華農(nóng)第16章RNA生物合成

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1、第16章 RNA生物合成 一、 教學(xué)大綱基本要求 轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的RNA聚合酶，啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子，終止子和終止因子，轉(zhuǎn)錄過(guò)程的調(diào)節(jié)控制。轉(zhuǎn)錄后的加工，原核生物RNA加工，真核生物RNA的加工，RNA的拼接和催化機(jī)理。RNA的復(fù)制，噬菌體Qβ RNA的復(fù)制，病毒RNA復(fù)制的主要方法。RNA指導(dǎo)DNA的合成，反轉(zhuǎn)錄酶，病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄的生物學(xué)意義。RNA生物合成的抑制，嘌呤和嘧啶類(lèi)似物，DNA模板功能的抑制劑。 二、 本章知識(shí)要點(diǎn) (一) DNA指導(dǎo)下RNA的合成: 1.轉(zhuǎn)錄的基本概念 在DNA指導(dǎo)下RNA的合成稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄。 轉(zhuǎn)錄中充當(dāng)模板的DNA單鏈稱(chēng)為模板鏈

2、、反意義鏈或（-）鏈，另一條與之互補(bǔ)的DNA鏈稱(chēng)為編碼鏈、有意義鏈或（+）鏈。轉(zhuǎn)錄一個(gè)mRNA分子的DNA片段稱(chēng)為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位。攜帶一條多肽鏈（或一條rRNA和tRNA鏈）所需信息的DNA片段稱(chēng)為一個(gè)基因（或順?lè)醋樱?。原核?xì)胞中大多數(shù)轉(zhuǎn)錄單位為多順?lè)醋樱婧思?xì)胞的大多數(shù)mRNA為單順?lè)醋拥漠a(chǎn)物。轉(zhuǎn)錄僅以DNA一條鏈的某一區(qū)段為模板，因而稱(chēng)為不對(duì)稱(chēng)轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄在DNA上特定的部位開(kāi)始，至另一端的特定部位終止，是在DNA模板指導(dǎo)下，按堿基互補(bǔ)的原則，由RNA聚合酶催化完成的。 2.RNA聚合酶 RNA聚合酶要求以4種核苷三磷酸作為底物，并需要DNA作為模板，Mg2+能促進(jìn)反應(yīng)，RNA鏈的合成方向

3、也是5ˊ→3ˊ。反應(yīng)是可逆的，焦磷酸的分解可推動(dòng)反應(yīng)趨向聚合。RNA聚合酶催化的反應(yīng)無(wú)需引物，也無(wú)校對(duì)功能。 大腸桿菌的RNA聚合酶只有一種，催化3類(lèi)RNA的合成。RNA聚合酶全酶有5個(gè)亞基(α2ββˊσ )組成，σ亞基可識(shí)別并使全酶穩(wěn)定結(jié)合于啟動(dòng)子部位（轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-35序列和-10序列），開(kāi)始轉(zhuǎn)錄；沒(méi)有σ亞基的酶為核心酶（α2ββ’），負(fù)責(zé)RNA鏈的延伸。 真核生物的RNA聚合酶有3種：I、II和III。它們分別轉(zhuǎn)錄rRNA、mRNA和小分子量RNA。利用α-鵝膏蕈堿的抑制作用可以區(qū)分這三類(lèi)RNA聚合酶。 3. 啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子 啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的一段D

4、NA序列。原核生物的啟動(dòng)子有兩個(gè)保守序列，位于-10的Pribriow框，和位于-35的識(shí)別區(qū)。真核生物的啟動(dòng)子有3類(lèi)，分別由RNA聚合酶I、Ⅱ和Ⅲ進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶不能直接識(shí)別和結(jié)合到啟動(dòng)子上，而需借助于轉(zhuǎn)錄因子和輔助轉(zhuǎn)錄因子才能在起點(diǎn)上形成前起始復(fù)合物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。類(lèi)別I啟動(dòng)子包括核心啟動(dòng)子和上游控制元件兩部分，需要UBFl和SLl因子參與作用。 類(lèi)別Ⅱ啟動(dòng)子包括四類(lèi)控制元件：基本啟動(dòng)子、起始子、上游元件和應(yīng)答元件。識(shí)別這些元件的反式因子有通用轉(zhuǎn)錄因子、上游轉(zhuǎn)錄因子和可誘導(dǎo)的因子。類(lèi)別Ⅲ啟動(dòng)子有兩類(lèi)：上游啟動(dòng)子和基因內(nèi)啟動(dòng)子，分別由裝配因子和起始因子促進(jìn)轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成和轉(zhuǎn)錄。

5、 4. 終止子和終止因子 轉(zhuǎn)錄的終止控制元件為終止子，是基因末端一段特殊的序列，它使RNA聚合酶在模板上的移動(dòng)減慢，停止RNA的合成。終止子的輔助因子為終止因子。大腸桿菌有兩類(lèi)終止子：依賴(lài)于rho因子的終止子和不依賴(lài)于rho的終止子。終止子還可用于控制下游基因的表達(dá)。 5. 轉(zhuǎn)錄過(guò)程的調(diào)節(jié)控制 轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)是基因表達(dá)調(diào)節(jié)的重要環(huán)節(jié)，包括時(shí)序調(diào)節(jié)和適應(yīng)調(diào)節(jié)。原核生物基因組成操縱子既是表達(dá)單位，也是協(xié)同調(diào)節(jié)的單位; 它包括在功能上彼此相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因和控制部位（操縱基因和啟動(dòng)子），可接受調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物質(zhì)(阻遏蛋白)的調(diào)節(jié)。原核生物基因表達(dá)調(diào)節(jié)有正調(diào)節(jié)和負(fù)調(diào)節(jié)，以負(fù)調(diào)節(jié)為主。受一種調(diào)節(jié)蛋

6、白所控制的調(diào)節(jié)系統(tǒng)稱(chēng)為調(diào)節(jié)子。不同調(diào)節(jié)系統(tǒng)間形成調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。乳糖操縱子是酶合成誘導(dǎo)型操縱子。它分別受降解物基因活化蛋白和阻遏蛋白的正負(fù)調(diào)控。Trp操縱子屬于酶合成型操縱子。它除了受操縱基因（阻遏物）的調(diào)節(jié)外，還有另一種轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié)基因即衰減子。衰減作用是比阻遏物更精細(xì)的調(diào)節(jié)。 真核生物基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)包括基因的活化、轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成、反式作用因子（即對(duì)轉(zhuǎn)錄起重要調(diào)節(jié)作用的許多核蛋白）的相互作用和順式作用元件（指基因5′端上游區(qū)域那些與基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)的順序，這些順序均與基因處于順式位置）的順序。 真核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)與原核生物有相同之處，也有顯著的不同。①真核生物基因不組成操縱子

7、；②真核生物存在大量順式元件和反式因子，調(diào)節(jié)更復(fù)雜；③真核生物的調(diào)節(jié)以正調(diào)節(jié)為主，可誘導(dǎo)因子以共價(jià)修飾為主；④真核生物具有染色質(zhì)結(jié)構(gòu)水平上的調(diào)節(jié)。 上游調(diào)節(jié)因子通常有3個(gè)結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域和二聚化結(jié)構(gòu)域。最常見(jiàn)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域有：螺旋—轉(zhuǎn)角—螺旋、鋅指、堿性螺旋—突環(huán)—螺旋以及堿性亮氨酸拉鏈。 增強(qiáng)子能在很遠(yuǎn)距離對(duì)啟動(dòng)子產(chǎn)生影響，不論在啟動(dòng)子上游或下游都有作用，作用無(wú)方向性，無(wú)生物種族特異性，但受發(fā)育影響。從本質(zhì)上講，增強(qiáng)子與上游元件起同樣作用。 （二）轉(zhuǎn)錄后的加工 1. 原核生物RNA加工 除原核生物mRNA外，其它各類(lèi)RNA在轉(zhuǎn)錄后需要經(jīng)過(guò)一系列

8、復(fù)雜的加工過(guò)程才能成為成熟的RNA分子。原核生物的穩(wěn)定RNA(rRNA和tRNA)存在切割、修剪、附加、修飾和異構(gòu)化等加工過(guò)程，mRNA一般在轉(zhuǎn)錄的同時(shí)即能進(jìn)行翻譯，不存在加工作用。 2. 真核生物RNA的加工 在真核生物中，編碼大多數(shù)蛋白質(zhì)的基因?yàn)椴贿B續(xù)基因（或稱(chēng)隔裂基因），即包含編碼序列（又稱(chēng)外顯子，extron）和非編碼序列（又稱(chēng)內(nèi)含子，intron），外顯子被內(nèi)含子隔裂成若干片段，二者一起被轉(zhuǎn)錄。真核生物轉(zhuǎn)錄的mRNA前體分子在核內(nèi)加工形成分子大小不等的中間產(chǎn)物，被稱(chēng)為核不均一RNA（即hnRNA）；其中有一部分可轉(zhuǎn)變成細(xì)胞質(zhì)的成熟mRNA。mRNA存在特殊結(jié)構(gòu)。由hnRNA轉(zhuǎn)變?yōu)?/p>

9、 mRNA的加工過(guò)程包括：① 5′端形成特殊的帽子結(jié)構(gòu)（m7G5′ppp5′N(xiāo)mpNp-）；② 3′端加上polyA尾巴；③ 通過(guò)拼接去除內(nèi)含子相應(yīng)序列；④ 鏈內(nèi)部核苷被甲基化。 真核生物通過(guò)RNA的拼接、編輯和再編碼等信息加工過(guò)程，可以抽提有用信息，消除錯(cuò)誤，適應(yīng)調(diào)節(jié)和選擇性的表達(dá)。這類(lèi)加工還有利于生物進(jìn)化。 3. RNA的拼接和催化機(jī)理 大多數(shù)真核基因是斷裂基因，其轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物需通過(guò)拼接，去除非編碼區(qū)（即內(nèi)含子，intron），使編碼區(qū)（外顯子，exon）連接成連續(xù)序列。這是基因表達(dá)調(diào)控的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。 RNA的拼接有類(lèi)型I自我拼接、類(lèi)型II自我拼接、核mRNA的拼接體的拼接、核tR

10、NA的酶促拼接4種方式。 類(lèi)型I和類(lèi)型II自我拼接都不需蛋白酶的參與，其內(nèi)含子本身具有催化功能（稱(chēng)為核酶），能夠自我完成拼接。二者差別在于前者需要游離鳥(niǎo)苷酸（或鳥(niǎo)苷）存在，游離鳥(niǎo)苷酸3′-羥基攻擊內(nèi)含子5′-磷酸基引起轉(zhuǎn)酯反應(yīng)；而后者的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)無(wú)需游離鳥(niǎo)苷酸（或鳥(niǎo)苷）的發(fā)動(dòng)，是由內(nèi)含子靠近3′端的腺苷酸2′-羥基攻擊5′-磷酸基引起的。 核mRNA前體（既hnRNA）的拼接過(guò)程與類(lèi)型II內(nèi)含子的拼接基本相同，其差別在于前者由拼接體完成，而后者由內(nèi)含子自我催化完成。拼接體是由U1、U2、U4-6snRNP（核糖核蛋白）以及一些拼接因子在RNA的拼接位點(diǎn)逐步裝配而。 核內(nèi)tRNA的酶促拼接反

11、應(yīng)分兩步進(jìn)行，分別由不同的酶催化。第一步是由一個(gè)特殊核酸內(nèi)切酶斷裂磷酸二酯鍵，切去插入序列，反應(yīng)不需要ATP。第二步需要ATP，由RNA連接酶催化失竊開(kāi)的使切開(kāi)的tRNA兩部分共價(jià)連接。 （三）RNA的復(fù)制 RNA也可以成為遺傳信息的基本攜帶分子。例如，一些病毒的基因組為RNA分子，含有特異的RNA復(fù)制酶，可以在RNA指導(dǎo)下合成RNA。 RNA通過(guò)復(fù)制將遺傳信息由親代分子傳遞給子代分子。 噬菌體Qβ RNA復(fù)制酶對(duì)模板有很高的特異性，只識(shí)別病毒自身的RNA，對(duì)寄主細(xì)胞或其它病毒的RNA均無(wú)反應(yīng)；并且對(duì)RNA的復(fù)制和翻譯，正鏈和負(fù)鏈的數(shù)量等存在調(diào)節(jié)控制作用。噬菌體QβRNA為正鏈，當(dāng)它

12、侵入大腸桿菌細(xì)胞后，可以直接進(jìn)行與病毒繁殖有關(guān)的蛋白質(zhì)的合成。在噬菌體特異的復(fù)制酶裝配好后，酶就吸附到正鏈RNA的3ˊ末端，以正鏈為模板合成出負(fù)鏈RNA，直至合成進(jìn)程結(jié)束，負(fù)鏈從模板上釋放。同樣的酶又吸附到負(fù)鏈RNA的3ˊ末端，并以負(fù)鏈為模板合成正鏈。兩條鏈都是由5ˊ→3ˊ方向延長(zhǎng)。 病毒RNA復(fù)制方式可以歸為下列幾類(lèi)。① 正鏈RNA病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后首先合成復(fù)制酶及有關(guān)蛋白，然后在復(fù)制酶的作用下進(jìn)行病毒RNA的復(fù)制，最后由病毒RNA和蛋白質(zhì)裝配成病毒顆粒；② 負(fù)鏈RNA病毒侵入細(xì)胞后，借助于病毒帶進(jìn)去的復(fù)制酶合成出正鏈RNA，再以正鏈RNA為模板合成病毒蛋白和復(fù)制病毒RNA；③ 雙鏈RNA

13、病毒在病毒復(fù)制酶的作用下通過(guò)不對(duì)稱(chēng)轉(zhuǎn)錄先合成出正鏈RNA，并以正鏈RNA為模板翻譯成病毒蛋白質(zhì)，然后再合成負(fù)鏈RNA，形成雙鏈RNA分子。 （四）RNA指導(dǎo)下DNA的合成 1.反轉(zhuǎn)錄酶 以RNA為模板合成DNA的過(guò)程稱(chēng)為逆轉(zhuǎn)錄，由逆轉(zhuǎn)錄酶催化。逆轉(zhuǎn)錄酶是依賴(lài)RNA的DNA聚合酶，催化以RNA為模板的DNA合成。逆轉(zhuǎn)錄酶最初發(fā)現(xiàn)于致癌RNA病毒。該酶為多功能酶，能以RNA為模板合成第一條cDNA鏈(逆轉(zhuǎn)錄酶活性)，水解除去RNA-DNA雜合分子中的RNA(RNase H活性)，再以DNA鏈為模板合成雙鏈DNA(DNA聚合酶活性)。病毒RNA的逆轉(zhuǎn)錄要求特定tRNA為引物。逆轉(zhuǎn)錄酶無(wú)

14、校正功能，因此錯(cuò)誤率較高。逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程共有10步反應(yīng)，其中有兩次逆轉(zhuǎn)錄酶在模板上的轉(zhuǎn)移或稱(chēng)為跳躍。逆轉(zhuǎn)錄的結(jié)果在前病毒的兩端出現(xiàn)兩個(gè)長(zhǎng)末端重復(fù)(即U3-R-U5)，這是末端重復(fù)逆轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所致。長(zhǎng)末端重復(fù)序列中含有整合位點(diǎn)、加工位點(diǎn)以及啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列，對(duì)于前病毒的整合和表達(dá)十分重要。 2.病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄 逆轉(zhuǎn)錄病毒能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主DNA序列。如果病毒攜帶了細(xì)胞的原癌基因，使其高水平表達(dá)或失去調(diào)控即成為癌基因。人免疫缺損病毒主要侵染T淋巴細(xì)胞，它在感染后即殺死宿主細(xì)胞，造成獲得性免疫缺損綜合征(AIDS)。逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程的研究不僅揭示了DNA和RNA之間的關(guān)系，而且也為RNA病毒致癌和艾滋病等

15、的治療提供新的途徑。 由RNA逆轉(zhuǎn)錄和整合而形成的遺傳因子即為逆轉(zhuǎn)座子。逆轉(zhuǎn)座子有兩類(lèi)，一類(lèi)自身編碼逆轉(zhuǎn)錄酶／整合酶；另一類(lèi)自身不能編碼有關(guān)的酶，而依賴(lài)于其他來(lái)源。事實(shí)上任何RNA都能經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄和整合而成為逆轉(zhuǎn)座子。具有整合酶和整合位點(diǎn)的逆轉(zhuǎn)座子以較高的效率發(fā)生整合。具有poly(A)n結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)座子易于結(jié)合在染色體富含A-T的斷裂處。有些逆轉(zhuǎn)座子利用染色體DNA隨機(jī)斷裂而發(fā)生整合，這種整合方式將缺乏轉(zhuǎn)座子整合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。 3.反轉(zhuǎn)錄的生物學(xué)意義 逆轉(zhuǎn)座子廣泛分布在真核生物基因組內(nèi)。它們的生物學(xué)作用主要為：①影響所在位點(diǎn)或鄰近基因的活性；②成為基因組的不穩(wěn)定因素，促進(jìn)基因組

16、重組；③促進(jìn)生物進(jìn)化。 （五）RNA生物合成的抑制 RNA生物合成的抑制劑包括嘌呤和嘧啶類(lèi)似物、DNA模板抑制物（嵌合劑和烷化劑等）和RNA聚合酶抑制物（如利福霉素、利鏈菌霉素和α-鵝膏蕈堿）。它們有些可在臨床上，作為抗生素和抗腫瘤藥物，有些只能在實(shí)驗(yàn)室供試驗(yàn)用。 三、重點(diǎn)、難點(diǎn) 重點(diǎn)：轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的RNA聚合酶，啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子，終止子和終止因子，轉(zhuǎn)錄過(guò)程的調(diào)節(jié)控制。轉(zhuǎn)錄后的加工，原核生物RNA加工，真核生物RNA的加工，RNA的拼接和催化機(jī)理。RNA的復(fù)制，噬菌體Qβ RNA的復(fù)制，病毒RNA復(fù)制的主要方法。RNA指導(dǎo)DNA的合成，反轉(zhuǎn)錄酶，病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄的生物學(xué)意義

17、。RNA生物合成的抑制。 難點(diǎn)：轉(zhuǎn)錄過(guò)程,轉(zhuǎn)錄過(guò)程的調(diào)控，RNA轉(zhuǎn)錄后的加工與修飾。 四、典型例題解析 例題15-1：簡(jiǎn)要說(shuō)明原核生物的轉(zhuǎn)錄過(guò)程 解：原核生物大腸桿菌轉(zhuǎn)錄過(guò)程大致可以模板的識(shí)別、轉(zhuǎn)錄的起始、轉(zhuǎn)錄的延伸和終止4個(gè)階段。RNA聚合酶在σ亞基引導(dǎo)下，識(shí)別并結(jié)合到啟動(dòng)子上，然后在與RNA聚合酶結(jié)合的部位，DNA雙鏈局部被解開(kāi)。在轉(zhuǎn)錄的起始階段酶繼續(xù)結(jié)合在啟動(dòng)子上催化合成RNA鏈最初2-9個(gè)核苷酸。隨后σ亞基即脫離核心酶，后者也就離開(kāi)啟動(dòng)子，起始階段至此結(jié)束，轉(zhuǎn)錄進(jìn)入延伸階段。在延伸階段核心酶一直沿著DNA分子向前移動(dòng)，解鏈區(qū)也跟著移動(dòng)，新生RNA鏈得以延長(zhǎng)，直至R

18、NA聚合酶識(shí)別DNA上的終止子，轉(zhuǎn)錄終止，酶與RNA鏈離開(kāi)模板。核心酶具有基本的轉(zhuǎn)錄功能，對(duì)于轉(zhuǎn)錄的全過(guò)程都是需要的，而識(shí)別啟動(dòng)子和起始轉(zhuǎn)錄還需要σ亞基，識(shí)別轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和終止轉(zhuǎn)錄還需要終止因子Nus A 參與。 例題15-2：下面是單鏈DNA模板的堿基序列，將它與RNA聚合酶、GTP、CTP、UTP和[α-32p]ATP〕混合物一起保溫，再用脾磷酸二酯酶水解RNA產(chǎn)物，試問(wèn)可得到哪些3′-32p標(biāo)記的NMP？ 5ˊpApTpCpTpCpGpTpApTpGpCpApTpGpTpCT3ˊ 解：根據(jù)DNA模板的堿基序列先寫(xiě)出RNA產(chǎn)物的堿基序列，每個(gè)A的5’端為32p： 5′32pAp

19、G32pApC32pApUpGpC32pApU32pApCpG32pA32pApG32pAp U 3′ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ 5′-磷酸二酯酶依次水解生成3′-NMP 得到3′―32p[GMP]∶3′―32p[CMP]∶3′― 32p[UMP]∶3′― 32p[CMP]∶3′― 32p[AMP]=3∶2∶1∶1 例題15-3：原核生物RNA聚合酶是如何找到啟動(dòng)子的？真核生物RNA聚合酶與之相比有和異同？ 解：大腸桿菌RNA聚合酶在σ亞基引導(dǎo)下識(shí)別并結(jié)合到啟動(dòng)子上。單獨(dú)核心酶也能與DNA結(jié)合，σ因子的存在對(duì)核心酶的構(gòu)象有

20、較大影響；它導(dǎo)致RNA聚合酶與DNA一般序列和啟動(dòng)子序列親和力有很大不同，極大降低了酶與DNA一般序列的結(jié)合常數(shù)和停留時(shí)間。RNA聚合酶可通過(guò)擴(kuò)散與DNA任意部位結(jié)合，這種結(jié)合是松散的，并且是可逆的。隨后酶結(jié)合的DNA迅速被置換。這個(gè)過(guò)程一直繼續(xù)下去，全酶不斷變化與DNA結(jié)合部位，直到與上啟動(dòng)子序列，隨即有疏松結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)槔喂探Y(jié)合，并且DNA雙鏈被局部揭開(kāi)。 真核生物基因組遠(yuǎn)比原核生物更大，它們的RNA聚合酶也更為復(fù)雜。真核生物RNA聚合酶主要有三類(lèi)：RNA聚合酶I 轉(zhuǎn)錄45SrRNA前體，經(jīng)轉(zhuǎn)錄后加工產(chǎn)生5.8SrRNA，18SrRNA和28SrRNA。RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄所有的mRNA前體

21、和大多數(shù)SnRNA。RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄所tRNA，5SrRNA等小分子轉(zhuǎn)錄物。真核生物RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄過(guò)程大體于細(xì)菌相似，所不同的是真核生物RNA聚合酶自身不能識(shí)別和結(jié)合到啟動(dòng)子上，而需要在啟動(dòng)子上有轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶裝配成活性轉(zhuǎn)錄復(fù)合物才能起始轉(zhuǎn)錄。 例題15-4：何謂啟動(dòng)子？如何利用足跡法法確定啟動(dòng)子的序列結(jié)構(gòu)。 解：?jiǎn)?dòng)子是指RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。利用足跡法和DNA測(cè)序法可以確定啟動(dòng)子的序列結(jié)構(gòu)。所謂足跡法是將DNA起始轉(zhuǎn)錄的限制片段分離出來(lái)。具體方法是加RNA聚合酶使之與啟動(dòng)子部位結(jié)合，再用DNA酶部分水解。與酶結(jié)合的部位被保護(hù)而不水解，其余部

22、位水解成長(zhǎng)短不同的片段，經(jīng)凝膠電泳即可測(cè)出酶所結(jié)合的部位。 例題15-5：雞卵白蛋白基因有7700個(gè)核苷酸對(duì)，經(jīng)轉(zhuǎn)錄后加工從前體分子中剪去內(nèi)含子，拼接成1872個(gè)殘基的成熟mRNA，其中卵白蛋白的編碼序列含1164個(gè)核苷酸（包括一個(gè)終止密碼子）。計(jì)算：（a）從轉(zhuǎn)錄出mRNA前體到最后加工成一個(gè)成熟的卵白蛋白mRNA（假定3′端還有200個(gè)腺苷酸殘基組成的尾巴）需要消耗多少分子ATP？（b）從游離氨基酸開(kāi)始，把這個(gè)mRNA翻譯一次又需要多少分子ATP？ 解：（a）從卵白蛋白基因轉(zhuǎn)錄出的前體mRNA應(yīng)含7700個(gè)核苷酸殘基，另外有200個(gè)腺苷酸殘基組成的尾巴，因?yàn)閐NMP+2ATP→dNTP+

23、2ADP，所以每摻入一個(gè)殘基相當(dāng)于消耗兩分子ATP。如果戴帽和內(nèi)部修飾消耗的能量忽略不計(jì)，這個(gè)基因轉(zhuǎn)錄和加工共需消耗的ATP數(shù)為： （7700+200）×2=1.58×104個(gè)ATP分子 （b）卵白蛋白編碼序列共有1164個(gè)核苷酸，減去一個(gè)終止密碼子，編碼氨基酸的部分共有1161個(gè)殘基，共編碼387個(gè)氨基酸。在蛋白質(zhì)合成時(shí)，每摻入一個(gè)氨基酸相當(dāng)于消耗4分子ATP（詳見(jiàn)第三部分13）。這個(gè)mRNA釋譯一次所需消耗的ATP數(shù)為： 387×4=1548個(gè)ATP分子 例題15-6 RNA拼接可分為幾種類(lèi)型，其作用特點(diǎn)是什么？ 解：RNA的拼接有類(lèi)型I自我拼接、類(lèi)型II自我拼接、核mRNA的拼

24、接體的拼接、核tRNA的酶促拼接4種方式。類(lèi)型I和類(lèi)型II自我拼接都不需蛋白酶的參與，其內(nèi)含子本身具有催化功能（稱(chēng)為核酶），能夠自我完成拼接。二者差別在于前者需要游離鳥(niǎo)苷酸（或鳥(niǎo)苷）存在，游離鳥(niǎo)苷酸3′-羥基攻擊內(nèi)含子5′-磷酸基引起轉(zhuǎn)酯反應(yīng)；而后者的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)無(wú)需游離鳥(niǎo)苷酸（或鳥(niǎo)苷）的發(fā)動(dòng)，是由內(nèi)含子靠近3′端的腺苷酸2′-羥基攻擊5′-磷酸基引起的。 核mRNA前體（既hnRNA）的拼接過(guò)程與類(lèi)型II內(nèi)含子的拼接基本相同，其差別在于前者由拼接體完成，而后者由內(nèi)含子自我催化完成。拼接體是由U1、U2、U4-6snRNP（核糖核蛋白）以及一些拼接因子在RNA的拼接位點(diǎn)逐步裝配而。 核內(nèi)tRN

25、A的酶促拼接反應(yīng)分兩步進(jìn)行，分別由不同的酶催化。第一步是由一個(gè)特殊核酸內(nèi)切酶斷裂磷酸二酯鍵，切去插入序列，反應(yīng)不需要ATP。第二步需要ATP，由RNA連接酶催化失竊開(kāi)的使切開(kāi)的tRNA兩部分共價(jià)連接。 例題15-7：簡(jiǎn)述RNA生物功能的多樣性。 解：1981年Cech T發(fā)現(xiàn)四膜蟲(chóng)rRNA前體能通過(guò)自我拼接切除內(nèi)含子，表明RNA也具有催化功能，稱(chēng)之為核酶。核酶的發(fā)現(xiàn)破除了“RNA的功能只是控制蛋白質(zhì)合成”這一傳統(tǒng)觀點(diǎn)。此后，RNA的重要功能不斷有新的發(fā)現(xiàn)。從而認(rèn)識(shí)到DNA是攜帶遺傳信息分子，蛋白質(zhì)是執(zhí)行生命功能的分子，RNA則既是信息分子，又是功能分子。其主要功能有以下幾個(gè)方面：① RNA

26、在遺傳信息的翻譯中起著決定的作用。蛋白質(zhì)生物合成是生物機(jī)體最復(fù)雜也是最重要的代謝過(guò)程，三類(lèi)RNA共同承擔(dān)并完成這一過(guò)程。② RNA具有重要的催化功能和其他持家功能。持家功能是指細(xì)胞（包括病毒）的基本功能，如原核和真核生物染色體的結(jié)構(gòu)RNA，噬菌體的裝配RNA等。③ RNA轉(zhuǎn)錄后加工和修飾依賴(lài)于各類(lèi)小RNA和其它蛋白質(zhì)復(fù)合物。RNA轉(zhuǎn)錄后的信息加工十分復(fù)雜，其中包括切割、修剪、修飾、異構(gòu)、附加、拼接、編輯和再編碼等，除少數(shù)比較簡(jiǎn)單的過(guò)程可以直接由酶完成外，通常都要由一些特殊的RNA參與作用。④ RNA對(duì)基因表達(dá)和細(xì)胞功能具有重要調(diào)節(jié)作用。反義RNA可通過(guò)與靶部位序列互補(bǔ)而與之結(jié)合，或直接阻止其

27、功能，或改變靶部位構(gòu)象而影響其功能。⑤ RNA在生物的進(jìn)化中起重要作用。從RNA的拼接過(guò)程可以推測(cè)蛋白質(zhì)及基因由模塊構(gòu)建的演化歷程，拼接和編輯可以消除基因突變的危險(xiǎn)，增加遺傳信息的多樣性，促進(jìn)生物進(jìn)化。 例題15-8：舉例說(shuō)明原核生物基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。 解：原核生物基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的機(jī)制，可以用Jacob和Monod提出的操縱子學(xué)說(shuō)來(lái)解釋。操縱子既是表達(dá)單位，也是協(xié)同調(diào)節(jié)的單位; 它包括在功能上彼此相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因和控制部位（操縱基因和啟動(dòng)子），可接受調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物質(zhì)(阻遏蛋白)的調(diào)節(jié)。原核生物基因表達(dá)調(diào)節(jié)有正調(diào)節(jié)（即調(diào)節(jié)因子與操縱基因的結(jié)合促進(jìn)轉(zhuǎn)錄）和負(fù)調(diào)節(jié)（即阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄

28、），以負(fù)調(diào)節(jié)為主。 以乳糖操縱子為例說(shuō)明分解代謝調(diào)節(jié)。乳糖操縱子由調(diào)節(jié)基因、操縱基因和結(jié)構(gòu)基因Z（β-半乳糖苷酶）、Y（β-半乳糖透性酶）和A（β-半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶）組成。當(dāng)培養(yǎng)基中沒(méi)有乳糖存在時(shí)，由調(diào)節(jié)基因表達(dá)產(chǎn)生的阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合，阻止結(jié)構(gòu)基因表達(dá)；當(dāng)培養(yǎng)基中有乳糖存在時(shí)，乳糖作為效應(yīng)物與阻遏蛋白結(jié)合，阻止阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因得以表達(dá)，分解培養(yǎng)基中的乳糖供給細(xì)胞，這是轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控。乳糖操縱子也存在正調(diào)節(jié)，即調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物—環(huán)腺苷酸受體蛋白（cyclic AMP receptor protein，CRP）經(jīng)環(huán)腺苷酸（cAMP）活化，可結(jié)合于受其調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子附近，促進(jìn)結(jié)構(gòu)基因

29、的轉(zhuǎn)錄。 再以色氨酸操縱子為例說(shuō)明氨基酸合成代謝的調(diào)節(jié)。當(dāng)細(xì)胞中色氨酸過(guò)量時(shí)，由調(diào)節(jié)基因表達(dá)產(chǎn)生的阻遏蛋白與色氨酸結(jié)合成為有活性的阻遏蛋白，與操縱基因結(jié)合，阻止結(jié)構(gòu)基因表。在轉(zhuǎn)錄水平上還存在“衰減子”用來(lái)終止和衰減轉(zhuǎn)錄作用，從而阻止基因表達(dá)。 例題15-9：指出下列各種二倍體基因型的大腸桿菌中，β-半乳糖苷酶和透性酶是可誘導(dǎo)的還是組成型的或者不表達(dá)的。 （a）i+O+Z-Y+/i+OcZ+Y+ （b）i+OcZ+Y+/i-OcZ-Y- （c）i-O+Z-Y+/i-OcZ+Y- （d）i+OcZ-Y-/i-OcZ-Y- （e）i-O+Z+Y-/i+OcZ-Y- -

30、解：題中各基因型所用符號(hào)表示：i為調(diào)節(jié)基因，O為操縱基因，Z和Y分別代表β-半乳糖苷酶和透性酶的結(jié)構(gòu)基因；各基因右上角的符號(hào)“+”表示正常，“-”為不表達(dá)，“c”表示組成型。 （a）這種基因型的β-半乳糖苷酶是組成型的，透性酶是部分可誘導(dǎo)的。因?yàn)閕+O+Z-Y+中雖有野生型的調(diào)節(jié)基因和操縱基因，但編碼β-半乳糖苷酶的Z基因失活，編碼透性酶的Y基因可在誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)下生成正常的透性酶。而在i+OcZ+Y+中，突變?yōu)榻M成型的操縱基因不再結(jié)合阻遏蛋白，因而Z基因和Y基因的表達(dá)是組成型的。 （b）β-半乳糖苷酶和透性酶的合成均為組成型。顯然，i+OcZ-Y-無(wú)法生成有活性的產(chǎn)物，而i+OcZ+Y+中

31、的結(jié)構(gòu)基因都是野生型的，Oc的存在使它們?cè)跊](méi)有誘導(dǎo)劑的情況下也能表達(dá)。 （c）這個(gè)二倍體中的兩個(gè)調(diào)節(jié)基因都發(fā)生了突變，不能編碼有活性的阻遏蛋白。因此，β-半乳糖苷酶和透性酶的合成都是組成型的。 （d）由于這種基因型的Z和Y基因均不表達(dá)，因而不能合成β-半乳糖苷酶和透性酶。 （e）i+OcZ-Y-中的結(jié)構(gòu)基因均不表達(dá)，但i+基因可以編碼正常的阻遏蛋白，結(jié)合到i+O+Z+Y-的操縱基因上，當(dāng)誘導(dǎo)劑出現(xiàn)時(shí)就可以轉(zhuǎn)錄Z基因。所以，這個(gè)基因型的β-半乳糖苷酸是可誘導(dǎo)的，透性酶不能合成。 例題15-10：簡(jiǎn)要說(shuō)明什么是“葡萄糖效應(yīng)”？ 解：“葡萄糖效應(yīng)”是指在培養(yǎng)基中，葡萄糖與乳糖都存在時(shí)，細(xì)菌

32、通常優(yōu)先利用葡萄糖不能利用乳糖的現(xiàn)象。只有在葡萄糖耗盡之后，經(jīng)過(guò)短暫停滯后，才能分解利用乳糖。這是由于葡萄糖降解物引起的調(diào)節(jié)作用。受到降解物阻遏表達(dá)的操縱子有乳糖、半乳糖、阿拉伯糖和麥芽糖等操縱子。在這種情況下，調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是cAMP受體蛋白（cyclic AMP receptor protein，CRP）或降解基因活化蛋白（catabolite gene activation protein, CAP），當(dāng)CRP或CAP與cAMP結(jié)合后即被活化，然后與啟動(dòng)子中的某個(gè)部位結(jié)合，促使結(jié)構(gòu)基因表達(dá)，但是當(dāng)細(xì)胞內(nèi)葡萄糖豐富時(shí)，cAMP的濃度降低，以及葡萄糖的降解物抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性，同時(shí)能活化磷酸二酯酶，從而阻止cAMP的生成，分解細(xì)胞中已經(jīng)生成的cAMP。cAMP在細(xì)胞中含量低，CRP或CAP就不能被活化，結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄受阻。這種調(diào)節(jié)屬于精細(xì)調(diào)節(jié)。