生物化學(xué)：第八章 基因重組與分子生物學(xué)技術(shù)

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1、 基因工程誕生的技術(shù)突破 n限制性內(nèi)切酶（restriction enzymes）n1970年H.O.Smith等分離出第一種限制性核酸內(nèi)切酶。Werner Arber 理論預(yù)見限制酶理論預(yù)見限制酶Daniel Nathans 用限制酶切得用限制酶切得SV40 DNA片斷片斷Hamilton O.Smith 得到第一個(gè)限制酶得到第一個(gè)限制酶1978年年Nobel生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)可以識(shí)別DNA的特異序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA，被稱為基因工程的手術(shù)刀基因工程的手術(shù)刀，廣泛使用。已發(fā)現(xiàn)多種細(xì)菌都含有這類限制修飾酶體系。作用作用與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌

2、的限制修飾系統(tǒng)，限制外源飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身保護(hù)自身DNA。分類分類、（基因工程技術(shù)中常用（基因工程技術(shù)中常用型）型）類酶識(shí)別序列特點(diǎn)類酶識(shí)別序列特點(diǎn) 回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)(palindrome)切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)：II類限制內(nèi)切酶要求嚴(yán)格的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，大部分II類酶識(shí)別DNA中4-8bp具有反轉(zhuǎn)對(duì)稱的序列。產(chǎn)生產(chǎn)生5突出粘性末端突出粘性末端(cohesive end):以以EcoR I為例：為例：5GAATT C3 5G OH pTTAAC33C TTAAG5 3 CTTAA p OH G5 產(chǎn)生產(chǎn)生3突出的粘性末端：突出的粘性末端

3、：以以Pst為例：為例：5CTGCAG3 5CTGCAOH-pG33GACGTC5 3Gp-OHACGTC5 產(chǎn)生平末端產(chǎn)生平末端(blunt end):Nru 為例：為例：5GTTAAC3 5GTTOH-pAAC33CAATTG5 3CAAp-OHTTG5限制性核酸內(nèi)切酶的種類很多，至今已發(fā)現(xiàn)近限制性核酸內(nèi)切酶的種類很多，至今已發(fā)現(xiàn)近1800多種，可根據(jù)它們對(duì)多種，可根據(jù)它們對(duì)DNA有不同的識(shí)別序列有不同的識(shí)別序列和切割特征選用，從而為基因工程提供有力工具。和切割特征選用，從而為基因工程提供有力工具。限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease)在重組DNA技術(shù)中有重要

4、地位配伍末端：配伍末端：識(shí)別序列不同，但切割識(shí)別序列不同，但切割DNA后產(chǎn)生相同后產(chǎn)生相同類型的粘性末端。類型的粘性末端?；蚬こ滩僮鞑襟E基因工程操作步驟 一、目的基因的獲得一、目的基因的獲得目的基因的篩選和分離可采用以下方法進(jìn)行：目的基因的篩選和分離可采用以下方法進(jìn)行：1直接從基因組直接從基因組DNA中分離：中分離：基因是包含了生物體某種蛋白質(zhì)或RNA的完整遺傳信息的一段特定的基因組DNA的核苷酸序列。原核生物原核生物-從基因組中直接分離得到目的基因；真核生物真核生物-可用限制性內(nèi)切酶將基因組DNA作不完全酶解，或超聲波等機(jī)械法切割，將整個(gè)基因組DNA轉(zhuǎn)變?yōu)樵S多較小的片段，經(jīng)梯度離心或電泳回

5、收適合于插入載體的片段構(gòu)建基因文庫(kù) 將這些片段與克隆載體拼接成重組DNA分子，繼而轉(zhuǎn)入受體菌擴(kuò)增，使每個(gè)細(xì)菌內(nèi)都攜帶一種重組DNA分子的多個(gè)拷貝。這樣由某種克隆載體攜帶的所有基因組DNA的集合稱為基因組基因組DNA文庫(kù)文庫(kù)。建立基因組文庫(kù)后，采用適當(dāng)?shù)暮Y選方法可從中選篩出含有感興趣基因的菌株，再進(jìn)行擴(kuò)增，將重組DNA分離、回收、以獲得目的基因克隆。基因組文庫(kù)的制作基因組文庫(kù)的制作2化學(xué)合成法化學(xué)合成法n根據(jù)已知多肽鏈的氨基酸順序，利用遺傳密碼表推定其核苷酸順序再進(jìn)行人工合成。適應(yīng)于編碼小分子多肽的基因。n對(duì)于特別長(zhǎng)的基因，可以分成幾段合成，然后連接在一起。3.從從cDNA文庫(kù)中篩選文庫(kù)中篩選n

6、采用一定的方法獲取特定基因的mRNA，再通過逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成其互補(bǔ)DNA（cDNA），除去RNA鏈后，再用DNA聚合酶合成其互補(bǔ)DNA鏈，從而得到雙鏈DNA。這樣得到的一套DNA片段的克隆稱為cDNA文庫(kù)。該文庫(kù)包含細(xì)胞表達(dá)的各種mRNA信息。采用標(biāo)記的目的基因探針，從cDNA文庫(kù)中就可直接篩選到連續(xù)編碼的目的基因，可用于生產(chǎn)某些蛋白質(zhì)。n將某一種基因?qū)⒛骋环N基因DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖袛嘤眠m當(dāng)?shù)南拗泼盖袛嗪?，與載體后，與載體DNA重組，再全部轉(zhuǎn)化宿主重組，再全部轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到含全部基因組細(xì)胞，得到含全部基因組DNA的種群，的種群，稱為稱為G文庫(kù)文庫(kù)(genomic DNA library)

7、。n將某種細(xì)胞的全部將某種細(xì)胞的全部mRNA通過逆轉(zhuǎn)合成通過逆轉(zhuǎn)合成cDNA，然后轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到含全部，然后轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到含全部表達(dá)基因的種群，稱為表達(dá)基因的種群，稱為C-文庫(kù)文庫(kù)(cDNA library)。4利用利用PCR合成合成nPCRPCR是一種在體外利是一種在體外利用酶促反應(yīng)簡(jiǎn)便迅用酶促反應(yīng)簡(jiǎn)便迅速擴(kuò)增特異序列的速擴(kuò)增特異序列的基因組基因組DNADNA或或cDNAcDNA的的專門技術(shù)。如果知專門技術(shù)。如果知道待擴(kuò)增目的基因道待擴(kuò)增目的基因片段兩側(cè)或附近的片段兩側(cè)或附近的DNADNA序列，據(jù)此合成序列，據(jù)此合成互補(bǔ)引物，可進(jìn)行互補(bǔ)引物，可進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。目的基因擴(kuò)增。n可以直

8、接從染色體DNA擴(kuò)增，也可用RNA為起始模板，稱反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）。其基本過程為：分離、純化mRNA，利用反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈cDNA；雜合雙鏈中的RNA用堿或RNaseH消化，剩下的cDNA為模板，由DNA聚合酶催化合成雙鏈cDNA。應(yīng)用PCR技術(shù)可把極微量生物材料中的DNA擴(kuò)增至足夠使用量。二、基因載體的選擇和構(gòu)建二、基因載體的選擇和構(gòu)建n有多種限制性內(nèi)切酶的單一酶切位點(diǎn)以便外源基因插入；n本身的分子量不宜太大，可容納較大的外源DNA片段，拷貝數(shù)高、易與宿主DNA分離；n在宿主細(xì)胞中能獨(dú)立地自我復(fù)制，并在傳代時(shí)穩(wěn)定地保存；n有遺傳標(biāo)記可用于重組體的篩選。n此外，對(duì)克隆表達(dá)載體需

9、要在載體的克隆位點(diǎn)上游加上強(qiáng)啟動(dòng)子序列，下游加上終止密碼子等，使載體不至于失去控制。三、目的基因和載體的連接（切、接）三、目的基因和載體的連接（切、接）n通常采用通常采用限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease)，簡(jiǎn)稱限制酶，分別對(duì)載體，簡(jiǎn)稱限制酶，分別對(duì)載體DNA和目的基因進(jìn)行切斷，以便于重組。和目的基因進(jìn)行切斷，以便于重組。n限制酶目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)限制酶目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)400多種，所識(shí)別的順序多種，所識(shí)別的順序往往為往往為4-8個(gè)堿基對(duì)，且有個(gè)堿基對(duì)，且有回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)。n由限制酶切斷后的末端可形成由限制酶切斷后的末端可形成平端、平端、3-突出突出粘性末

10、端和粘性末端和5-突出粘性末端突出粘性末端三種情況。形成三種情況。形成粘性末端粘性末端(cohesive end)者較有利于載體者較有利于載體DNA和目的基因的重組。和目的基因的重組。載體和目的基因的重組載體和目的基因的重組n即將帶有切口的載體與所獲得的目的基因連接起即將帶有切口的載體與所獲得的目的基因連接起來，得到重新組合后的來，得到重新組合后的DNA分子。分子。DNA連接酶有兩種：連接酶有兩種：T4 DNA連接酶，是從噬菌連接酶，是從噬菌體體T4感染的大腸埃希菌中分離純化獲得的；大感染的大腸埃希菌中分離純化獲得的；大腸埃希菌腸埃希菌DNA連接酶，是直接從大腸埃希菌中分連接酶，是直接從大腸埃

11、希菌中分離純化的連接酶。離純化的連接酶。（一）黏性末端連接法及平端連接：（一）黏性末端連接法及平端連接：n當(dāng)載體當(dāng)載體DNA和目的基因均用同一或兩種限制酶進(jìn)和目的基因均用同一或兩種限制酶進(jìn)行切斷時(shí)，二者即可帶有相同的粘性末端。由于行切斷時(shí)，二者即可帶有相同的粘性末端。由于黏性末端的單鏈間堿基配對(duì)，退火后兩者互補(bǔ)黏黏性末端的單鏈間堿基配對(duì)，退火后兩者互補(bǔ)黏合，再加入合，再加入DNA連接酶，即可封閉其缺口，得到連接酶，即可封閉其缺口，得到重組體。重組體。n較少的情況下，對(duì)產(chǎn)生的平端也可直接進(jìn)行連接。較少的情況下，對(duì)產(chǎn)生的平端也可直接進(jìn)行連接。載體載體DNA與目的基因的連接與目的基因的連接（二）同聚

12、物加尾法（二）同聚物加尾法n即同聚物加尾連接法。當(dāng)載體和目的基因無法采即同聚物加尾連接法。當(dāng)載體和目的基因無法采用同一種限制酶進(jìn)行切斷，無法得到相同得黏性用同一種限制酶進(jìn)行切斷，無法得到相同得黏性末端時(shí)，可采用此方法。末端時(shí)，可采用此方法。n此法首先使用單鏈核酸酶將粘性末端切平，再在此法首先使用單鏈核酸酶將粘性末端切平，再在末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下，分別在目的基因和末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下，分別在目的基因和載體載體DNA 3-OHDNA 3-OH末端加上同聚核苷酸如末端加上同聚核苷酸如A A或或T T，制，制造出相互配對(duì)的黏性末端，用連接酶連接。造出相互配對(duì)的黏性末端，用連接酶連接。（三）人工

13、接頭法（三）人工接頭法n人工接頭是含有人工接頭是含有1 12 2種限制酶切位點(diǎn)的種限制酶切位點(diǎn)的人工合成的寡核苷酸鏈。將人工接頭磷人工合成的寡核苷酸鏈。將人工接頭磷酸化后連接到目的基因或載體酸化后連接到目的基因或載體DNADNA平端，平端，使之引入新的酶切位點(diǎn)，連上接頭后，使之引入新的酶切位點(diǎn)，連上接頭后，再用相應(yīng)的限制酶切割及連接黏性末端。再用相應(yīng)的限制酶切割及連接黏性末端。四、重組四、重組DNADNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)）分子導(dǎo)入受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)）n重組重組DNA需導(dǎo)入宿主細(xì)胞才能進(jìn)行增殖或需導(dǎo)入宿主細(xì)胞才能進(jìn)行增殖或表 達(dá)。重 組 質(zhì) 粒 可 通 過表 達(dá)。重 組 質(zhì) 粒 可 通 過 轉(zhuǎn) 化

14、轉(zhuǎn) 化（transformation）方式導(dǎo)入宿主細(xì)胞，）方式導(dǎo)入宿主細(xì)胞，即將大腸桿菌用即將大腸桿菌用CaCl2處理，增加細(xì)菌細(xì)胞處理，增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性，再與重組質(zhì)粒壁的通透性，再與重組質(zhì)粒DNA短暫溫育，短暫溫育，質(zhì)粒質(zhì)粒DNA即可導(dǎo)入宿主細(xì)胞。即可導(dǎo)入宿主細(xì)胞。n如果是用如果是用噬菌體作為載體的重組體，則噬菌體作為載體的重組體，則需要用外殼蛋白進(jìn)行包裝，使之成為具需要用外殼蛋白進(jìn)行包裝，使之成為具有感染能力的噬菌體，再通 過有感染能力的噬菌體，再通 過 轉(zhuǎn) 染轉(zhuǎn) 染(transfection)方式將重組噬菌體方式將重組噬菌體DNA導(dǎo)入大腸桿菌等宿主細(xì)胞。導(dǎo)入大腸桿菌等宿主細(xì)胞。n近

15、年來發(fā)展的將重組近年來發(fā)展的將重組DNADNA分子導(dǎo)入哺乳動(dòng)分子導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法包括利用脂質(zhì)體包裝重組物細(xì)胞的方法包括利用脂質(zhì)體包裝重組DNADNA，效率高且不損傷受體細(xì)胞；，效率高且不損傷受體細(xì)胞；n電穿孔電穿孔DNADNA轉(zhuǎn)染技術(shù)；轉(zhuǎn)染技術(shù)；nDNA-DNA-磷酸鈣沉淀法；磷酸鈣沉淀法；n基因顯微注射技術(shù)等?；蝻@微注射技術(shù)等。五、重組五、重組DNA的篩選（篩）的篩選（篩）n重組體的篩選是指從大量的菌落或菌斑中選擇和重組體的篩選是指從大量的菌落或菌斑中選擇和鑒定出含有目的基因的陽性菌株。分為直接選擇鑒定出含有目的基因的陽性菌株。分為直接選擇法和非直接選擇法：法和非直接選擇法：（一）（

16、一）直接選擇法直接選擇法n針對(duì)載體攜帶某種或某些標(biāo)志基因和目的基因而設(shè)計(jì)的篩選方法，其特點(diǎn)是直接測(cè)定基因或基因表型。n如果重組質(zhì)粒攜帶有某種抗藥性標(biāo)志基因，如如果重組質(zhì)粒攜帶有某種抗藥性標(biāo)志基因，如ampr，只有含這種抗藥性基因轉(zhuǎn)化的細(xì)菌才能，只有含這種抗藥性基因轉(zhuǎn)化的細(xì)菌才能在含有該抗生素的培養(yǎng)板上生存并形成菌落。在含有該抗生素的培養(yǎng)板上生存并形成菌落。n對(duì)于帶有抗藥基因的質(zhì)粒重組體，可采用對(duì)于帶有抗藥基因的質(zhì)粒重組體，可采用插入滅插入滅活法活法進(jìn)行篩選。如進(jìn)行篩選。如pBR322中帶有抗氨芐青霉素中帶有抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素基因，當(dāng)將目的基因插入抗四環(huán)素基和抗四環(huán)素基因，當(dāng)將目的基因插入抗

17、四環(huán)素基因后，就可引起該基因失活，細(xì)菌對(duì)氨芐青霉素因后，就可引起該基因失活，細(xì)菌對(duì)氨芐青霉素耐藥，而對(duì)四環(huán)素敏感。在含氨芐青霉素的培養(yǎng)耐藥，而對(duì)四環(huán)素敏感。在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上能夠生長(zhǎng)，而在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上不能生基上能夠生長(zhǎng)，而在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)的細(xì)菌即為帶重組體的細(xì)菌。長(zhǎng)的細(xì)菌即為帶重組體的細(xì)菌。1.抗藥性標(biāo)志選擇(插入失活法插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇抗藥性標(biāo)記選擇目目 錄錄氨芐青霉素抗性基因氨芐青霉素抗性基因四環(huán)素抗性基因四環(huán)素抗性基因n當(dāng)宿主細(xì)胞存在某種基因及其表達(dá)產(chǎn)物當(dāng)宿主細(xì)胞存在某種基因及其表達(dá)產(chǎn)物的缺陷時(shí)，可采用此方法篩選重組體。的缺陷時(shí)，可采用此方法篩選重組體。轉(zhuǎn)

18、化或轉(zhuǎn)染的外源基因表達(dá)產(chǎn)物可彌補(bǔ)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的外源基因表達(dá)產(chǎn)物可彌補(bǔ)基因缺陷性宿主菌的性狀，可以利用營(yíng)基因缺陷性宿主菌的性狀，可以利用營(yíng)養(yǎng)突變菌株進(jìn)行篩選，即標(biāo)志補(bǔ)救。養(yǎng)突變菌株進(jìn)行篩選，即標(biāo)志補(bǔ)救。2.標(biāo)志補(bǔ)救 pUC18/19質(zhì)粒是以質(zhì)粒是以pBR322為基礎(chǔ)改造的為基礎(chǔ)改造的-半乳糖苷酶半乳糖苷酶的啟動(dòng)子及的啟動(dòng)子及鏈鏈的的DNA序列序列，作為篩，作為篩選標(biāo)志選標(biāo)志 突變型突變型lac E.coli可表達(dá)該酶的可表達(dá)該酶的片段（酶的片段（酶的C端區(qū)）。當(dāng)宿主和轉(zhuǎn)入載體同時(shí)端區(qū)）。當(dāng)宿主和轉(zhuǎn)入載體同時(shí)表達(dá)表達(dá)、兩個(gè)片段時(shí)兩個(gè)片段時(shí)，通過片段互補(bǔ)機(jī)制形成具有活性的，通過片段互補(bǔ)機(jī)制形成具有活性

19、的-半乳糖苷酶，可使半乳糖苷酶，可使人工底物人工底物X-gal轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色。轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色。nLac Z基因編碼的肽鏈與失去了正常氨基端的半乳糖苷酶突變體互補(bǔ)，這種現(xiàn)象稱為互補(bǔ)；n如果插入的外源基因是在載體lacZ 鏈基因內(nèi)，則會(huì)干擾lacZ的表達(dá)，利用lac E.coli為轉(zhuǎn)染或感染細(xì)胞，在含X-gal的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色菌落。這一現(xiàn)象可用于重組體篩選，又稱藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)。互互補(bǔ)補(bǔ)篩篩選選目目 錄錄U6U63.分子雜交法n用與外源DNA互補(bǔ)的核素標(biāo)記探針與重組子DNA進(jìn)行雜交篩選。將待測(cè)核酸樣品結(jié)合在硝酸纖維膜上，再與溶液中的標(biāo)記探針雜交。含有目的基因的重組DNA與探針結(jié)合，而被放射性核素標(biāo)記。

20、利用這種方法可以直接選擇并鑒定目的基因。n根據(jù)反應(yīng)條件的不同可以分為斑點(diǎn)雜交、Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、原位雜交等多種方式。原原位位雜雜交交目目 錄錄Southern印跡印跡目目 錄錄五、重組五、重組DNA的篩選（篩）的篩選（篩）（二）免疫學(xué)方法篩選（二）免疫學(xué)方法篩選這是利用特異抗體與目的基因的表達(dá)產(chǎn)物（作為抗原）之間相互作用進(jìn)行篩選，而不是直接去鑒定靶基因。免疫學(xué)方法又可分為酶免疫檢測(cè)分析、放射免疫方法等。放射免疫方法針對(duì)所要研究的蛋白質(zhì)預(yù)先制備其相應(yīng)的抗體，再用放射性核素標(biāo)記該抗體。將轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌落轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜上，加入標(biāo)記抗體進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，即可能得到顯示抗

21、體所結(jié)合的特異蛋白質(zhì)的區(qū)帶，從而選擇出產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的菌落。雞的雞的肌球蛋白的克隆和檢出肌球蛋白的克隆和檢出目目 錄錄放射性抗體檢測(cè)法放射性抗體檢測(cè)法 六、克隆基因表達(dá)六、克隆基因表達(dá)n基因工程的最終目標(biāo)是進(jìn)行目的基因的表達(dá)。克隆的目的基因在受體細(xì)胞表達(dá)生物活性蛋白質(zhì)需要正確的基因轉(zhuǎn)錄、有效的蛋白質(zhì)翻譯和適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄、翻譯后加工的過程。n分為原核表達(dá)體系和真核表達(dá)體系。分為原核表達(dá)體系和真核表達(dá)體系。運(yùn)用E.coli表達(dá)有用的蛋白質(zhì)必須使構(gòu)建的表達(dá)載體符合下述標(biāo)準(zhǔn)：含E.coli適宜的選擇標(biāo)志；具有能調(diào)控轉(zhuǎn)錄、產(chǎn)生大量mRNA的強(qiáng)啟動(dòng)子，要表達(dá)的外源基因編碼區(qū)不能含有插入序列，外源基因位于啟動(dòng)子下

22、游；含適當(dāng)?shù)姆g調(diào)控序列，如核糖體結(jié)合位點(diǎn)和翻譯起始點(diǎn)等；含有設(shè)計(jì)合理的，以確保目的基因按一定方向與載體正確銜接。（一）原核表達(dá)體系（一）原核表達(dá)體系n由于原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后加工體系的不同，用原核表達(dá)體系表達(dá)真核蛋白質(zhì)時(shí)存在一些不足之處。n例如由于缺乏適當(dāng)?shù)姆g后加工機(jī)制，E.coli表達(dá)體系表達(dá)的真核蛋白質(zhì)不能形成適當(dāng)?shù)恼郫B或進(jìn)行糖基化修飾。因此，在實(shí)際操作中應(yīng)充分考慮這些差別。真核表達(dá)體系如酵母、昆蟲及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系，具有許多優(yōu)點(diǎn)：該體系能識(shí)別和除去外源基因的內(nèi)含子，剪接加工成成熟的mRNA；該體系表達(dá)的蛋白在翻譯后加工的機(jī)會(huì)較多（如糖基化修飾），可提高產(chǎn)品的生物

23、學(xué)活性及免疫活性；用作受體的動(dòng)物細(xì)胞，都是用缺陷的病毒基因組如SV40等轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，能穩(wěn)定傳代；使經(jīng)轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞將表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，其提純工藝簡(jiǎn)單。（二）真核表達(dá)體系（二）真核表達(dá)體系n但操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、不經(jīng)濟(jì)是哺乳類動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系的缺點(diǎn)。如何將克隆的重組DNA分子導(dǎo)入真核細(xì)胞是關(guān)鍵步驟。常用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法有：磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及顯微注射等。1.什么是基因重組技術(shù)？它包含那些內(nèi)容？2.列舉常用的基因工程工具酶的特性和用途。3.敘述常用的基因工程載體的種類、特點(diǎn)和用途。4.怎樣獲得目的基因或核酸序列的克隆？有那些 方法？要經(jīng)過那些基本步驟？5

24、.怎樣能在大腸桿菌中獲得真核基因的表達(dá)產(chǎn)物？第三節(jié)第三節(jié) 分子生物學(xué)常用技術(shù)分子生物學(xué)常用技術(shù) 一、核酸分子雜交與探針技術(shù)一、核酸分子雜交與探針技術(shù)（一）分子雜交（一）分子雜交n把異源的把異源的DNADNA分子，或者分子，或者DNADNA與與RNARNA放在一起，加熱放在一起，加熱使使DNADNA分子解開成單鏈后，在緩慢降溫復(fù)性過程中，分子解開成單鏈后，在緩慢降溫復(fù)性過程中，只要只要DNADNA或或RNARNA的單鏈分子之間存在著一定程度的堿的單鏈分子之間存在著一定程度的堿基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子間形成，這種現(xiàn)基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子間形成，這種現(xiàn)象稱為象稱為核酸分子雜交核酸分子雜

25、交（nucleic acid molecular hybridization）。）。核酸分子雜交主要應(yīng)用于：n對(duì)特定DNA或RNA順序進(jìn)行定性和定量檢測(cè)；n測(cè)定特定DNA序列的限制性內(nèi)切酶圖譜，以判斷是否存在DNA序列缺失、插入等重排現(xiàn)象；nRNA結(jié)構(gòu)的初步分析；n特定基因克隆的篩選；n用末端標(biāo)記人工合成寡核苷酸探針檢查基因的特定點(diǎn)突變。（二）探針技術(shù)（二）探針技術(shù)n經(jīng)過特殊標(biāo)記的核酸片段，它具有特定經(jīng)過特殊標(biāo)記的核酸片段，它具有特定的序列，能夠與待測(cè)的核酸片段互補(bǔ)結(jié)的序列，能夠與待測(cè)的核酸片段互補(bǔ)結(jié)合，在研究和診斷中用于檢測(cè)核酸樣品合，在研究和診斷中用于檢測(cè)核酸樣品中特定的基因。探針可以是人

26、工合成的中特定的基因。探針可以是人工合成的寡核苷酸片段，也可以是寡核苷酸片段，也可以是DNADNA、cDNAcDNA或或RNARNA片段。常用放射性核素、生物素或熒片段。常用放射性核素、生物素或熒光染料來標(biāo)記探針。光染料來標(biāo)記探針。n進(jìn)行核酸檢測(cè)時(shí)，使待測(cè)核酸變性，成兩條單鏈，變性DNA固定于支持物上，與含有標(biāo)記探針溶液共溫浴進(jìn)行雜交，在堿基配對(duì)的前提下，探針與具有互補(bǔ)序列的DNA片段結(jié)合，使雜交鏈顯示識(shí)別標(biāo)記，而被檢測(cè)確定，以此確定待測(cè)核酸是否與探針的序列具有同源性，從而達(dá)到鑒定靶核酸性質(zhì)的目的。探針還可以用于基因工程中陽性克隆的篩選，遺傳病的產(chǎn)前診斷，腫瘤的分子診斷、分類、分型和預(yù)后以及傳

27、染性流行病病原體的檢測(cè)等。二、二、分子印跡技術(shù)n20世紀(jì)70年代后期出現(xiàn)的分子檢測(cè)技術(shù)，是指將分離的生物大分子如核酸、蛋白質(zhì)等轉(zhuǎn)移到固相支持物并加以檢測(cè)分析的技術(shù)，這個(gè)過程類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為“blotting”。目前這種技術(shù)廣泛應(yīng)用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原、受體糖蛋白等多種生物大分子的研究。n印跡法基本過程包括：生物樣品凝膠電泳分離、分離后的樣品轉(zhuǎn)移到固相支持物上、檢測(cè)分析等三大部分組成。分子印跡技術(shù)的種類分子印跡技術(shù)的種類（一）（一）DNA印跡技術(shù)：印跡技術(shù)：n又稱為又稱為Southern雜交，即雜交，即DNA-DNA雜交分析。雜交分析。（二）（二）RNA印跡技

28、術(shù)：印跡技術(shù)：n又稱為又稱為Northern雜交，即雜交，即RNA-DNA雜交分析。雜交分析。（三）蛋白質(zhì)印跡技術(shù)：（三）蛋白質(zhì)印跡技術(shù)：n又稱為又稱為Western雜交，或免疫印跡技術(shù)，即利用雜交，或免疫印跡技術(shù)，即利用抗原抗原-抗體反應(yīng)，檢測(cè)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上的特抗體反應(yīng)，檢測(cè)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上的特異性蛋白質(zhì)。異性蛋白質(zhì)。是由Edwen Southern 1975年創(chuàng)立，進(jìn)行DNA片段的檢測(cè)，被稱為Southern blotting，即DNA印跡。其基本過程是用某種限制性內(nèi)切酶消化靶DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，放入堿性溶液中使DNA變性，然后將變性的單鏈DNA從凝膠中按原來的位置和順序

29、經(jīng)過一定的方法吸印轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）薄膜上，固定后再與標(biāo)記的核酸探針雜交，并顯示雜交信號(hào)。DNA印跡技術(shù)主要用于基因組中特異基因的定位與檢測(cè)等。還可用于分析重組質(zhì)粒和噬菌體。（一）（一）DNA印跡技術(shù)n又稱為Northern blotting。其基本過程與Southern印跡技術(shù)相同，先用乙二醛等變性劑處理RNA，消除RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，然后采用合適的條件凝膠電泳，再將RNA轉(zhuǎn)移到NC膜上，固定后就可進(jìn)行雜交顯影。nRNA印跡技術(shù)目前主要用于檢測(cè)某一組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA的表達(dá)水平，也可以比較不同組織和細(xì)胞中的同一基因的表達(dá)情況，被認(rèn)為是目前最可靠的m

30、RNA水平分析方法之一。（二）（二）RNA印跡技術(shù)n蛋白質(zhì)在電泳之后也可以固定于膜上，再與溶液中的其他蛋白分子相互結(jié)合，目的蛋白最常用的是用抗體來檢測(cè)，因此也稱為，也被稱為Western bloting（蛋白質(zhì)印跡）。n蛋白質(zhì)印跡技術(shù)用于檢測(cè)樣品中特異性蛋白質(zhì)的存在，細(xì)胞中特異蛋白質(zhì)的半定量分析以及蛋白質(zhì)的相互作用的研究。（三）（三）蛋白質(zhì)的印跡分析n將樣品蛋白質(zhì)用聚丙烯酰胺凝膠電泳按分子量大小分開，用電轉(zhuǎn)移方法定向?qū)⒌鞍踪|(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜或其他膜上。印跡在膜上的特異抗原的檢出依賴于抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)。反應(yīng)時(shí)能與特異性一抗結(jié)合的二抗常用辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、熒光素或放射性核素標(biāo)記，后者催化某

31、些底物反應(yīng)后產(chǎn)生示蹤信號(hào)，能通過放射自顯影、底物顯色或化學(xué)發(fā)光X片顯影來檢測(cè)蛋白區(qū)帶的信號(hào)，找出能和抗體特異性結(jié)合的抗原蛋白。三、三、PCR技術(shù)技術(shù)（一）（一）PCR的概念的概念nPCR(polymerase chain reaction)即即聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，是指利用耐熱，是指利用耐熱DNA聚合酶的反復(fù)作用，通過變性聚合酶的反復(fù)作用，通過變性-延伸延伸-復(fù)復(fù)性的循環(huán)操作，在體外迅速將性的循環(huán)操作，在體外迅速將DNA模板模板擴(kuò)增數(shù)百萬倍的一種操作技術(shù)。擴(kuò)增數(shù)百萬倍的一種操作技術(shù)。n理論上可在理論上可在2小時(shí)內(nèi)將一個(gè)小時(shí)內(nèi)將一個(gè)DNA分子擴(kuò)分子擴(kuò)增到增到106109倍，從而大大提

32、高了對(duì)其倍，從而大大提高了對(duì)其進(jìn)行分析研究的速度。進(jìn)行分析研究的速度。PCRPCR技術(shù)的創(chuàng)建技術(shù)的創(chuàng)建一、最初的理論描述一、最初的理論描述KhoranaKhorana Khorana(1971)Khorana(1971)等最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)等最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：想：“經(jīng)經(jīng)DNADNA變性，與合適的引物雜交，用變性，與合適的引物雜交，用DNADNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可合成聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可合成tRNAtRNA基因?；??！钡捎诋?dāng)時(shí)基因序列分析方法尚未成熟，熱穩(wěn)但由于當(dāng)時(shí)基因序列分析方法尚未成熟，熱穩(wěn)定定DNADNA聚合酶尚未報(bào)道以及引物合成的困難

33、，聚合酶尚未報(bào)道以及引物合成的困難，這種想法似乎沒有實(shí)際意義。加上這種想法似乎沒有實(shí)際意義。加上7070年代初分年代初分子克隆技術(shù)的出現(xiàn)提供了一種克隆和擴(kuò)增基因子克隆技術(shù)的出現(xiàn)提供了一種克隆和擴(kuò)增基因的途徑，所以，的途徑，所以，KhoranaKhorana的設(shè)想被人們遺忘的設(shè)想被人們遺忘了了二、二、PCRPCR技術(shù)的發(fā)明技術(shù)的發(fā)明Kary MullisKary Mullis 19851985年，年，Kary MullisKary Mullis在在CetusCetus公司工作期間，公司工作期間，發(fā)明了發(fā)明了PCRPCR MullisMullis要合成要合成DNADNA引物來進(jìn)行測(cè)序工作，卻常引物

34、來進(jìn)行測(cè)序工作，卻常為沒有足夠多的模板為沒有足夠多的模板DNADNA而煩惱而煩惱 19831983年年4 4月的一個(gè)星期五晚上，他開車去鄉(xiāng)下月的一個(gè)星期五晚上，他開車去鄉(xiāng)下別墅的路上別墅的路上PCRPCR技術(shù)的創(chuàng)建技術(shù)的創(chuàng)建 PCR從構(gòu)想成為現(xiàn)實(shí) 1983年12月，Mullis用同位素標(biāo)記法看到了10個(gè)循環(huán)后的49 bp長(zhǎng)度的第一個(gè)PCR片斷；1985年10月25日申請(qǐng)了PCR的專利，1987年7月28日批準(zhǔn)（專利號(hào)4,683,202），Mullis是第一發(fā)明人；1985年12月20日在Science雜志上發(fā)表了第一篇PCR的學(xué)術(shù)論文，Mullis是共同作者；1986年5月，Mullis在冷泉

35、港實(shí)驗(yàn)室做專題報(bào)告，全世界從此開始學(xué)習(xí)PCR的方法。PCRPCR技術(shù)的創(chuàng)建技術(shù)的創(chuàng)建1983年5533XX55普通普通PCRPCR儀、梯度儀、梯度PCRPCR儀儀全新全新4 4通道實(shí)時(shí)熒光定量通道實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR儀儀 1988年第一臺(tái)PCR儀問世，PCR逐步實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化 1989年美國(guó)Science雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首，比喻1989年為PCR爆炸年。1993年，Mullis因此項(xiàng)技術(shù)榮獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCRPCR儀的變遷儀的變遷 三個(gè)水浴鍋，用手移動(dòng) （Mullis等人當(dāng)時(shí)用的）電加熱塊 自來水冷卻 （PE，1988）電加熱塊 內(nèi)置循環(huán)液冷卻 （PE，1989）三個(gè)加熱塊

36、 機(jī)械手 （Strategene，1994）半導(dǎo)體制冷和加熱（MJ,PE,BioMetra,Eppendorf）空氣加熱(Roche)梯度PCR儀,實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 Lab-on-chip式的PCR儀(芯片PCR)全新4通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀普通PCR儀、梯度PCR儀（一）（一）PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系PCR反應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)包括：反應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)包括：1耐熱耐熱DNA聚合酶（聚合酶（Taq酶）酶）這是由耐熱細(xì)菌體內(nèi)這是由耐熱細(xì)菌體內(nèi)提取的一種提取的一種DNA聚合酶，可保證在聚合酶，可保證在950C，30分鐘以分鐘以上不會(huì)變性失活。上不會(huì)變性失活。2模板模板DNA 即待分析的目的即待分析的目的DNA，其

37、長(zhǎng)度不宜大于，其長(zhǎng)度不宜大于10kb。3一對(duì)特異性引物一對(duì)特異性引物 為了保證為了保證DNA聚合酶能夠?qū)蓷l聚合酶能夠?qū)蓷l互補(bǔ)鏈均能進(jìn)行延伸，需要兩種引物，分別位于兩互補(bǔ)鏈均能進(jìn)行延伸，需要兩種引物，分別位于兩條互補(bǔ)模板條互補(bǔ)模板DNA鏈的鏈的3-端。端。4四種脫氧核糖核苷酸四種脫氧核糖核苷酸 4種種dNTP的終濃度相的終濃度相等等，用作底物的，用作底物的dNTPS。5緩沖溶液緩沖溶液 保證保證DNA聚合酶催化時(shí)所需的聚合酶催化時(shí)所需的適當(dāng)?shù)娜芤哼m當(dāng)?shù)娜芤簆H值，值，含有含有Mg2+的緩沖液的緩沖液。PCR反應(yīng)時(shí)，一般采用反應(yīng)時(shí)，一般采用變性變性-退火退火-延伸延伸三步循三步循環(huán)，也可采用環(huán)

38、，也可采用變性變性-延伸延伸兩步循環(huán)。兩步循環(huán)。1變性變性 通常將反應(yīng)系統(tǒng)加熱至通常將反應(yīng)系統(tǒng)加熱至9595，30306060秒，使模板秒，使模板DNADNA完全變性成為單鏈，并消完全變性成為單鏈，并消除引物自身和引物之間存在的局部雙鏈。除引物自身和引物之間存在的局部雙鏈。（二）（二）PCR反應(yīng)過程反應(yīng)過程2退火退火 通過降低反應(yīng)溫度至通過降低反應(yīng)溫度至55，使兩，使兩種引物能與兩條解開的種引物能與兩條解開的DNA互補(bǔ)鏈的互補(bǔ)鏈的3端黏合，以提供端黏合，以提供DNA聚合酶催化聚合所聚合酶催化聚合所需的需的3-OH。3延伸延伸 將反應(yīng)溫度提高到約將反應(yīng)溫度提高到約72，在耐，在耐熱熱DNA聚合酶

39、的催化下，根據(jù)模板聚合酶的催化下，根據(jù)模板DNA提供的堿基順序，合成兩條互補(bǔ)鏈，從提供的堿基順序，合成兩條互補(bǔ)鏈，從而使模板而使模板DNA擴(kuò)增一倍。擴(kuò)增一倍。n按照上述步驟重復(fù)操作約按照上述步驟重復(fù)操作約30次，即可將次，即可將模板模板DNA擴(kuò)增數(shù)百萬倍。擴(kuò)增數(shù)百萬倍。PCR的反應(yīng)原理的反應(yīng)原理（三）幾種常見的（三）幾種常見的PCR衍生技術(shù)衍生技術(shù)1.反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（技術(shù)（RT-PCR）是將RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)，原理是：提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下生成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表

40、達(dá)。RT-PCR使RNA檢測(cè)的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能，該技術(shù)是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因以及對(duì)已知序列的RNA進(jìn)行定性定量分析的有效方法。2.原位原位PCR技術(shù)技術(shù)原位PCR就是在組織細(xì)胞里進(jìn)行PCR反應(yīng)，它結(jié)合了具有細(xì)胞定位能力的原位雜交和高度特異敏感的PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。3.實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCR技術(shù)技術(shù)又稱為熒光定量PCR。該技術(shù)在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上運(yùn)用熒光能量傳遞技術(shù)，加入熒光標(biāo)記探針，使得在PCR反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光信號(hào)與PCR產(chǎn)物量成正比，對(duì)每一時(shí)刻的熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)分析，計(jì)算出PCR產(chǎn)物量，根據(jù)動(dòng)態(tài)變化數(shù)據(jù)，可以精確計(jì)算樣品中原有模板的含量。（四）（四）

41、PCR的主要用途的主要用途-分子克隆、基因分子克隆、基因診斷、腫瘤機(jī)制研究、法醫(yī)診斷、腫瘤機(jī)制研究、法醫(yī) 1.目的基因的克隆目的基因的克隆 PCR技術(shù)可用于快速方便地獲得目的基因，技術(shù)可用于快速方便地獲得目的基因，包括利用特異性引物以包括利用特異性引物以cDNA或基因組或基因組DNA為為模板獲得已知的目的基因片段；利用簡(jiǎn)并引物模板獲得已知的目的基因片段；利用簡(jiǎn)并引物從從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中獲得具有一定同文庫(kù)或基因組文庫(kù)中獲得具有一定同源性的基因片段；利用隨機(jī)引物從源性的基因片段；利用隨機(jī)引物從cDNA文庫(kù)文庫(kù)或基因組文庫(kù)中隨機(jī)克隆基因?；蚧蚪M文庫(kù)中隨機(jī)克隆基因。2.基因的體外突變基因的

42、體外突變 n利用利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)包含突變序技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)包含突變序列引物在體外進(jìn)行基因的嵌合、缺失、列引物在體外進(jìn)行基因的嵌合、缺失、點(diǎn)突變等改造。點(diǎn)突變等改造。3.DNA的微量分析的微量分析nPCR技術(shù)能快速敏感地?cái)U(kuò)增被測(cè)試的目技術(shù)能快速敏感地?cái)U(kuò)增被測(cè)試的目的基因，只需微量的基因，只需微量DNADNA模板，是模板，是DNADNA微量微量分析的最好方法。分析的最好方法。四、四、DNA序列分析技術(shù)序列分析技術(shù) nDNA堿基序列測(cè)定即堿基序列測(cè)定即DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，目前常用的方法為定，目前常用的方法為Maxam-Gilbert建立的建立的化學(xué)裂解法化學(xué)裂解法和和Sang

43、er建立的建立的雙脫雙脫氧末端終止法氧末端終止法。四、四、DNA序列分析技術(shù)序列分析技術(shù) nDNA堿基序列測(cè)定即堿基序列測(cè)定即DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，目前常用的方法為定，目前常用的方法為Maxam-Gilbert建立的建立的化學(xué)裂解法化學(xué)裂解法和和Sanger建立的建立的雙脫雙脫氧末端終止法氧末端終止法。nSanger在雙脫氧鏈終止法中獨(dú)創(chuàng)性地使用了特異引物，在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行延伸反應(yīng)。正常的體外合成體系中，DNA聚合酶在引物的引導(dǎo)下，沿模板鏈35方向，利用4種dNTP聚合互補(bǔ)新鏈。如果在體系中加入2,3-雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP），當(dāng)它們摻入正在合成的新鏈DNA后，由于

44、其缺少脫氧核糖的3位羥基，因而不能與后續(xù)dNTP形成磷酸二酯鍵，新鏈合成中斷。雙脫氧末端終止法的主要操作步驟有：雙脫氧末端終止法的主要操作步驟有：1獲得待測(cè)獲得待測(cè)DNA片段的單鏈模板片段的單鏈模板 n一般采用基因工程的方法以獲取一定數(shù)一般采用基因工程的方法以獲取一定數(shù)量的單鏈待測(cè)量的單鏈待測(cè)DNA模板?？蓪⒋郎y(cè)模板?？蓪⒋郎y(cè)DNA片段與噬菌體片段與噬菌體M13DNA進(jìn)行重組，然后進(jìn)行重組，然后將其導(dǎo)入大腸桿菌進(jìn)行增殖，將其導(dǎo)入大腸桿菌進(jìn)行增殖，M13噬菌體噬菌體一般以單鏈一般以單鏈DNA形式透出細(xì)胞再感染新形式透出細(xì)胞再感染新的細(xì)菌，故此可獲得單鏈的細(xì)菌，故此可獲得單鏈DNA模板。模板。2合

45、成寡核苷酸引物合成寡核苷酸引物 n在待測(cè)在待測(cè)DNA片段的片段的3-端合成一段互補(bǔ)的端合成一段互補(bǔ)的寡核苷酸引物，其順序可為待測(cè)寡核苷酸引物，其順序可為待測(cè)DNA片片段段3-端的一段已知順序，也可為一段端的一段已知順序，也可為一段M13噬菌體的順序。可利用噬菌體的順序。可利用DNA合成儀合成儀自動(dòng)合成。自動(dòng)合成。3模板模板-引物雜交引物雜交 n將待測(cè)單鏈將待測(cè)單鏈DNA模板與寡核苷酸引物混模板與寡核苷酸引物混合，并在適當(dāng)溫度條件下進(jìn)行保溫處理，合，并在適當(dāng)溫度條件下進(jìn)行保溫處理，使引物與使引物與DNA單鏈模板的單鏈模板的3-端進(jìn)行雜交。端進(jìn)行雜交。4互補(bǔ)鏈的延長(zhǎng)和終止互補(bǔ)鏈的延長(zhǎng)和終止 n將上

46、述雜交混合液分為四份，每份混合液中均將上述雜交混合液分為四份，每份混合液中均加入加入DNA聚合酶，四種聚合酶，四種dNTPS，一種帶放射，一種帶放射性同位素標(biāo)記的脫氧核糖核酸（如性同位素標(biāo)記的脫氧核糖核酸（如-32P-dATP）。此外還需分別加入一種雙脫氧核糖）。此外還需分別加入一種雙脫氧核糖核酸（核酸（ddATP，ddGTP，ddCTP或或ddTTP）。）。然后在適當(dāng)溫度條件下延伸互補(bǔ)鏈，就可得到然后在適當(dāng)溫度條件下延伸互補(bǔ)鏈，就可得到四組分別以四組分別以A、G、C、T、終止的長(zhǎng)短不一的、終止的長(zhǎng)短不一的互補(bǔ)鏈的混合物。因在互補(bǔ)鏈合成時(shí)，如摻入互補(bǔ)鏈的混合物。因在互補(bǔ)鏈合成時(shí)，如摻入的是雙脫

47、氧核糖核酸，由于缺乏的是雙脫氧核糖核酸，由于缺乏3-和和2-OH，故可導(dǎo)致互補(bǔ)鏈合成終止。故可導(dǎo)致互補(bǔ)鏈合成終止。5電泳分離電泳分離 n將四組含有長(zhǎng)短不等的反應(yīng)混合物在同將四組含有長(zhǎng)短不等的反應(yīng)混合物在同一聚丙烯酰胺凝膠板上進(jìn)行電泳，即可一聚丙烯酰胺凝膠板上進(jìn)行電泳，即可將只相差一個(gè)核苷酸的寡核苷酸鏈分離將只相差一個(gè)核苷酸的寡核苷酸鏈分離開。開。6放射自顯影放射自顯影 n將電泳凝膠與將電泳凝膠與X光膠片壓在一起，于低溫光膠片壓在一起，于低溫下自顯影數(shù)天，即可得到放射自顯圖譜，下自顯影數(shù)天，即可得到放射自顯圖譜，通過該圖譜即可直接讀出核苷酸的排列通過該圖譜即可直接讀出核苷酸的排列順序。順序。n目

48、前DNA序列分析基本實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，使DNA測(cè)序速度大大加快。人類基因組計(jì)劃是在1986年由美國(guó)學(xué)者提出的，它的最終目的是測(cè)定總長(zhǎng)度約1.7米，由近30億個(gè)核苷酸組成的人基因組DNA全序列，它的實(shí)施將會(huì)為認(rèn)識(shí)疾病的分子機(jī)制以及診斷和治療提供重要的依據(jù)。n在人類基因組計(jì)劃起步階段，采用的還是傳統(tǒng)Sanger雙脫氧終止法和聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行DNA序列分析，基本上還是手工運(yùn)作。n在20世紀(jì)90年代中期對(duì)Sanger雙脫氧終止法進(jìn)行改進(jìn)，采用熒光素代替放射性核素標(biāo)記，被熒光標(biāo)記的反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳分離后，通過四種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長(zhǎng)熒光，檢測(cè)器采集熒光信號(hào)，并

49、依此確定DNA堿基排列順序。這種方法使DNA測(cè)序速度大大加快，也促使了人類基因組計(jì)劃的提前完成。第四節(jié)第四節(jié) 分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)展分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)展一、生物芯片技術(shù)n采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至組織切片、細(xì)胞等生物樣品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝膠、尼龍膜等載體）的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測(cè)生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器比如激光共聚焦掃描或電荷偶聯(lián)攝影像機(jī)（CCD）對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測(cè)分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。一、生物芯片技術(shù)n相對(duì)于傳統(tǒng)核酸/蛋白質(zhì)印跡技術(shù)，生物芯片技術(shù)具有

50、簡(jiǎn)便、自動(dòng)化程度高、檢測(cè)目的分子數(shù)量多及高通量等優(yōu)點(diǎn)，能廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)譜分析、突變檢測(cè)、多態(tài)性分析、基因組文庫(kù)作圖及雜交測(cè)序等，為“后基因組時(shí)代”基因功能的研究及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科學(xué)研究及診斷學(xué)的發(fā)展提供了強(qiáng)有力的工具。根據(jù)芯片上的固定的探針不同，生物芯片包括基因芯片（也稱cDNA微陣列）、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片等。（一）基因芯片n包括DNA芯片和cDNA芯片，是指將許多特定的DNA片段或cDNA片段作為探針，有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待檢測(cè)的熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，雜交后用激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)芯片進(jìn)行掃描，通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一探針位點(diǎn)的熒光信號(hào)做出檢測(cè)、比較和分析

51、，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果，該技術(shù)亦稱為DNA微陣列。（一）基因芯片的應(yīng)用DNA序列分析；基因表達(dá)水平的檢測(cè)，其原理是基于雙色熒光探針雜交系統(tǒng)的應(yīng)用；基因診斷，從正常人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出標(biāo)準(zhǔn)圖譜，從患者的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出病變圖譜；藥物篩選；給藥個(gè)性化；此外，基因芯片在新基因發(fā)現(xiàn)、藥物基因組圖、中藥物種鑒定、DNA計(jì)算機(jī)研究等方面都有應(yīng)用價(jià)值。（二）蛋白質(zhì)芯片n蛋白質(zhì)芯片基本原理是將各種蛋白質(zhì)有序地固定于滴定板、濾膜和載玻片等各種載體上成為檢測(cè)用的芯片，利用蛋白質(zhì)分子間的親和作用，用標(biāo)記了熒光素的蛋白質(zhì)或其他成分與芯片結(jié)合，經(jīng)漂洗將

52、未能與芯片上的蛋白質(zhì)互補(bǔ)結(jié)合的成分洗去，再利用熒光掃描儀或激光共聚焦掃描技術(shù)，測(cè)定芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，通過熒光強(qiáng)度分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的關(guān)系，由此達(dá)到測(cè)定各種蛋白質(zhì)功能的目的。n廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)表達(dá)譜、蛋白質(zhì)功能、蛋白質(zhì)相互作用的研究，在臨床疾病診斷和新藥開發(fā)的篩選上也有很大的應(yīng)用潛力。二、基因組學(xué)相關(guān)技術(shù)n基因組是泛指一個(gè)生命體、病毒或細(xì)胞器的全部遺傳信息，在真核生物，是指一套染色體（單倍體）DNA。n1986年美國(guó)科學(xué)家Thomas Roderick提出了概念，是指對(duì)所有基因進(jìn)行基因組作圖（包括遺傳圖譜、物理圖譜、轉(zhuǎn)錄本圖譜），核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析的一門科學(xué)。

53、n因此，基因組研究應(yīng)該包括兩方面的內(nèi)容：以全基因組測(cè)序?yàn)槟繕?biāo)的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)和以基因功能鑒定為目標(biāo)的功能基因組學(xué)，又被稱為后基因組研究。（一）結(jié)構(gòu)基因組學(xué)n結(jié)構(gòu)基因組學(xué)是基因組學(xué)的一個(gè)重要組成部分和研究領(lǐng)域，它是一門通過基因作圖、核苷酸序列分析確定基因組成、基因定位的科學(xué)，根據(jù)使用的標(biāo)志和手段不同，作圖有三種類型，即構(gòu)建生物體基因組高分辨率的遺傳圖、物理圖譜、序列圖譜和轉(zhuǎn)錄本圖：遺傳圖譜，通過遺傳重組所得到的基因線性排列圖稱為遺傳連鎖圖；物理圖譜，物理圖譜是利用限制性內(nèi)切酶將染色體切成片段，再根據(jù)重疊序列把片段連接成染色體，確定遺傳標(biāo)志之間物理距離的圖譜；（一）結(jié)構(gòu)基因組學(xué)序列圖譜，為人類基因組

54、的全部核苷酸排列順序。是最詳細(xì)和最準(zhǔn)確的物理圖譜。轉(zhuǎn)錄圖譜，利用EST作為標(biāo)記所構(gòu)建的分子遺傳圖譜被稱為轉(zhuǎn)錄圖譜。通過從cDNA文庫(kù)中隨機(jī)調(diào)取的克隆進(jìn)行測(cè)序所獲得的部分cDNA的5或3端序列稱為表達(dá)序列標(biāo)簽（EST），一般長(zhǎng)300500bp。轉(zhuǎn)錄圖譜即為基因圖譜，是編碼蛋白質(zhì)的序列在基因組中的位置。（二）功能基因組學(xué)鑒定DNA序列中的基因，即對(duì)基因組序列進(jìn)行注釋，包括鑒定和描述推測(cè)的基因、非基因序列及其功能；同源搜索設(shè)計(jì)基因功能，通過核苷酸或氨基酸序列的同源性比較，可以推測(cè)基因組內(nèi)相似功能的基因，同源基因在進(jìn)化過程來自共同的祖先；實(shí)驗(yàn)性設(shè)計(jì)基因功能，對(duì)基因進(jìn)行缺失或剔除是采用最常用的實(shí)驗(yàn)方法，

55、結(jié)合缺失或剔除后觀察到的表型變化即可推測(cè)基因功能；描述基因表達(dá)模式：轉(zhuǎn)錄組是指一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的一套mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，包含了某一環(huán)境條件、某一生命階段、某一生理或病理狀態(tài)下，生命體的細(xì)胞或組織所表達(dá)的基因種類和水平；蛋白質(zhì)組是指一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的全套蛋白質(zhì)，反映了特殊階段、環(huán)境、狀態(tài)下細(xì)胞或組織在翻譯水平的蛋白質(zhì)表達(dá)譜。蛋白質(zhì)表達(dá)模式的描述主要是通過基因轉(zhuǎn)錄組分析和蛋白質(zhì)組分析進(jìn)行的。三、蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)n研究包括蛋白質(zhì)的表達(dá)模式、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)胞內(nèi)分布及移位、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用等方面的研究，其中蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究已成為目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究工作中的重要部分。（一）蛋白質(zhì)組的分離

56、技術(shù)雙向凝膠電泳技術(shù)（2-DGE）:原理是第一向進(jìn)行等電聚焦（IEF），根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行初次分離，蛋白質(zhì)沿pH梯度移動(dòng)至各自的等電點(diǎn)位置，隨后再沿垂直方向按照分子量的不同進(jìn)行分離，即進(jìn)行SDS-PAGE，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行再次分離。（二）蛋白質(zhì)組的鑒定技術(shù)質(zhì)譜技術(shù)是目前在鑒定蛋白質(zhì)的多種方法中發(fā)展最快、最具潛力的技術(shù)，具有高靈敏度、高準(zhǔn)確度、自動(dòng)化等特點(diǎn)。它的原理是使樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間的質(zhì)荷比（m/z）的差異來分離并確定其相對(duì)分子質(zhì)量。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)：主要用于蛋白質(zhì)間相互作用和差異顯示蛋白質(zhì)組的研究，是一種在高密度的方格上含有各種微量純化的蛋白質(zhì)，并能夠高通量地測(cè)定這

57、些蛋白質(zhì)的生物活性，以及蛋白質(zhì)與生物大分子之間地相互作用。蛋白質(zhì)信息組學(xué)：蛋白質(zhì)信息組學(xué)在蛋白質(zhì)組分析中起重要作用，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究水平的標(biāo)志和基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)被認(rèn)為是蛋白質(zhì)組學(xué)知識(shí)的儲(chǔ)存庫(kù)，包含所有鑒定的蛋白質(zhì)信息，如蛋白質(zhì)的順序、核苷酸順序、雙向凝膠電泳、三維結(jié)構(gòu)、翻譯后的修飾、基因組及代謝數(shù)據(jù)庫(kù)等。四、酵母雙雜交技術(shù)n1989年，Song和Field建立了第一個(gè)基于酵母的細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)蛋白間相互作用的遺傳系統(tǒng)。很多真核生物的位點(diǎn)特異轉(zhuǎn)錄激活因子通常具有兩個(gè)可分割開的結(jié)構(gòu)域，即DNA特異結(jié)合域（BD）與轉(zhuǎn)錄激活域（AD）。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響。但一個(gè)完整的激活特定基因表達(dá)的激活因

58、子必須同時(shí)含有這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，否則無法完成激活功能。不同來源激活因子的BD區(qū)與AD結(jié)合后則特異地激活被BD結(jié)合的基因表達(dá)。四、酵母雙雜交技術(shù)n酵母雙雜交系統(tǒng)由三個(gè)部分組成：n與BD融合的蛋白表達(dá)載體，被表達(dá)的蛋白稱。n與AD融合的蛋白表達(dá)載體，被其表達(dá)的蛋白稱靶蛋白（prey）。n帶有一個(gè)或多個(gè)報(bào)告基因的宿主菌株。n常用的報(bào)告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株則具有相應(yīng)的缺陷型。雙雜交質(zhì)粒上分別帶有不同的抗性基因和營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因。這些有利于實(shí)驗(yàn)后期雜交質(zhì)粒的鑒定與分離。根據(jù)目前通用的系統(tǒng)中BD來源的不同主要分為GAL4系統(tǒng)和LexA系統(tǒng)。四、酵母雙雜交技術(shù)n應(yīng)用在以下幾方面：檢

59、驗(yàn)一對(duì)功能已知蛋白間的相互作用。研究一對(duì)蛋白間發(fā)生相互作用所必需的結(jié)構(gòu)域。通常需對(duì)待測(cè)蛋白做點(diǎn)突變或缺失突變的處理。其結(jié)果若與結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究結(jié)合則可以極大地促進(jìn)后者的發(fā)展。用已知功能的蛋白基因篩選雙雜交cDNA文庫(kù)，以研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑。分析新基因的生物學(xué)功能。即以功能未知的新基因去篩選文庫(kù)。然后根據(jù)釣到的已知基因的功能推測(cè)該新基因的功能。五、RNA組學(xué)相關(guān)技術(shù)n“RNA組學(xué)”就是從基因組水平研究細(xì)胞中非編碼RNA結(jié)構(gòu)與功能的一門新的科學(xué)。nRNA組學(xué)研究熱點(diǎn)包括RNA干擾技術(shù)、RNAi（RNA干擾）研究程序、合成SiRNA（小干擾RNA）及其基礎(chǔ)理論和應(yīng)用研究。nRNAi是指在

60、特定因子作用下，導(dǎo)入或細(xì)胞內(nèi)生成的雙鏈RNA（dsRNA）降解生成約22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的，后者能通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則和靶mRNA結(jié)合，誘導(dǎo)靶mRNA降解，同時(shí)還可以利用體內(nèi)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)生成下一代siRNA，從而產(chǎn)生放大效應(yīng)和長(zhǎng)期效應(yīng)。五、RNA組學(xué)相關(guān)技術(shù)nRNAi是一個(gè)依賴ATP的過程，由dsRNA介導(dǎo)的同源序列RNA的降解可分為兩步：n首先，較長(zhǎng)的dsRNA裂解成長(zhǎng)度為2123核苷酸較小的干擾片段（siRNA），這一裂解過程需要ATP的參與。在RNAi過程中一種稱為Dicer的核酸酶負(fù)責(zé)將dsRNA轉(zhuǎn)化為siRNA，它屬于RNase家族；n第2步，由siRNA與一系列特異性蛋白結(jié)合形成，RISC

61、被激活后能依靠siRNA的反義鏈識(shí)別mRNA分子的互補(bǔ)區(qū)域（靶mRNA）并使其降解，從而導(dǎo)致特定基因沉默，干擾基因表達(dá)五、RNA組學(xué)相關(guān)技術(shù)RNAi主要特點(diǎn)包括：n干擾因子前身為雙鏈RNA不是單鏈RNA，因而比較穩(wěn)定，不易降解；n是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制，對(duì)DNA序列沒有影響；n能高度特異性抑制mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)；n只作用于外顯子，對(duì)內(nèi)含子無影響；n具有放大效應(yīng)和長(zhǎng)期作用；n其效應(yīng)可以穿過細(xì)胞界限，在不同細(xì)胞間長(zhǎng)距離傳遞和維持。六、轉(zhuǎn)基因技術(shù)n基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的發(fā)展使得人們不僅可以在細(xì)胞水平進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，而且可以使目的基因整合入受精卵或胚胎干細(xì)胞，然后將細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物子宮，使之發(fā)育成個(gè)體。這個(gè)

62、個(gè)體能夠把目的基因繼續(xù)傳給子代，該技術(shù)被稱之為轉(zhuǎn)基因技術(shù)。被導(dǎo)入的目的基因稱為轉(zhuǎn)基因，經(jīng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)修飾的動(dòng)物常被稱為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。目前已經(jīng)建成很多用于研究的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，如轉(zhuǎn)基因小鼠、轉(zhuǎn)基因羊等。六、核轉(zhuǎn)移技術(shù)n是指將動(dòng)物早期胚胎或體細(xì)胞核移植到去核受精卵或成熟卵母細(xì)胞中，重新構(gòu)建新的胚胎，重構(gòu)胚胎發(fā)育成與供核細(xì)胞基因型完全相同后代的技術(shù)。這樣產(chǎn)生的個(gè)體所攜帶的遺傳性狀僅來自一個(gè)父親或母親個(gè)體，是無性繁殖的方式，從遺傳角度講是一個(gè)個(gè)體的完全拷貝，即克隆。n多利羊七、基因沉默技術(shù)n基因沉默是指基因組中的基因由于受內(nèi)在遺傳因素或外源基因的影響而表達(dá)降低或完全不表達(dá)的現(xiàn)象?；虺聊且环N普遍存在的基

63、因調(diào)控機(jī)制，廣泛存在于真菌、植物和動(dòng)物中。n常見基因沉默技術(shù)包括反義RNA技術(shù)、核酶技術(shù)、三鏈DNA技術(shù)、肽核酸、基因敲除技術(shù)和RNA干擾技術(shù)等。第五節(jié)第五節(jié) 基因工程與醫(yī)學(xué)的關(guān)系基因工程與醫(yī)學(xué)的關(guān)系 一、疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆一、疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆二、生物制藥二、生物制藥三、基因診斷三、基因診斷四、基因治療四、基因治療五、遺傳病的預(yù)防五、遺傳病的預(yù)防 一、疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆一、疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆n重組DNA技術(shù)的應(yīng)用使分子遺傳學(xué)家有可能根據(jù)基因定位，而不是它的功能來克隆一個(gè)基因。根據(jù)克隆基因的定位和性質(zhì)研究所提供的線索，可進(jìn)一步確定克隆的基因在分子遺傳病中的作用。因此，一個(gè)疾病相關(guān)基因的

64、發(fā)現(xiàn)不僅可導(dǎo)致新的遺傳病的發(fā)現(xiàn)，而且對(duì)遺傳病的診斷和治療都是極有價(jià)值的。隨著人類基因組計(jì)劃的完成，疾病基因的發(fā)現(xiàn)將越來越多。二、生物制藥二、生物制藥n利用基因工程生產(chǎn)有藥用價(jià)值的蛋白質(zhì)、多肽產(chǎn)品已成為當(dāng)今世界一項(xiàng)重大產(chǎn)業(yè)，并將有望成為21世紀(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)。2000年我國(guó)基因工程藥物和疫苗年銷售額已達(dá)近20億元。重組蛋白藥物生產(chǎn)是在功能研究、基因克隆基礎(chǔ)上，構(gòu)建適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)體系表達(dá)有生物活性的蛋白質(zhì)、多肽；再經(jīng)過科學(xué)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、嚴(yán)格的臨床試驗(yàn)和藥物審查，發(fā)展為新藥物。目前已經(jīng)或正投入市場(chǎng)的主要產(chǎn)品已有20種左右。三、基因診斷三、基因診斷nDNA診斷是利用分子生物學(xué)及分子遺傳學(xué)的技術(shù)和原理，在DNA水

65、平分析、鑒定遺傳性疾病所涉及基因的置換、缺失或插入等突變。n首先分離、擴(kuò)增待測(cè)的DNA片段，然后利用適當(dāng)分析手段，區(qū)分或鑒定DNA的異常。n按現(xiàn)代遺傳病診斷標(biāo)準(zhǔn)，一種可靠的DNA診斷學(xué)方法必須符合：能正確擴(kuò)增靶基因；能準(zhǔn)確區(qū)分單個(gè)堿基的差別；本底或噪聲低，不干擾DNA的鑒定；便于完全自動(dòng)化操作，適合大面積、大人群普查。（一）基因診斷概念和意義n是指利用分子生物學(xué)及分子遺傳學(xué)的技術(shù)和原理，直接檢測(cè)基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常，從而對(duì)疾病做出診斷的方法。通常以DNA和RNA為診斷材料，DNA能反映基因的存在狀態(tài)（結(jié)構(gòu)和數(shù)量），RNA反映了基因的表達(dá)狀態(tài)（功能），檢測(cè)這些分子的異常變化作為疾病確診的

66、依據(jù)?；蛟\斷不僅能對(duì)疾病做出早期、確切的診斷，而且也能確定個(gè)體對(duì)疾病的易感性及疾病的分期分型、療效監(jiān)測(cè)、預(yù)后判斷等，應(yīng)用廣泛。（二）基因診斷的常用技術(shù)n檢測(cè)基因的基本方法歸納起來主要有四種：核酸分子雜交技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)、基因測(cè)序和基因芯片；n在基因診斷中常常是多種檢測(cè)方法相結(jié)合，從而衍生出其他的診斷方法如：?jiǎn)捂湗?gòu)象多態(tài)性分析法、DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法、限制性內(nèi)切酶酶譜分析法、等位基因特異寡核苷酸探針雜交法（ASO）等；（三）基因診斷的應(yīng)用n應(yīng)用主要在幾個(gè)方面：遺傳病的產(chǎn)前診斷。采用PCR技術(shù)，胚胎組織、絨毛組織、羊水細(xì)胞都可以作為檢查材料。鐮形細(xì)胞貧血病、地中海貧血、抗凝血酶缺乏、甲型血友病、假肥大性肌營(yíng)養(yǎng)不良、囊性纖維病等疾病都可按上述方法作產(chǎn)前診斷。惡性腫瘤的基因診斷，惡性腫瘤是危害人類健康的主要疾病之一，其發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟的過程。包括癌基因、抑癌基因在內(nèi)的多基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)的異常是腫瘤病變的主要因素之一。RFLP技術(shù)、PCR-RFLP技術(shù)和寡核苷酸雜交法等都可以用于腫瘤相關(guān)基因診斷。（三）基因診斷的應(yīng)用n應(yīng)用主要在幾個(gè)方面：病原體的基因診斷，由某種病原體