2實(shí)驗(yàn)二 凝集、沉淀反應(yīng)

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1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?.熟悉凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)的概念。熟悉凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)的概念。2.了解單向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)的原理、方法及應(yīng)用。了解單向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)的原理、方法及應(yīng)用。3.掌握直接凝集反應(yīng)玻片法的原理、方法及其掌握直接凝集反應(yīng)玻片法的原理、方法及其用途。用途。4.掌握雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)的原理、方法、結(jié)果掌握雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)的原理、方法、結(jié)果判斷。判斷。1.1.直接凝集反應(yīng)：直接凝集反應(yīng)：顆粒性抗原顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后所呈與相應(yīng)抗體結(jié)合后所呈現(xiàn)的肉眼可見的凝集現(xiàn)象?，F(xiàn)的肉眼可見的凝集現(xiàn)象。2.2.沉淀反應(yīng)：沉淀反應(yīng)：可溶性抗原可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下結(jié)與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下結(jié)合而出現(xiàn)的沉

2、淀現(xiàn)象。合而出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 傷寒桿菌診斷血清、傷寒桿菌菌液、生理鹽水、傷寒桿菌診斷血清、傷寒桿菌菌液、生理鹽水、載玻片、接種環(huán)、記號(hào)筆、酒精燈；瓊脂板、載玻片、接種環(huán)、記號(hào)筆、酒精燈；瓊脂板、打孔器、針頭、毛細(xì)滴管、待測(cè)血清、打孔器、針頭、毛細(xì)滴管、待測(cè)血清、AFPAFP陽陽性血清、性血清、AFPAFP診斷血清（兔抗人診斷血清（兔抗人AFP AFP）等。）等。實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.1.直接凝集反應(yīng)：玻片法（操作）直接凝集反應(yīng)：玻片法（操作）2.2.沉淀反應(yīng)：沉淀反應(yīng)：（1 1）單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（示教）單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（示教）（2 2）雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（操作）雙

3、向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（操作）抗原抗體反應(yīng)又稱血清學(xué)反應(yīng)，主要有：抗原抗體反應(yīng)又稱血清學(xué)反應(yīng)，主要有：1、凝集反應(yīng)、凝集反應(yīng)2、沉淀反應(yīng)、沉淀反應(yīng)3、補(bǔ)體參與反應(yīng)、補(bǔ)體參與反應(yīng)4、中和反應(yīng)、中和反應(yīng)5、免疫標(biāo)記技術(shù)、免疫標(biāo)記技術(shù)常見抗原抗體反應(yīng)的種類常見抗原抗體反應(yīng)的種類一、凝集反應(yīng)一、凝集反應(yīng) (一一)概念概念 顆粒性抗原顆粒性抗原(細(xì)菌、細(xì)胞等細(xì)菌、細(xì)胞等)與相應(yīng)抗體結(jié)合，在與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下，出現(xiàn)肉眼可見的一定條件下，出現(xiàn)肉眼可見的凝集物凝集物，稱為凝集反應(yīng)。，稱為凝集反應(yīng)。原理 玻片凝集試驗(yàn)是一種快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，即抗原抗體的反應(yīng)在玻片上進(jìn)行，是一種定性的試驗(yàn)。用已知抗體檢測(cè)未知抗

4、原。本試驗(yàn)用已知的傷寒桿菌標(biāo)準(zhǔn)診斷血清鑒定未知細(xì)菌。直接凝集反應(yīng)玻片法-菌種鑒定 材料 傷寒桿菌診斷血清、傷寒桿菌菌液、生理鹽水、載玻片、接種環(huán)、蠟筆、酒精燈等。取潔凈玻片1張，用蠟筆劃分2等份，如下圖所示；無菌操作，用接種環(huán)分別于一、二格內(nèi)各加23環(huán)傷寒桿菌診斷血清、生理鹽水；用接種環(huán)取待測(cè)菌液，分別涂布于生理鹽水和傷寒血清中，混勻；輕輕搖動(dòng)玻片，12分鐘后觀察結(jié)果。操作步驟操作步驟生理鹽水生理鹽水 待測(cè)菌液待測(cè)菌液 陰性陰性傷寒血清傷寒血清 待測(cè)菌液待測(cè)菌液？直接凝集反應(yīng)玻片法-菌種鑒定v鹽水側(cè)無凝集顆粒；v血清側(cè)出現(xiàn)肉眼可見的凝集塊為陽性，仍為均勻一致乳濁液者為陰性。注意事項(xiàng)1、接種環(huán)在

5、傷寒菌液取菌前后均需嚴(yán)格滅菌，以免出現(xiàn)假陽性。2、注意涂菌時(shí)，先涂生理鹽水側(cè)，以免污染血清產(chǎn)生錯(cuò)誤結(jié)果。3、搖動(dòng)玻片時(shí)不要把兩凹內(nèi)液體混在一起。結(jié)果及判斷直接凝集反應(yīng)玻片法-菌種鑒定 經(jīng)典抗原抗體反應(yīng)的一種。經(jīng)典抗原抗體反應(yīng)的一種。分類分類:瓊脂擴(kuò)散瓊脂擴(kuò)散 環(huán)狀沉淀反應(yīng)環(huán)狀沉淀反應(yīng) 絮狀沉淀反應(yīng)絮狀沉淀反應(yīng) 免疫電泳免疫電泳二、沉淀反應(yīng)二、沉淀反應(yīng):沉淀線或沉淀環(huán)沉淀線或沉淀環(huán)可溶性抗原可溶性抗原相應(yīng)抗體相應(yīng)抗體+瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)：瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)：瓊脂是一種含有硫酸基的多糖體，高溫時(shí)溶于瓊脂是一種含有硫酸基的多糖體，高溫時(shí)溶于水，冷卻后凝固，形成凝膠，呈多孔結(jié)構(gòu)，充滿水水，冷卻后凝固，形成凝膠，呈

6、多孔結(jié)構(gòu)，充滿水分，允許各種抗原抗體分子自由擴(kuò)散。二者于比例分，允許各種抗原抗體分子自由擴(kuò)散。二者于比例適當(dāng)處相遇，發(fā)生沉淀，形成可見的沉淀帶。適當(dāng)處相遇，發(fā)生沉淀，形成可見的沉淀帶。單向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)單向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn):僅抗原或抗體擴(kuò)散僅抗原或抗體擴(kuò)散 定量實(shí)驗(yàn)定量實(shí)驗(yàn)雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn):抗原和抗體同時(shí)擴(kuò)散抗原和抗體同時(shí)擴(kuò)散 定性實(shí)驗(yàn)定性實(shí)驗(yàn)分類：分類：（一）單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（示教）（示教）原理原理:適宜濃度的抗體預(yù)先在瓊脂中混勻后制成瓊脂板，以適當(dāng)距離打孔，將可溶性抗原至孔中，抗原向周圍擴(kuò)散，與瓊脂中抗體相遇，抗原與抗體比例適宜時(shí)，出現(xiàn)沉淀。沉淀環(huán)的直徑與孔中抗原濃度呈正相關(guān)，可

7、根據(jù)沉淀環(huán)直徑大小從預(yù)先繪制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線查出待測(cè)標(biāo)本中抗原含量。本試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，容易觀察結(jié)果，可測(cè)定抗原的靈敏度約為1020gml.應(yīng)用應(yīng)用:人血清中IgG、IgM、IgA和C3的定量檢測(cè)?？乖瓭舛瓤乖瓭舛瘸恋憝h(huán)直徑平方沉淀環(huán)直徑平方AgAgAgAg瓊脂中含抗體瓊脂中含抗體1:101:101:201:201:401:401:801:80Ag未知未知（二）雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（操作）（操作）原理原理:將可溶性抗原與相應(yīng)抗體兩種溶液置于瓊脂糖凝膠的不同位置，使兩者在凝膠中各自向四周擴(kuò)散,抗原與抗體相遇并在比例合適處形成可見的乳白色沉淀線。應(yīng)用應(yīng)用:檢測(cè) AFP、HBsAg,協(xié)助疾病診斷.材料：材料：待

8、測(cè)血清、AFP陽性血清、AFP診斷血清（兔抗人AFP）、生理鹽水、瓊脂板、打孔器、針頭、毛細(xì)滴管、酒精燈。雙向瓊脂擴(kuò)散法測(cè)血清中AFP甲胎蛋白（甲胎蛋白（AFP）：）：是一種在胚胎期由肝細(xì)胞和卵黃囊合成的球蛋白，存在于胎兒血清中，出生后血清中AFP幾乎消失。正常成人血清中僅含極微量的AFP，經(jīng)典的免疫學(xué)方法檢測(cè)不出。當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí)，AFP含量增高，測(cè)血清中AFP，可協(xié)助診斷原發(fā)性肝癌。1 1、制備瓊脂板：制備瓊脂板：1%鹽水瓊脂加熱溶化，取5ml均勻鋪與載玻片上。2 2、打孔：打孔：瓊脂凝固后，用打孔器打孔成梅花型，針頭取出孔中瓊脂。封底封底：用酒精燈輕烤平皿底部至瓊脂剛剛要熔化為止，封閉

9、孔的底部，以防側(cè)漏。4 4、加樣：加樣：5 5、反應(yīng)：反應(yīng)：于濕盒，37C 24h?？笰FP抗體123456123456雙向擴(kuò)散法測(cè)血清中AFP操作步驟AgAgAgAgAg?Ag?Ag?Ag?AbAb3421561 1、4 4兩孔（陽性對(duì)照孔）與中心孔之間應(yīng)出現(xiàn)清晰的乳白色沉淀線，兩孔（陽性對(duì)照孔）與中心孔之間應(yīng)出現(xiàn)清晰的乳白色沉淀線，5 5、6 6（陰性對(duì)照孔）兩孔與中心孔之間無沉淀線。（陰性對(duì)照孔）兩孔與中心孔之間無沉淀線。3421562 2、3 3兩孔（待測(cè)血清）如與中心孔之間也出現(xiàn)了沉淀線，且一端與兩孔（待測(cè)血清）如與中心孔之間也出現(xiàn)了沉淀線，且一端與相鄰的陽性對(duì)照血清形成的沉淀線相吻

10、合，則該待測(cè)血清為陽性。相鄰的陽性對(duì)照血清形成的沉淀線相吻合，則該待測(cè)血清為陽性。如待測(cè)血清與中心孔出現(xiàn)了沉淀線，但與陽性對(duì)照血清的沉淀線相如待測(cè)血清與中心孔出現(xiàn)了沉淀線，但與陽性對(duì)照血清的沉淀線相交叉，不判為陽性。交叉，不判為陽性。如待測(cè)血清如待測(cè)血清24h24h內(nèi)與中心孔間無沉淀線則為陰性。內(nèi)與中心孔間無沉淀線則為陰性。雙向擴(kuò)散法測(cè)血清中AFP實(shí)驗(yàn)結(jié)果瓊脂板一定平整、光滑瓊脂板一定平整、光滑 (無氣泡無氣泡)，瓊脂不可過厚；，瓊脂不可過厚；打孔不要?jiǎng)澠七吘?；打孔不要?jiǎng)澠七吘?；加樣要加滿而不溢出為止；加樣要加滿而不溢出為止；4 4、合理分配吸管，、合理分配吸管，AgAg、AbAb吸管不能混淆。吸管不能混淆。雙向擴(kuò)散法測(cè)血清中AFP注意事項(xiàng)凝集反應(yīng)與沉淀反應(yīng)的比較思考題思考題v1、凝集反應(yīng)的原理及直接凝集反應(yīng)玻片法的用途是什么？v2、沉淀反應(yīng)的原理是什么？作業(yè)1 寫出實(shí)驗(yàn)報(bào)告寫出實(shí)驗(yàn)報(bào)告 2 分析凝集反應(yīng)的結(jié)果和意義分析凝集反應(yīng)的結(jié)果和意義 3 繪出雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果圖繪出雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果圖23 結(jié)束語結(jié)束語