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1、第六章第六章 外源基因在大腸桿外源基因在大腸桿菌中的表達調(diào)控菌中的表達調(diào)控 第一節(jié)基因表達的概述和基本條件 第二節(jié)在大腸桿菌中影響外源基因表達的因素1講課課件第一節(jié)基因表達的概述和基本條件 一、基因表達的基本概念 二、基因表達的基本條件 三、真核基因在原核細胞中表達及調(diào)控2講課課件第二節(jié)在大腸桿菌中影響外源基因表達的因素 一、啟動子結(jié)構(gòu)對表達效率的影響 二、表達載體的選擇 三、外源基因（cDNA）中密碼子的作用 四、mRNA的一級結(jié)構(gòu)與基因表達 五、mRNA的二級結(jié)構(gòu)對翻譯起始的影響 六、mRNA穩(wěn)定性的影響 七、轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對外源基因表達效率的影響 八、轉(zhuǎn)錄后的若干因素與基因表達的關(guān)系 九、宿
2、主選擇對表達的影響 十、培養(yǎng)條件的控制對表達效率的影響3講課課件一、基因表達的基本概念生物體的遺傳信息都是以核苷酸序列編碼的形式儲存在遺傳物質(zhì)DNA上,基因表達是目的基因DNA在導入的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄成mRNA,再以mRNA指導翻譯成蛋白質(zhì)?；虻谋磉_依賴于有效的轉(zhuǎn)錄和mRNA的正確翻譯以及翻譯后的加工處理等各個環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)作用，其中轉(zhuǎn)錄最為關(guān)鍵，原核的基因表達過程和方式與真核細胞有顯著不同。4講課課件二、基因表達的基本條件 1.外源基因插入序列必須保持正確的方向和閱讀框架。其遺傳密碼不得缺失、遺漏、或錯位及錯碼。否則會導致編碼錯誤的蛋白質(zhì)分子，特別是目的基因序列內(nèi)部應(yīng)不含兩端酶切位點的識別序列。2.
3、插入的外源基因必須放在原核的啟動子控制之下，也就是使原核的RNA聚合酶能夠識別插入的基因。3.外源基因必須能在大腸桿菌中進行有效轉(zhuǎn)錄（如無內(nèi)含子），轉(zhuǎn)錄后的mRNA在菌體必須相當穩(wěn)定，并且能有效地進行翻譯，轉(zhuǎn)譯的蛋白分子在菌體內(nèi)不致于受菌體蛋白酶的降解。5講課課件三、真核基因在原核細胞中表達及調(diào)控 真核基因在原核細胞中表達及調(diào)控的特點 有效轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控元件有效轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控元件 正確轉(zhuǎn)譯正確轉(zhuǎn)譯 原核表達載體的構(gòu)建原核表達載體的構(gòu)建6講課課件 有效轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控元件有效轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控元件 1.RNA聚合酶 2.啟動子及其轉(zhuǎn)錄作用的啟動（啟動子的概念、分類）3.轉(zhuǎn)錄作用的終止 4.轉(zhuǎn)錄的弱化作用7講課
4、課件 正確轉(zhuǎn)譯正確轉(zhuǎn)譯 1.起始密碼子（intiqtioncodon,initiator）2.核糖體結(jié)合位點（RBS，又稱SD序列）8講課課件 原核表達載體的構(gòu)建原核表達載體的構(gòu)建 原核表達載體的構(gòu)建的要求 1.表達載體類型 2.表達載體的舉例 3.包涵體表達載體9講課課件啟動子 乳糖啟動子（Lac）Trp啟動子 Tac啟動子 噬菌體的PL和PR啟動子 脂蛋白啟動子（LPP）10講課課件啟動子結(jié)構(gòu)對表達效率的影響 啟動子-35區(qū)和-10區(qū)序列與通用轉(zhuǎn)錄序列一致，間距為17bp，大于17bp效果差，不同產(chǎn)物選用不同啟動子，如尿激酶用ptac，IL2/2FU-V用PRPL啟動子效果好。11講課課件
5、表達載體的選擇 載體分子量不宜過大，以2.5-5.6kb為佳，高拷貝，不同產(chǎn)物選用不同類型表達載體。12講課課件外源基因（cDNA）中密碼子的作用 細菌中基因表達對密碼子有偏愛性，不偏愛的稀有密碼子（AGA、AGG）表達效果差，特別當有AGA-AGG連續(xù)序列存在時表達效率低13講課課件mRNA的一級結(jié)構(gòu)與基因表達1.啟始密碼子：表達效率AUGGUGUUG2.SD序列：較長的效率高，如UAAGGAGG比AAGAA高三倍；SD序列與AUG間距一般6-12bp，4-10bp較佳，9bp最佳；SD序列的5非翻譯區(qū)，若有5-UGAUCU，則有增強作用。14講課課件mRNA的二級結(jié)構(gòu)對翻譯起始的影響 mR
6、NA形成二級結(jié)構(gòu)時，可產(chǎn)生莖環(huán)。若SD序列、AUG位于莖環(huán)內(nèi)或發(fā)夾內(nèi)，轉(zhuǎn)譯受抑制；在莖環(huán)外則有利于轉(zhuǎn)譯。見表6-115講課課件mRNA穩(wěn)定性的影響 REP序列可阻止mRNA降解，偏愛密碼子也起保護作用。16講課課件真核基因在原核細胞中表達及調(diào)控的特點1.只有一種RNA聚合酶2.以操縱子為單位來完成基因轉(zhuǎn)錄3.基因轉(zhuǎn)錄無RNA剪接功能4.因無核仁、核膜，核酸均為裸露的，轉(zhuǎn)錄與翻譯是連續(xù)進行的5.轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在多聚核糖體上合成，同時合成多條肽鏈6.有特有SD序列，調(diào)控mRNA與核糖體有效結(jié)合和翻譯的起始7.無糖基化功能17講課課件RNA聚合酶 原核細胞只有一種RNA聚合酶，當其核心酶與因子結(jié)合，形成全
7、酶后，才能識別DNA上的啟動子進行轉(zhuǎn)錄。18講課課件啟動子的概念 啟動子是位于結(jié)構(gòu)基因上游，轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控所必需的一段DNA序列，內(nèi)含-35區(qū)（與因子結(jié)合）和-10區(qū)（和核心酶結(jié)合）的保守序列。當啟動子與全酶結(jié)合后可在+1轉(zhuǎn)錄起始點開始轉(zhuǎn)錄，如圖6-1。19講課課件轉(zhuǎn)錄作用的終止 由轉(zhuǎn)錄終止子發(fā)揮作用，凡能使轉(zhuǎn)錄終止的有關(guān)的DNA的序列稱終止子。強終止子：不依賴因子發(fā)揮終止作用，回文序列中G/C配對多，有四個以上U，致使RNA聚合酶構(gòu)象改變而終止轉(zhuǎn)錄。如圖6-9,如圖6-10 弱終止子：依賴因子發(fā)揮終止作用。如圖6-1120講課課件轉(zhuǎn)錄的弱化作用 轉(zhuǎn)錄的弱化作用使轉(zhuǎn)錄沒有到達終止信號處而中途停止
8、轉(zhuǎn)錄，使mRNA轉(zhuǎn)錄發(fā)生部分停止，而不是發(fā)生全部停止。21講課課件起始密碼子 起始密碼子是編碼多肽鏈第一位氨基酸的密碼子AUG（或ATG），編碼甲硫氨酸（蛋氨酸）。在細菌中也有罕見的起始密碼子GUG，編碼纈氨酸。其起始表達作用AUGGUG。22講課課件核糖體結(jié)合位點 轉(zhuǎn)錄mRNA的AUG上游具有的，能與核糖體發(fā)生有效結(jié)合和轉(zhuǎn)譯所需要的序列（RBS），長度為3-9bp，距AUG3-11bp，它與16srRNA3末端（AUUCCUCCAC-DAG-5）互補其互補程度、SD與AUG間距等與轉(zhuǎn)譯效果有關(guān)。如圖23講課課件表達載體類型表達載體的類型主要有四種：1.非融合型表達載體，如PKK223-3如圖
9、6-142.分泌型表達載體，如PIN-ompA1如圖6-153.融合蛋白型表達載體，如PGEX如圖6-164.包涵體型表達載體，如pBV220如圖6-1724講課課件原核表達載體的構(gòu)建的要求 完整的表達載體（質(zhì)粒）應(yīng)有強啟動子（P）、終止子（T）、多個酶切位點、有抗性標記、復制子和RBS的SD序列。（如圖6-13）還應(yīng)結(jié)合考慮：質(zhì)粒的拷貝能力和穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)譯蛋白的表達形式和存放地點（分泌型/包涵體/融合蛋白），蛋白質(zhì)的分子量、性質(zhì)和穩(wěn)定性以及選擇合適宿主細胞。25講課課件乳糖啟動子（Lac）無乳糖時，調(diào)節(jié)基因（I）產(chǎn)生阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合，阻止RNA聚合酶結(jié)合進而阻止轉(zhuǎn)錄；有乳糖時，乳糖能與阻
10、遏蛋白結(jié)合，使其變構(gòu)解離而行使轉(zhuǎn)錄功能。如圖6-2 而LacZ基因可由IPTG（異丙基硫代-D-半乳糖）誘導轉(zhuǎn)錄。Lac啟動子改建如圖6-3、6-4(a)(b)26講課課件Trp啟動子 色氨酸啟動子（Trp）的阻遏蛋白在有色氨酸時，二者結(jié)合，阻遏蛋白變構(gòu)激活而與啟動子結(jié)合，阻止RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄。無色氨酸時，阻遏解除，因-吲哚丙烯酸是色氨酸的競爭性抑制劑，常用作誘導劑，誘發(fā)色氨酸啟動子轉(zhuǎn)錄。（如圖6-5）同時，衰減子對Trp轉(zhuǎn)錄也有調(diào)節(jié)作用（如圖6-6）27講課課件Tac啟動子 Tac啟動子是由Trp啟動子和Lac啟動子構(gòu)建而成的雜合啟動子，-35區(qū)為Trp啟動子順序，-10為LacUV5啟動
11、子順序，二者之間距離為16bp者為pTrc，17bp者為pTac。該啟動子只需用IPTG誘導轉(zhuǎn)錄即可。如圖6-728講課課件噬菌體的PL和PR啟動子 PL為左向啟動區(qū)，PR為右向轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)，與CI阻遏蛋白結(jié)合，可抑制OL或OR轉(zhuǎn)錄，但CI在42誘導轉(zhuǎn)錄（如圖6-8）。29講課課件脂蛋白啟動子（LPP）脂蛋白為細胞外膜蛋白，細菌中含量高，該啟動子表達效率高，由信號肽可將基因表達產(chǎn)物分泌到胞外，常用來構(gòu)造分泌型表達載體。30講課課件31講課課件32講課課件33講課課件34講課課件35講課課件36講課課件37講課課件38講課課件39講課課件40講課課件41講課課件42講課課件43講課課件44講課課件45講課課件46講課課件47講課課件48講課課件起始密碼子的結(jié)構(gòu)特征基因位于單鏈區(qū)域位于堿基配對區(qū)域蛋白產(chǎn)量的相對濃度D是否876K是否476U是否375V是否265MU3是否236A否是1C否是18H是否12L否是44M否是14J是否1349講課課件
基因表達載體的構(gòu)建【行業(yè)特制】
