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1、第六章第六章 外源基因在大腸桿外源基因在大腸桿菌中的表達調(diào)控菌中的表達調(diào)控 第一節(jié)基因表達的概述和基本條件 第二節(jié)在大腸桿菌中影響外源基因表達的因素1講課課件第一節(jié)基因表達的概述和基本條件 一、基因表達的基本概念 二、基因表達的基本條件 三、真核基因在原核細胞中表達及調(diào)控2講課課件第二節(jié)在大腸桿菌中影響外源基因表達的因素 一、啟動子結構對表達效率的影響 二、表達載體的選擇 三、外源基因（cDNA）中密碼子的作用 四、mRNA的一級結構與基因表達 五、mRNA的二級結構對翻譯起始的影響 六、mRNA穩(wěn)定性的影響 七、轉錄終止區(qū)對外源基因表達效率的影響 八、轉錄后的若干因素與基因表達的關系 九、宿
2、主選擇對表達的影響 十、培養(yǎng)條件的控制對表達效率的影響3講課課件一、基因表達的基本概念生物體的遺傳信息都是以核苷酸序列編碼的形式儲存在遺傳物質(zhì)DNA上,基因表達是目的基因DNA在導入的細胞內(nèi)轉錄成mRNA,再以mRNA指導翻譯成蛋白質(zhì)?；虻谋磉_依賴于有效的轉錄和mRNA的正確翻譯以及翻譯后的加工處理等各個環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)作用，其中轉錄最為關鍵，原核的基因表達過程和方式與真核細胞有顯著不同。4講課課件二、基因表達的基本條件 1.外源基因插入序列必須保持正確的方向和閱讀框架。其遺傳密碼不得缺失、遺漏、或錯位及錯碼。否則會導致編碼錯誤的蛋白質(zhì)分子，特別是目的基因序列內(nèi)部應不含兩端酶切位點的識別序列。2.
3、插入的外源基因必須放在原核的啟動子控制之下，也就是使原核的RNA聚合酶能夠識別插入的基因。3.外源基因必須能在大腸桿菌中進行有效轉錄（如無內(nèi)含子），轉錄后的mRNA在菌體必須相當穩(wěn)定，并且能有效地進行翻譯，轉譯的蛋白分子在菌體內(nèi)不致于受菌體蛋白酶的降解。5講課課件三、真核基因在原核細胞中表達及調(diào)控 真核基因在原核細胞中表達及調(diào)控的特點 有效轉錄及其調(diào)控元件有效轉錄及其調(diào)控元件 正確轉譯正確轉譯 原核表達載體的構建原核表達載體的構建6講課課件 有效轉錄及其調(diào)控元件有效轉錄及其調(diào)控元件 1.RNA聚合酶 2.啟動子及其轉錄作用的啟動（啟動子的概念、分類）3.轉錄作用的終止 4.轉錄的弱化作用7講課
4、課件 正確轉譯正確轉譯 1.起始密碼子（intiqtioncodon,initiator）2.核糖體結合位點（RBS，又稱SD序列）8講課課件 原核表達載體的構建原核表達載體的構建 原核表達載體的構建的要求 1.表達載體類型 2.表達載體的舉例 3.包涵體表達載體9講課課件啟動子 乳糖啟動子（Lac）Trp啟動子 Tac啟動子 噬菌體的PL和PR啟動子 脂蛋白啟動子（LPP）10講課課件啟動子結構對表達效率的影響 啟動子-35區(qū)和-10區(qū)序列與通用轉錄序列一致，間距為17bp，大于17bp效果差，不同產(chǎn)物選用不同啟動子，如尿激酶用ptac，IL2/2FU-V用PRPL啟動子效果好。11講課課件
5、表達載體的選擇 載體分子量不宜過大，以2.5-5.6kb為佳，高拷貝，不同產(chǎn)物選用不同類型表達載體。12講課課件外源基因（cDNA）中密碼子的作用 細菌中基因表達對密碼子有偏愛性，不偏愛的稀有密碼子（AGA、AGG）表達效果差，特別當有AGA-AGG連續(xù)序列存在時表達效率低13講課課件mRNA的一級結構與基因表達1.啟始密碼子：表達效率AUGGUGUUG2.SD序列：較長的效率高，如UAAGGAGG比AAGAA高三倍；SD序列與AUG間距一般6-12bp，4-10bp較佳，9bp最佳；SD序列的5非翻譯區(qū)，若有5-UGAUCU，則有增強作用。14講課課件mRNA的二級結構對翻譯起始的影響 mR
6、NA形成二級結構時，可產(chǎn)生莖環(huán)。若SD序列、AUG位于莖環(huán)內(nèi)或發(fā)夾內(nèi)，轉譯受抑制；在莖環(huán)外則有利于轉譯。見表6-115講課課件mRNA穩(wěn)定性的影響 REP序列可阻止mRNA降解，偏愛密碼子也起保護作用。16講課課件真核基因在原核細胞中表達及調(diào)控的特點1.只有一種RNA聚合酶2.以操縱子為單位來完成基因轉錄3.基因轉錄無RNA剪接功能4.因無核仁、核膜，核酸均為裸露的，轉錄與翻譯是連續(xù)進行的5.轉錄產(chǎn)物在多聚核糖體上合成，同時合成多條肽鏈6.有特有SD序列，調(diào)控mRNA與核糖體有效結合和翻譯的起始7.無糖基化功能17講課課件RNA聚合酶 原核細胞只有一種RNA聚合酶，當其核心酶與因子結合，形成全
7、酶后，才能識別DNA上的啟動子進行轉錄。18講課課件啟動子的概念 啟動子是位于結構基因上游，轉錄起始調(diào)控所必需的一段DNA序列，內(nèi)含-35區(qū)（與因子結合）和-10區(qū)（和核心酶結合）的保守序列。當啟動子與全酶結合后可在+1轉錄起始點開始轉錄，如圖6-1。19講課課件轉錄作用的終止 由轉錄終止子發(fā)揮作用，凡能使轉錄終止的有關的DNA的序列稱終止子。強終止子：不依賴因子發(fā)揮終止作用，回文序列中G/C配對多，有四個以上U，致使RNA聚合酶構象改變而終止轉錄。如圖6-9,如圖6-10 弱終止子：依賴因子發(fā)揮終止作用。如圖6-1120講課課件轉錄的弱化作用 轉錄的弱化作用使轉錄沒有到達終止信號處而中途停止
8、轉錄，使mRNA轉錄發(fā)生部分停止，而不是發(fā)生全部停止。21講課課件起始密碼子 起始密碼子是編碼多肽鏈第一位氨基酸的密碼子AUG（或ATG），編碼甲硫氨酸（蛋氨酸）。在細菌中也有罕見的起始密碼子GUG，編碼纈氨酸。其起始表達作用AUGGUG。22講課課件核糖體結合位點 轉錄mRNA的AUG上游具有的，能與核糖體發(fā)生有效結合和轉譯所需要的序列（RBS），長度為3-9bp，距AUG3-11bp，它與16srRNA3末端（AUUCCUCCAC-DAG-5）互補其互補程度、SD與AUG間距等與轉譯效果有關。如圖23講課課件表達載體類型表達載體的類型主要有四種：1.非融合型表達載體，如PKK223-3如圖
9、6-142.分泌型表達載體，如PIN-ompA1如圖6-153.融合蛋白型表達載體，如PGEX如圖6-164.包涵體型表達載體，如pBV220如圖6-1724講課課件原核表達載體的構建的要求 完整的表達載體（質(zhì)粒）應有強啟動子（P）、終止子（T）、多個酶切位點、有抗性標記、復制子和RBS的SD序列。（如圖6-13）還應結合考慮：質(zhì)粒的拷貝能力和穩(wěn)定性，轉譯蛋白的表達形式和存放地點（分泌型/包涵體/融合蛋白），蛋白質(zhì)的分子量、性質(zhì)和穩(wěn)定性以及選擇合適宿主細胞。25講課課件乳糖啟動子（Lac）無乳糖時，調(diào)節(jié)基因（I）產(chǎn)生阻遏蛋白與操縱基因結合，阻止RNA聚合酶結合進而阻止轉錄；有乳糖時，乳糖能與阻
10、遏蛋白結合，使其變構解離而行使轉錄功能。如圖6-2 而LacZ基因可由IPTG（異丙基硫代-D-半乳糖）誘導轉錄。Lac啟動子改建如圖6-3、6-4(a)(b)26講課課件Trp啟動子 色氨酸啟動子（Trp）的阻遏蛋白在有色氨酸時，二者結合，阻遏蛋白變構激活而與啟動子結合，阻止RNA聚合酶的轉錄。無色氨酸時，阻遏解除，因-吲哚丙烯酸是色氨酸的競爭性抑制劑，常用作誘導劑，誘發(fā)色氨酸啟動子轉錄。（如圖6-5）同時，衰減子對Trp轉錄也有調(diào)節(jié)作用（如圖6-6）27講課課件Tac啟動子 Tac啟動子是由Trp啟動子和Lac啟動子構建而成的雜合啟動子，-35區(qū)為Trp啟動子順序，-10為LacUV5啟動
11、子順序，二者之間距離為16bp者為pTrc，17bp者為pTac。該啟動子只需用IPTG誘導轉錄即可。如圖6-728講課課件噬菌體的PL和PR啟動子 PL為左向啟動區(qū)，PR為右向轉錄啟動區(qū)，與CI阻遏蛋白結合，可抑制OL或OR轉錄，但CI在42誘導轉錄（如圖6-8）。29講課課件脂蛋白啟動子（LPP）脂蛋白為細胞外膜蛋白，細菌中含量高，該啟動子表達效率高，由信號肽可將基因表達產(chǎn)物分泌到胞外，常用來構造分泌型表達載體。30講課課件31講課課件32講課課件33講課課件34講課課件35講課課件36講課課件37講課課件38講課課件39講課課件40講課課件41講課課件42講課課件43講課課件44講課課件45講課課件46講課課件47講課課件48講課課件起始密碼子的結構特征基因位于單鏈區(qū)域位于堿基配對區(qū)域蛋白產(chǎn)量的相對濃度D是否876K是否476U是否375V是否265MU3是否236A否是1C否是18H是否12L否是44M否是14J是否1349講課課件
基因表達載體的構建【行業(yè)特制】
