosis Necrosis細(xì)胞凋亡的生理學(xué)病理學(xué)意義細(xì)胞凋亡的生理學(xué)病理學(xué)意義 保證個體正常發(fā)育：蝌蚪成蛙、昆蟲蛻變、淋巴細(xì)胞保證個體正常發(fā)育：蝌蚪成蛙、昆蟲蛻變、淋巴細(xì)胞陽性和陰性選擇、表皮和指（趾）甲的形成等。陽性和陰性選擇、表皮和指（趾）甲的形成等。維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定：清除衰老細(xì)胞、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定：清除衰老細(xì)胞、DNADNA損傷的細(xì)胞等。損傷的細(xì)胞等。如果機(jī)體對受損、突變或者衰老的細(xì)胞不能及時清除如果機(jī)體對受損、突變或者衰老的細(xì)

10、胞不能及時清除話，就會干擾內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。話，就會干擾內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。防御功能：清除被病原體感染的細(xì)胞等。防御功能：清除被病原體感染的細(xì)胞等。生理學(xué)意義生理學(xué)意義保證個體正常發(fā)育：蝌蚪成蛙、昆蟲蛻變、淋巴細(xì)胞陽性和陰性選擇、表皮和指（趾）甲的形成等。 Sculpting the digits in the developing mouse paw by apoptosis. Tissue remodeling. 病原體侵染；病原體侵染； 誘導(dǎo)凋亡誘導(dǎo)凋亡HIVHIV 抑制凋亡抑制凋亡PoxvirusPoxvirus 細(xì)胞凋亡不足細(xì)胞凋亡不足 腫瘤，自身免疫疾?。荒[瘤，自身免疫疾??； 細(xì)胞凋亡過度細(xì)胞凋

11、亡過度 神經(jīng)退行性疾?。ㄅ两鹕Y）、心肌梗塞、神經(jīng)退行性疾?。ㄅ两鹕Y）、心肌梗塞、 再生障礙再生障礙性貧血、骨組織壞死。性貧血、骨組織壞死。病理學(xué)意義病理學(xué)意義接受凋亡信號接受凋亡信號蛋白水解酶（蛋白水解酶（caspasescaspases）的活化）的活化凋亡的級聯(lián)反應(yīng)凋亡的級聯(lián)反應(yīng)凋亡調(diào)控分子間的相互作用凋亡調(diào)控分子間的相互作用 細(xì)胞凋亡的信號傳遞細(xì)胞凋亡的信號傳遞細(xì)胞外部刺激信號介導(dǎo)的死亡受體信號細(xì)胞外部刺激信號介導(dǎo)的死亡受體信號傳遞途徑傳遞途徑( (extrinsicextrinsic) )細(xì)胞內(nèi)部的信號傳遞途徑細(xì)胞內(nèi)部的信號傳遞途徑( (intrinsic or intrinsic

12、or mitochondrial)mitochondrial) 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路（ERER stressstress）CRD：Cys-rich repeats extracellular DD： death domain cytoplasmic essentialStructure of Death Receptors胞外區(qū)結(jié)構(gòu)相似，有多個富含半胱氨酸保守序列；胞內(nèi)區(qū)均有特殊死亡功能區(qū)（約90個氨基酸殘基組成的基序, death domain, DD）；死亡功能區(qū)無任何酶活性，但可與具有相似死亡結(jié)構(gòu)域的蛋白結(jié)合。Caspase 1 ICECaspase 2 ICH-1/Nedd-2Cas

13、pase 3 CPP32/YamaCaspase 4 TX ICH-2 ICErel IICaspase 5 ICErel III TyCaspase 6 Mch-2Caspase 7 Mch-3Caspase 8 MACH FLICE Mch-5Caspase 9 ICE/LAP6 Mch-6Caspase 10 Mch-4 FLICE-2Caspase 11 ICH3Caspase 12 ER apoptosis-specificCaspase 13 ERICECaspase 14 MICECaspase 15Caspase 16Caspase 17Caspase 18Caspases:

14、cysteine aspartic acid specific protease “C” = cysteine, “asp” = cleave after Asp; family of proteases with similar amino acid sequence, structure, substrate specificityCaspases are produced as zymogensLavrik IN, J Clin Invest. 2005;115:2665-72 Activation model of caspasesHow caspases kill ICAD&CAD(

15、the inhibitor of Caspase- activated DNase) Lamins, causing lamina to collapse and contributing to chromatin condensation. Cytoskeletons, cell junctions Deregulation of protein activitySignal Transduction by death receptorsAshkenazi A. Nat Rev Cancer. 2002;2(6):420-30Immunol Cell Biol (2006) 84, 8798

16、Central role of mitochondria in apoptosis- 線粒體跨膜通道線粒體跨膜通道 (permeability transition (permeability transition pore , PTpore , PT孔孔) ) 的開放的開放- 線粒體跨膜電位下降，線粒體跨膜電位下降，Cyt c Cyt c 釋放釋放- Cyt c/Apaf-1/procaspase- Cyt c/Apaf-1/procaspase- 9/dATP apoptosome 9/dATP apoptosome- Caspase Caspase級聯(lián)級聯(lián)- Smac Smac釋放釋放S

17、tructure of Apaf-1Apaf-1: apoptotic protease activating factor-1 Finkel, Science. 2001; 292(5517):624-626. 線粒體線粒體PT孔主要由位于內(nèi)膜的腺苷孔主要由位于內(nèi)膜的腺苷轉(zhuǎn)位因子轉(zhuǎn)位因子ANT和位于外膜的電壓依賴和位于外膜的電壓依賴性陰離子通道性陰離子通道VDAC等蛋白所組成，等蛋白所組成，PT孔開放會引起線粒體跨膜電位下孔開放會引起線粒體跨膜電位下降和降和cyt c、凋亡因子、凋亡因子AIF等釋放。等釋放。Bcl-2家族蛋白對于家族蛋白對于PT孔的開放和關(guān)孔的開放和關(guān)閉起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，促

18、凋亡蛋白閉起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，促凋亡蛋白Bax等可以通過與等可以通過與ANT或或VDAC的結(jié)的結(jié)合介導(dǎo)合介導(dǎo)PT孔的開放，而抗凋亡類蛋孔的開放，而抗凋亡類蛋白如白如Bcl-2、Bcl-xL等則可通過與等則可通過與Bax競爭性地與競爭性地與ANT結(jié)合，或者直接結(jié)合，或者直接阻止阻止Bax與與ANT、VDAC的結(jié)合來發(fā)的結(jié)合來發(fā)揮其抗凋亡效應(yīng)。揮其抗凋亡效應(yīng)。Stefan J. Riedl Nature Reviews Molecular Cell Biology 5, 897-907Pathways to cell death in C. elegans, Fruitflies and mamma

19、ls Intrinsic Signaling Pathway Activation requires: - Cytochrome c release - ATP/dATP - Apaf-1 - Cyt c/Apaf-1/procaspase- 9/ATP(dATP) apoptosome - Caspase-9 activation Extrinsic Signaling Pathway Activation requires: - death receptor - adaptor proteins(FADD/ TRADD) - DISC (death-inducing signaling c

20、omplex ) - Caspase-8/10 activation內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路1.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡2.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子信號與細(xì)胞凋亡內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子信號與細(xì)胞凋亡3.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上BCL-2家族參與細(xì)胞凋亡家族參與細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)u凋亡相關(guān)基因凋亡相關(guān)基因 抑制凋亡基因：抑制凋亡基因：Bcl-2，F(xiàn)LIP， IAP促進(jìn)凋亡基因：促進(jìn)凋亡基因：wtP53，Bax，ICE， Smac 雙向調(diào)控基因：雙向調(diào)控基因：c-mycBcl-2家族Inhibitors of apoptosis proteins (IAPs)IAP (XIAP, c-IAP-1, c-

21、IAP-2, Survivin, Livin): to bind with pro-caspase and inhibit the activation of caspases;IAP inhibitors： Smac/DIABLO (second mitochondria-derived activator of caspase/direct IAP-binding protein with low pH), to bind with IAPs and activate caspase-9 Omi/HtrA2P53 & apoptosisp53p53主要功能是監(jiān)視細(xì)胞基因組主要功能是監(jiān)視細(xì)胞

22、基因組DNADNA的完整性。的完整性。 如有損傷，如有損傷，p53p53可以感知這些損傷，可以促使細(xì)胞停留在可以感知這些損傷，可以促使細(xì)胞停留在G1 G1 期，進(jìn)行期，進(jìn)行DNADNA損傷修復(fù)，避免錯誤損傷修復(fù)，避免錯誤DNADNA的進(jìn)一步復(fù)制。同時，的進(jìn)一步復(fù)制。同時， p53p53可以促進(jìn)可以促進(jìn)DNADNA修復(fù)蛋白的轉(zhuǎn)錄合成，從而促進(jìn)細(xì)胞對修復(fù)蛋白的轉(zhuǎn)錄合成，從而促進(jìn)細(xì)胞對DNADNA損損 傷進(jìn)行修復(fù)，確保遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。傷進(jìn)行修復(fù)，確保遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。 一旦這種修復(fù)無法完成，一旦這種修復(fù)無法完成，p53p53將促進(jìn)一系列凋亡相關(guān)蛋白的表將促進(jìn)一系列凋亡相關(guān)蛋白的表 達(dá)，例如達(dá)，例如

23、BaxBax、PUMAPUMA、NoxaNoxa、Fas,Fas,從而有效的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而有效的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡， 清除受損的細(xì)胞，防止細(xì)胞癌化清除受損的細(xì)胞，防止細(xì)胞癌化MTT細(xì)胞增殖檢測原理MTT比色法比色法檢測細(xì)胞檢測細(xì)胞存活存活的方法。的方法。MTT：3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，漢語化學(xué)名為，漢語化學(xué)名為 3-(4，5-二甲基噻唑二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)。二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)?；罴?xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫

24、酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定其光吸收）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在在一定細(xì)胞數(shù)范圍一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗以

25、及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、篩選、細(xì)胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。經(jīng)濟(jì)。（大規(guī)模、高通量）（大規(guī)模、高通量）缺點：由于缺點：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結(jié)果的測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。產(chǎn)生影響。1. 細(xì)胞以細(xì)胞以2105/ml細(xì)胞數(shù)接種于細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中，每孔孔板中，每孔100l，另以不加細(xì)胞只加培，另以不加細(xì)胞只加培養(yǎng)基作為空白對照。按照實驗需要，進(jìn)行培養(yǎng)并給予特定的藥物刺激養(yǎng)基作為空白對照。

26、按照實驗需要，進(jìn)行培養(yǎng)并給予特定的藥物刺激（具體（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）；2. 藥物刺激結(jié)束后，在藥物刺激結(jié)束后，在96孔板中每孔加孔板中每孔加MTT溶液（溶液（5mg/ml，用，用PBS配制配制)15 l，繼續(xù)孵育繼續(xù)孵育4小時；小時；3. 終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150 l DMSO，脫色搖床振蕩，脫色搖床振蕩10min，使結(jié)晶物充分融解；，使結(jié)晶物充分融解；4. 比色：選擇比色：選擇490nm（570nm）波長，在酶聯(lián)免

27、疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值。）波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值。5. 結(jié)果分析：結(jié)果分析： 用以下公式計算細(xì)胞存活率用以下公式計算細(xì)胞存活率. 細(xì)胞存活率細(xì)胞存活率 = (實驗組實驗組A值值/對照組對照組A值值)100% 以藥物濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線以藥物濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線MTT細(xì)胞增殖檢測步驟 由于使用由于使用9696孔板進(jìn)行檢測，如果細(xì)胞培養(yǎng)時間較長，一定要注意蒸孔板進(jìn)行檢測，如果細(xì)胞培養(yǎng)時間較長，一定要注意蒸 發(fā)的問題。一方面，由于發(fā)的問題。一方面，由于9696孔板周圍一圈最容易蒸發(fā)，可以采取棄孔板周圍一圈最容易蒸發(fā)，可以采

28、取棄 用周圍一圈的辦法，改加用周圍一圈的辦法，改加PBSPBS，水或培養(yǎng)液；另一方面，可以把，水或培養(yǎng)液；另一方面，可以把9696孔孔 板置于靠近培養(yǎng)箱內(nèi)水源的地方，以緩解蒸發(fā)；板置于靠近培養(yǎng)箱內(nèi)水源的地方，以緩解蒸發(fā)； MTTMTT溶液為黃色需避光保存，長時間光照會導(dǎo)致失效。當(dāng)顏色變?yōu)槿芤簽辄S色需避光保存，長時間光照會導(dǎo)致失效。當(dāng)顏色變?yōu)?灰綠色時，請勿使用；灰綠色時，請勿使用； 在溶解紫色結(jié)晶時，可在顯微鏡下觀察是否完全溶解。如果紫色結(jié)在溶解紫色結(jié)晶時，可在顯微鏡下觀察是否完全溶解。如果紫色結(jié) 晶較大較多，可在晶較大較多，可在3737培養(yǎng)箱孵育以促進(jìn)溶解；培養(yǎng)箱孵育以促進(jìn)溶解； 在在一定細(xì)

29、胞數(shù)范圍一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，內(nèi)，MTTMTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比，針對不結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比，針對不 同的細(xì)胞要進(jìn)行細(xì)胞接種數(shù)量的摸索。同的細(xì)胞要進(jìn)行細(xì)胞接種數(shù)量的摸索。 MTT MTT法由于具有法由于具有線性范圍寬，使用方便線性范圍寬，使用方便，不需要特殊檢測儀器、，不需要特殊檢測儀器、無放射性同位素、適合無放射性同位素、適合大批量大批量檢測的特點而得到廣泛的應(yīng)用。它檢測的特點而得到廣泛的應(yīng)用。它的特點是的特點是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)靈敏度高、經(jīng)濟(jì)； 但但MTTMTT法形成的法形成的FormazanFormazan為水不溶性的，需要加有機(jī)溶劑溶解，為水不溶性的，需要加有機(jī)溶劑溶解，由于在去

30、上清操作時會有可能帶走小部分的由于在去上清操作時會有可能帶走小部分的FormazanFormazan，故重復(fù)性，故重復(fù)性較差，對實驗結(jié)果的較差，對實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響?？梢酝ㄟ^增加實驗平行孔產(chǎn)生影響?？梢酝ㄟ^增加實驗平行孔來提高重復(fù)性；來提高重復(fù)性； 為了解決這個問題，研究人員又開發(fā)了很多種水溶性的四氮唑為了解決這個問題，研究人員又開發(fā)了很多種水溶性的四氮唑鹽類：如鹽類：如MTSMTS、XTTXTT、CCK-8CCK-8（WST-8WST-8）等。）等。 觀察待測細(xì)胞的狀態(tài)觀察待測細(xì)胞的狀態(tài)領(lǐng)取待測細(xì)胞，光鏡下進(jìn)行觀察細(xì)胞狀態(tài)；領(lǐng)取待測細(xì)胞，光鏡下進(jìn)行觀察細(xì)胞狀態(tài)；每孔加入每孔加入1

31、5 l MTT空白對照空白對照藥物濃度從高到低藥物濃度從高到低（終濃度（終濃度600, 300, 150, 75, 0 ng/ml）細(xì)胞凋亡的檢測細(xì)胞凋亡的檢測針對凋亡不同階段特征的檢測方法針對凋亡不同階段特征的檢測方法 1 早期檢測早期檢測 PS(磷脂酰絲氨酸)在細(xì)胞外膜上的檢測 細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測 細(xì)胞色素C的定位檢測 線粒體膜電位變化的檢測2 晚期檢測晚期檢測 TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase- mediated dUTP nick-end-labeling） LM-PCR Ladder (連接介導(dǎo)的PCR檢測) Telem

32、erase Detection (端粒酶檢測) 3mRNA水平的檢測水平的檢測 針對不同位置的凋亡特征的檢測方法針對不同位置的凋亡特征的檢測方法 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)形態(tài)學(xué)檢測方法 凋亡細(xì)胞的光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡觀察 凋亡細(xì)胞的熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡觀察 凋亡細(xì)胞的電子顯微鏡觀察細(xì)胞膜細(xì)胞膜相關(guān)凋亡檢測線粒體線粒體相關(guān)凋亡檢測胞漿蛋白胞漿蛋白相關(guān)凋亡檢測 Caspase(半胱天冬氨酸酶)活性檢測 凋亡相關(guān)的非Caspase蛋白酶檢測 胞漿其他蛋白活性檢測細(xì)胞核細(xì)胞核相關(guān)凋亡檢測其他細(xì)胞凋亡的檢測方法簡述細(xì)胞凋亡的檢測方法簡述 一、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測一、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測 二、磷脂酰

33、絲氨酸外翻分析（二、磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin VAnnexin V法）法） 三、三、 DNADNA片斷化檢測片斷化檢測 四、四、 TUNELTUNEL法法 五、五、 Caspase-3Caspase-3活性的檢測活性的檢測 六、六、 WBWB檢測檢測 光鏡下觀察光鏡下觀察凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)人肺癌細(xì)凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞株胞株A549A549發(fā)生凋亡發(fā)生凋亡1Control 藥物刺激藥物刺激 電鏡觀察電鏡觀察Hoechst 33258 staining of A549 cells 1Nuclear morphological changes of HeLa cells in apopt

34、osis process （488nm 400）AO/EB雙熒光染色的(U251細(xì)胞(40) A.正?；罴?xì)胞；B.早期凋亡細(xì)胞； C.晚期凋亡細(xì)胞；D.壞死細(xì)胞 12Apoptotic HeLa cells were stained with FITC-AnnexinV+PIAnnexin V-FITC FluorescencePI Fluorescence Time course of apoptosis in TF-1 cells cultured in GM-CSF-free mediumDNA片段化分析345細(xì)胞表型實驗簡介細(xì)胞表型實驗簡介實驗原理細(xì)胞發(fā)生凋亡時，細(xì)胞膜的通透性有所增加

35、。Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，能進(jìn)入正常細(xì)胞膜而對細(xì)胞沒有太大的細(xì)胞毒作用，并且Hoechst 33342在凋亡細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度要比正常細(xì)胞中高，因此利用Hoechst33342進(jìn)行標(biāo)記，就可將正常細(xì)胞與凋亡細(xì)胞區(qū)分開來。 實驗步驟實驗步驟無需無菌操作無需無菌操作 （1）Hela細(xì)胞貼壁生長于1640培養(yǎng)液中含10%胎牛血清，置37 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。（2）去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入不同濃度的凋亡誘導(dǎo)劑繼續(xù)培養(yǎng)6小時，鏡 下觀察。（3）固定固定 吸棄培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛（100l ）, 室溫固定至少10min（4）洗滌洗滌 吸棄固定液，150l 1PBS室溫洗滌一次，

36、5min后吸棄（5）染色染色 細(xì)胞中加入稀釋好的50l Hoechst 33342染液，37避光孵育 15min（6）顯微鏡觀察顯微鏡觀察 吸棄染色液，150l 1PBS室溫洗滌一次，置熒光顯微鏡下觀察（紫 外光激發(fā)，發(fā)藍(lán)色熒光）操作要點操作中若染液接觸到皮膚應(yīng)立即用清水沖洗干凈；染料的孵育時間染料的孵育時間：用Hoechst33342染料與細(xì)胞孵育的時間不宜過長，一般控制在20分鐘之內(nèi)為宜。若太長，可引起Hoechst33342的發(fā)射譜由藍(lán)光向紅光遷移，導(dǎo)致紅色熒光與藍(lán)色熒光比例改變，從而影響結(jié)果的判斷。觀察：Hela細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征15:00-15:10凋亡小體凋亡小體?是否存在濃度依

37、賴性是否存在濃度依賴性?實驗步驟3）固定）固定 吸棄培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛（ 100l ）, 室溫固定10min4）洗滌）洗滌 吸棄固定液，每孔添加150l 1PBS，室溫洗滌一次，輕晃后放置5min，5）染色）染色 吸棄洗滌液，細(xì)胞中加入稀釋好的50l Hoechst 33342染液，輕晃后37避光孵育15min6）顯微鏡觀察）顯微鏡觀察 吸棄染液，PBS洗滌一次，150l 1PBS室溫洗滌一次，置熒光顯微鏡下觀察15:10-15:40正常細(xì)胞胞核為Hoechst均勻藍(lán)色，濃染或成顆粒狀為凋亡陽性15:401. 細(xì)胞以細(xì)胞以2105/ml細(xì)胞數(shù)接種于細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中，每孔孔板中，每孔

38、100l，另以不加細(xì)胞只加培，另以不加細(xì)胞只加培養(yǎng)基作為空白對照。按照實驗需要，進(jìn)行培養(yǎng)并給予特定的藥物刺激（具體養(yǎng)基作為空白對照。按照實驗需要，進(jìn)行培養(yǎng)并給予特定的藥物刺激（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。每個濃度每個時點均設(shè)平行孔及陰性對照和空白對照；每個濃度每個時點均設(shè)平行孔及陰性對照和空白對照；2. 藥物刺激結(jié)束后，在藥物刺激結(jié)束后，在96孔板中每孔加孔板中每孔加MTT溶液（溶液（5mg/ml用用PBS配制配制)20 l，繼續(xù)孵育繼續(xù)孵育4小時；小時；3. 終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)

39、培養(yǎng)上清液。每孔加終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150 l DMSO，脫色搖床振蕩，脫色搖床振蕩10min，使結(jié)晶物充分融解；，使結(jié)晶物充分融解；（鏡下觀察結(jié)晶）（鏡下觀察結(jié)晶）4. 比色：選擇比色：選擇490nm（570nm）波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值。）波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值。5. 結(jié)果分析：結(jié)果分析： 用以下公式計算細(xì)胞存活率用以下公式計算細(xì)胞存活率. 細(xì)胞存活率細(xì)胞存活率 = (實驗組實驗組A值值/對照組對照組A值值)100% 以藥物濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線以藥物濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線MTT細(xì)胞增殖檢測步驟15:40-16:20細(xì)胞生存曲線細(xì)胞生存曲線