《RNA轉(zhuǎn)錄》PPT課件.ppt

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1、第三章 RNA轉(zhuǎn)錄 (RNA transcription) 6.1. 基本概念 6.2. 原核生物 RNA轉(zhuǎn)錄的起始 6.3. 真核生物 RNA轉(zhuǎn)錄的起始 6.4. 轉(zhuǎn)錄的延伸 6.5. 轉(zhuǎn)錄的終止 6.6. 原核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工 6.7. 真核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工 6.8. 真核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中內(nèi)元的去除 6.9. 不連續(xù)轉(zhuǎn)錄和反式拼接 第一節(jié) 基本概念 轉(zhuǎn)錄 (transcription):是指以 DNA為模板，在依賴于 DNA的 RNA聚和酶催化下，以 4中 rNTP（ ATP、 CTP、 GTP和 UTP）為原料，合成 RNA 的過(guò)程。 在有些病毒中， RNA也可以指導(dǎo)合成 RNA。

2、 若 干 基 本 概 念 是基因表達(dá)的第一步，也是最關(guān)鍵的一步。 以 Double Strand DNA中的一條單鏈作為轉(zhuǎn)錄模板 (雜交實(shí)驗(yàn)所證實(shí) ) 有義鏈 (sense strand) 又稱編碼鏈 coding strand: 指不作模板的 DNA單鏈 反義鏈 (antisense strand) 又稱模板鏈 template srand : 指作為模板進(jìn)行 RNA轉(zhuǎn)錄的鏈 (60年代以前的表示方法與此相反 ) 沒(méi)有 A U G C 的規(guī)律 在依賴 DNA的 RNA聚合酶作用下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄 A U、 C G 合成 RNA分子 轉(zhuǎn)錄合成 RNA鏈的方向?yàn)?53， 模板單鏈 DNA的極性 方向?yàn)?

3、35， 而非模板單鏈的極性方向與 RNA鏈相 同，均為 53。（書(shū)寫(xiě)） 基因轉(zhuǎn)錄方式為不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄 (一條單鏈 DNA 為模板 ,RNA 聚合酶的結(jié)合 ) RNA 的轉(zhuǎn)錄包括 promotion. elongation. terminaton 三過(guò)程 從啟動(dòng)子 (promoter)到終止子 (terminator)稱為轉(zhuǎn)錄單 位 (transcription unit) (轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn) ) 原核生物的轉(zhuǎn)錄單位多為 polycistron in operon,真 核生物中的 轉(zhuǎn)錄單位多為 monocistron, No operon 轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)即轉(zhuǎn)錄原點(diǎn)記為 1，其上游記為負(fù)值，下游 記為正值 ups

4、tream start point downstream 10 1 10 第二節(jié) 原核生物 RNA轉(zhuǎn)錄的起始 (RNA Transcription promotion in prokaryots) 兩個(gè)相關(guān)概念 : 操縱元 (operon): 是原核生物基因 表達(dá)調(diào)控的一個(gè) 完整單元，其中 包括結(jié)構(gòu)基因、 調(diào)節(jié)基因、操作 子和啟動(dòng)子 i p o z y a No lac mRNA Absence of lactose Active i p o z y a -Galactosidase Permease Transacetylase Presence of lactose Inactive 啟動(dòng)

5、子 (promoter)：是指 DNA分子上被 RNA聚合酶識(shí)別 并結(jié)合形成起始轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的區(qū)域 ，它還包括一些調(diào)節(jié) 蛋白因子的結(jié)合位點(diǎn) (頻率、效率 ) 一、原核生物的 RNA polymerase (E. coli) 1、全酶 (Holo Enzyme)和核心酶 (Core Enzyme) Core Enzyme Holo Enzyme (1) 全酶（ Holo Enzyme） 用于轉(zhuǎn)錄的起始 依靠空間結(jié)構(gòu)與 DNA模板結(jié)合 (與核心酶結(jié)合后 引起的構(gòu)象變化 ) 專一性地與 DNA序列 (啟動(dòng)子 )結(jié)合 結(jié)合常數(shù)： 1014 mol 半衰期：數(shù)小時(shí) （ 107 mol 1秒以下） 轉(zhuǎn)錄效率

6、低，速度緩慢（ 的結(jié)合 ） （ 2） 核心酶 （ Core Enzyme） 作用于轉(zhuǎn)錄的延伸過(guò)程（終止） 依靠靜電引力 與 DNA模板結(jié)合 （蛋白質(zhì)中堿性 基團(tuán)與 DNA的磷酸根之 間） 非專一性的結(jié)合（與 DNA的序列無(wú)關(guān)） 結(jié)合常數(shù)： 1011 mol 半衰期： 60秒 此外，新發(fā)現(xiàn)的一種 亞基的功能尚不清楚。 2、各亞基的特點(diǎn)和功能 （ 1） 因子 因子可重復(fù)使用 修飾 RNApol構(gòu)型 使 Holo Enzyme 識(shí)別啟動(dòng)子的 Sextama Box( 35區(qū) ), 并通過(guò) 與模板鏈結(jié)合 2 2 2 2 （ 3）全酶的組裝過(guò)程 不同的 因子識(shí)別不同的啟動(dòng)子 E.coli 中有四種 因子

7、（ 70、 32、 54、 28） 枯草桿菌中有 11種 因子 （ 因子的更替對(duì)轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控） （ 2） 因子 核心酶的組建因子 促使 RNApol 與 DNA模板鏈結(jié)合 2 2 前端 因子使模板 DNA雙鏈解鏈為單鏈 尾端 因子使解鏈的單鏈 DNA重新聚合為雙鏈 （ 3） 因子 促進(jìn) RNApol NTP RNA elongation 完成 NMP之間的磷酸酯鍵的連接 Editing 功能（排斥與模板鏈不互補(bǔ)的堿基） 與 Rho （ ）因子競(jìng)爭(zhēng) RNA 3 end E site（ elongation site RifR） :對(duì) NTP非專一性地結(jié) 合（催化作用和 Editing功能） （

8、 4） 因子 參與 RNA非模板鏈（ sense strand）的結(jié)合 （充當(dāng) SSB） 構(gòu)成 Holoenzyme 后， 因子含有兩個(gè)位點(diǎn) I site（ initiation site . Rifs） : 該位點(diǎn)專一性地結(jié)合 ATP或者 GTP （需要高濃度的 ATP或 GTP） 由于各亞基的功能，使全酶本身含有五個(gè)功能位點(diǎn) 有義 DNA鏈結(jié)合位點(diǎn)（ 亞基提供） DNA/RNA雜交鏈結(jié)合位點(diǎn)（ 亞基提供 ） 雙鏈 DNA解鏈位點(diǎn)（前端 亞基提供 ） 單鏈 DNA重旋位點(diǎn)（后端 亞基提供 ） 因子作用位點(diǎn) E. coli RNA polymerase 用于起始和延伸 只用于起始 36.5 K

9、D 36.5 KD 151 KD 155 KD 11 KD 70 KD 二、啟動(dòng)子（ promoter）的結(jié)構(gòu)與功能 （ Prok.E.coli） 1、啟動(dòng)子由兩個(gè)部分組成 （ 1） 上游部分 CAP-cAMP結(jié)合位點(diǎn) （基因表達(dá)調(diào)控的正控制位點(diǎn)） CAP（ catabolite gene Activator Protein） 降解物基因活化蛋白，環(huán)腺苷酸（ cAMP）的受體蛋白 （ 2） 下游部分 RNApol的進(jìn)入（結(jié)合）位點(diǎn) 35 10 包括識(shí)別位點(diǎn)和結(jié)合位點(diǎn)（ R B位點(diǎn)） 2、 RNA聚合酶的進(jìn)入位點(diǎn) （ 1） Sextama 框（ Sextama Box） -35序列， RNA聚合

10、酶的松弛（ 初始 ）結(jié)合位點(diǎn)， RNA聚合酶依靠其 亞基識(shí)別該位點(diǎn) 識(shí)別位點(diǎn)（ R位點(diǎn)） 大多數(shù)啟動(dòng)子中共有序列為 T82T84G78A65C54A45 重要性 :很大程度上決定了啟動(dòng)子的強(qiáng)度 （ RNApol 的 因子） 位置在不同啟動(dòng)子中略有變動(dòng) （ 2） Pribonow 框（ Pribonow Box） -10序列， RNA聚合酶的牢固結(jié)合位點(diǎn) 結(jié)合位點(diǎn)（ B 位點(diǎn)） 一致序列： T80A95T45A60A50T96 （ TATPUAT） 位置范圍 4 到 13 因此又稱 TATA Box 保守 T （ 3） 起始位點(diǎn)（ initiation site）： 1位點(diǎn) RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄起

11、始位點(diǎn) 起始 NTP多為 ATP或 GTP 起始 過(guò)程 ： a. 全酶與啟動(dòng)子結(jié)合的封閉型啟動(dòng)子復(fù)合物的形成 （ R位點(diǎn)被 因子發(fā)現(xiàn)并結(jié)合 ） b、 開(kāi)放型啟動(dòng)子復(fù)合物的形成 RNApol的一個(gè)適合位點(diǎn)到達(dá) 10序列區(qū)域，誘導(dǎo)富 含 AT的 Pribnow 框的“熔解”， 形成 12 17bp的泡 狀 物，同時(shí)酶分子向 10序列轉(zhuǎn)移并與之牢固結(jié)合 開(kāi)放型啟動(dòng)子復(fù)合物使 RNApol聚合酶定向 兩種復(fù)合物均為二元復(fù)合物（全酶和 DNA ） c. 在開(kāi)放型的啟動(dòng)子復(fù)合物中， RNApol的 I位點(diǎn)和 E位點(diǎn)的 核苷酸前體間形成第一個(gè)磷酸二酯鍵（ 亞基） 三元復(fù)合物形成 +1位多為 CAT模式 ,位

12、于離開(kāi)保守 T 69 個(gè)核苷酸處 -6-9 bp- G C T A TTGACA TATAAT -16-18 bp- +1 -35 sequence -10 sequence （ 4） 因子解離 核心酶與 DNA的親和力下降 起始過(guò)程結(jié)束 核心酶移動(dòng)進(jìn)入延伸過(guò)程 轉(zhuǎn)錄的起始過(guò)程 核心酶 12 17bp （ 亞基） 3、 CAP-cAMP 結(jié)合位點(diǎn) （也稱 CAP位點(diǎn)） 轉(zhuǎn)錄調(diào)控中， I 阻遏蛋白 負(fù)調(diào)控 lac 操縱子模型 I 許多基因的表達(dá)還存在正調(diào)控機(jī)制 例如 : E.coli 培養(yǎng)基中乳糖和葡萄糖共存時(shí) 只有葡萄糖被 利用 原因： CAP位點(diǎn)的正調(diào)控 葡萄糖缺少時(shí) ，腺苷酸環(huán)化酶將 AT

13、P cAMP， cAMP與 CAP位點(diǎn)結(jié)合 ,此時(shí)啟動(dòng)子的進(jìn)入位點(diǎn)才能 與 RNApol結(jié)合 葡萄糖存在時(shí)， cAMP不能形成，沒(méi)有 CAP cAMP 與 CAP位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)子的 RNApol進(jìn)入位點(diǎn)不能結(jié) 合 RNApol 因此 ,一個(gè)操縱元中有兩道控制開(kāi)關(guān) ,只有同時(shí)打開(kāi) ,結(jié)構(gòu)基因才 能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。 （對(duì) lac操縱元而言，只有沒(méi)有葡萄糖，有乳糖時(shí)才能進(jìn)行錄） （ 1） CAP位點(diǎn)的組成 （ 70 40） 位點(diǎn) ： 70 50 包括一個(gè) IR 序列 強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn) 位點(diǎn) ： 50 40 弱結(jié)合位點(diǎn) 位點(diǎn) 對(duì)位點(diǎn) 具有協(xié)同效應(yīng)（ cooperativity） （ 2） 位點(diǎn) 結(jié)合 CAP cA

14、MP復(fù)合物后，促使 RNApol進(jìn)入 Sextama Box,最終與 10序列結(jié)合起始轉(zhuǎn)錄 原因： CAP cAMP復(fù)合物與位點(diǎn) 結(jié)合 Sextama Box 富含 GC區(qū)域（ GC島區(qū)）穩(wěn)定性降低 Pribnow Box 的溶解溫度降低 促進(jìn)開(kāi)放型啟 動(dòng)子復(fù)合物的形成 促進(jìn)轉(zhuǎn)錄 上節(jié)課內(nèi)容回顧 : 1、原核生物 RNApol： 2、原核啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)： RNApol進(jìn)入位點(diǎn) 起始過(guò)程 上游位點(diǎn)的組成和功能 4、 RNApol 在 DNA上結(jié)合位點(diǎn)的鑒定 DNase 法 -40bp 而足跡法（ footprinting） 結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確 足跡法原理： 限制酶切割結(jié)合有 RNApol的 DNA 大分

15、子 DNA 末端標(biāo)記該 DNA（ Klenow片段標(biāo)記 3,堿性磷酸酯 酶標(biāo)記 5） 用內(nèi)切酶降解 DNA（控制反應(yīng)條件） 凝膠電泳分離，放射自顯影觀察 限制酶切 分離 大片段 DNA 末端標(biāo)記大分子 DNA 重新結(jié)合 RNApol 作對(duì)照 直接用 DNase 進(jìn)行降解 電泳 用微量 DNase降解 電泳 用足跡法鑒定出來(lái)的 RNApol 與 DNA的結(jié)合區(qū)域?yàn)?+20 50（ 40），大約 60 70 bp 實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn) . 5、 啟動(dòng)子各位點(diǎn)與轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)系 （ 1） 35 序列與 10 序列與轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)系 標(biāo)準(zhǔn)啟動(dòng)子 35 TTGACA 10 TATAAT 則不同的啟動(dòng)子 a. 與標(biāo)準(zhǔn)

16、啟動(dòng)子序列同源性越高 啟動(dòng)強(qiáng)度越大 b. 與標(biāo)準(zhǔn)啟動(dòng)子同源性越低 啟動(dòng)強(qiáng)度越小 c. 與標(biāo)準(zhǔn)啟動(dòng)子差異很大時(shí) 由另一種 因子啟動(dòng) 原因 : 35序列通過(guò)被 因子識(shí)別的容易 決定啟動(dòng)子強(qiáng)度 10序列影響開(kāi)放型啟動(dòng)子復(fù)合物形成的速度 決定啟動(dòng)子強(qiáng)度 （ 2） 35序列與 10序列的間隔區(qū)與轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)系 堿基序列并不重要 間距非常重要 ， 17bp的間距轉(zhuǎn)錄效率最高 間距上的突變種類： 間距趨向于 17bp 上升突變 間距遠(yuǎn)離 17bp 下降突變 啟動(dòng)子上升突變、啟動(dòng)子下降突變 E.Coli各 識(shí)別的啟動(dòng)子的序列 第三節(jié) 真核生物 RNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng) RNA Transcription promot

17、ion in Eukaryots 一、真核生物的 RNApol 1、 三種 RNApol： 根據(jù)對(duì) - 鵝膏蕈堿的敏感性不同而分類 RNApol 最不敏感 （動(dòng)、植、昆） RNApol 最敏感 RNApol 不同種類的敏感性不同 2、 位置和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 RNApol 核仁 活性所占比例最大 轉(zhuǎn)錄 rRNA（ 5.8S、 18S、 28S） RNApol 核質(zhì) 主要負(fù)責(zé) hnRNA、 snRNA 的轉(zhuǎn)錄 hnRNA（ mRNA 前體，核不均一 RNA heterogeneous nuclear RNA） snRNA（核內(nèi)小分子 RNA small nulear RNA) RNApol 核質(zhì) 負(fù)責(zé)

18、tRNA、 5S rRNA、 Alu序列和 部分 snRNA 目前在線粒體和葉綠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)少數(shù) RNApol（活性較低） 3、亞基組成： 分子量 500KDa,含兩個(gè)大亞基和 712 個(gè)小亞基 RNApol ： 大亞基中有 C 末端結(jié)構(gòu)域 (carboxy terminal domain CTD) CTD中含一保守氨基酸序列的多個(gè)重復(fù) Tyr Ser Pro Thr Ser Pro Ser C 端重復(fù)七肽 不同生物中重復(fù)數(shù)目不一樣（酶活性） CTD中的 Ser和 Thr可被高度磷酸化 磷酸化的 RNApol 被稱為 A 非磷酸化的 RNApol 稱為 B CTD參與轉(zhuǎn)錄 B A 使 RNApol

19、易于離開(kāi) 啟動(dòng)子進(jìn)入延伸過(guò)程（ 10倍） 二、 真核生物的啟動(dòng)子 三種 RNApol 三種轉(zhuǎn)錄方式 三種啟動(dòng)子 三類基因， 類 類 類 1、 RNApol 的啟動(dòng)子 結(jié)構(gòu)最復(fù)雜 位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游 ,有多個(gè)短序列元件組成 通用型啟動(dòng)子（無(wú)組織特異性） （ 1） 帽子位點(diǎn)（ cap site）：轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) 與 Prok.的“ CAT模式”相似 （ 2） TATA框（ Hogness 框或 Goldberg-Hogness 框） 位于 30處 一致序列為 T82A97T93A85A63（ T37） A83A50（ T37） 定位轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的功能 （類似原核的 Pribnow框） TATA是絕大

20、多數(shù)真核基因的正確表達(dá)所必需的 （ 3） CAAT框（ CAAT box） 位于 75bp處 一致序列為 GGC/TCAATCT 前兩個(gè) G 的作用十分重要 (轉(zhuǎn)錄效率 ) 增強(qiáng)啟動(dòng)子的效率、頻率，不影響啟動(dòng)子的特異性 （距轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的距離，正反方向） 以上三個(gè)保守序列在絕大多數(shù)啟動(dòng)子中都存在 （ 4） 增強(qiáng)子（ enhancer） （又稱遠(yuǎn)上游序列 far upstream sequence） 在 100以上 SV40的兩個(gè)正向重復(fù)研究得最清楚（ DR） -107178 、 179 250 各 72bp 該增強(qiáng)子的特點(diǎn)如下： 對(duì)依賴于 TATA框的轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)效應(yīng)高于不依賴 的情況 距離效應(yīng)

21、: 離 72bp越近的容易起始轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)錄方向離開(kāi) 72bp的起始序列優(yōu)先轉(zhuǎn)錄 細(xì)胞類型的選擇：不同類型中作用有差異 表明其作用具有細(xì)胞或組織特異性（調(diào)節(jié)蛋白） （ 5） GC框 （ GC box） 位于 90附近，較常見(jiàn)的成分 核心序列為 GGGCGG 可有多個(gè)拷貝，也可以正反兩方向排列 （ 6）其他元件 八聚核苷酸元件 （ octamer element OCT元件 ） 一致序列為 ATTTGCAT KB元件 一致序列為 GGGACTTTCC ATF元件 一致序列為 GTGACGT 還有一些位于起始點(diǎn)下游的相關(guān)元件 （ 7） 不同元件的組合情況 不同元件的 數(shù)目、位置、和排列方向 均有差異

22、例如： SV40的早期啟動(dòng)子中有 6個(gè) GC框 小結(jié) ： 不同啟動(dòng)子中 每種元件與轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的距離不同 不同啟動(dòng)子中的相應(yīng)元件互相交換 ,形成的雜交 啟動(dòng)子功能沒(méi)有變化 各種元件將相應(yīng)的蛋白因子結(jié)合到啟動(dòng)子上， 組成起始復(fù)合物， 蛋白因子間的相互作用決定 了轉(zhuǎn)錄的起始 2、 RNApol 啟動(dòng)子結(jié)構(gòu) （ 1） 分為三類，每種識(shí)別方式不同 a、 下游啟動(dòng)子（內(nèi)部啟動(dòng)子） 位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的下游 5SRNA 和 tRNA基因 可分為兩類 b、 上游啟動(dòng)子 snRNA （ 2）內(nèi)部啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn) 最早發(fā)現(xiàn)于非洲爪蟾的 5S rRNA基因 試驗(yàn)設(shè)置： 非洲爪蟾的卵母細(xì)胞提取液作為體外轉(zhuǎn)錄體系， 進(jìn)行缺失試

23、驗(yàn) 以不同長(zhǎng)度的 5S rRNA基因?yàn)槟０暹M(jìn)行轉(zhuǎn)錄 結(jié)果： 缺失 55以前和缺失 80以后的序列都能正常轉(zhuǎn)錄 缺失 55到 80序列不能轉(zhuǎn)錄 結(jié)論： 5S rRNA基因的啟動(dòng)子位于基因內(nèi)部 該啟動(dòng)子可使 RNApol 在其上游的 55bp處起始轉(zhuǎn)錄 （ 3） 內(nèi)部啟動(dòng)子分為兩類 均含兩個(gè)短序列元件，中間由其他序列隔開(kāi) 第一類： 含 A框和 C框 （ 5S rRNA基因） 第二類： 含 A框和 B框 （ tRNA基因、 VARNA基因） 間隔序列長(zhǎng)短差異很大 其中內(nèi)部啟動(dòng)子起被 RNApol 識(shí)別的作用 上節(jié)課內(nèi)容回顧 : 1、 RNApol在 DNA上結(jié)合位點(diǎn)的鑒定 2、啟動(dòng)子的各部位與轉(zhuǎn)錄效

24、率的關(guān)系 3、真核生物 RNApol： 種類及各自轉(zhuǎn)錄的基因 亞基組成 4、 RNApol 的啟動(dòng)子 5、 RNApol 的啟動(dòng)子 三、 真核生物轉(zhuǎn)錄的起始 三種 RNApol均沒(méi)有對(duì)啟動(dòng)子特異序列的識(shí)別能力 轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程需要很多的輔助因子 (轉(zhuǎn)錄因子 )參與 , 并且按一定順序與 DNA形成復(fù)合物 ,協(xié)助 RNApol定 位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn) RNApol TBP因子 RNApol RNApol 的轉(zhuǎn)錄起始 兩種內(nèi)部啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始需要三種輔助因子 TF A 一種含鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白 TF B 由 TBP和 BRT、 B” TF C 至少 5個(gè)亞基以上 TBP 的作用 所有 RNApol 的轉(zhuǎn)錄起始都

25、需要 TBP 在 RNApol 的轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程中 ,TBP是 SL1的 組份，起定位 RNApol 的作用 RNApol 的轉(zhuǎn)錄起始由 TBP識(shí)別 TATA框 TBP 起定位作用 ,所以又稱定位因子 （ positioning factor） 第四節(jié) 轉(zhuǎn)錄延伸 Transcription Elongation 一、 起始到延伸的轉(zhuǎn)變 始于第一個(gè)磷酸二酯鍵的形成 伴隨著 DNA分子和酶分子構(gòu)象的變化 1、 Prok. 起始時(shí)， 因子有利于 和 亞基具有與 DNA專一 性結(jié)合所要求的構(gòu)象 起始后 , 因子解離 , 和 亞基構(gòu)象發(fā)生變化 2、 Euk. 多種輔助因子的共同作用來(lái)保證這一轉(zhuǎn)變 二、 延

26、伸過(guò)程（ Prok） 酶與產(chǎn)物 RNA不解離 底物 NTP不斷加到 RNA鏈的 3-OH 端 形成一個(gè)磷酸二酯鍵后，核心酶向前滑動(dòng) 延伸位點(diǎn)不斷地接受新的 NTP， RNA鏈不斷延伸 始終保持三元復(fù)合物的結(jié)構(gòu) 1、 轉(zhuǎn)錄泡 RNApol 結(jié)合和轉(zhuǎn)錄的 DNA模板區(qū)域，有 17bp左右 DNA形成解鏈區(qū) 轉(zhuǎn)錄泡處雜交雙鏈很短 胰臟 RNAase______其長(zhǎng)度 10bp（不準(zhǔn)確） 推測(cè)也就兩個(gè)核苷酸左右 2、 拓?fù)鋵W(xué)問(wèn)題 RNA合成過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄泡兩端要發(fā)生拓?fù)滢D(zhuǎn)變 RNApol 的前沿 . 解螺旋作用 RNApol 后端 .DNA 的螺旋化 （保持 ） 超纏問(wèn)題的解決靠 DNA旋轉(zhuǎn)酶 RNA-

27、DNA雜交鏈也要求作旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng) 旋轉(zhuǎn)酶 3、 轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的延宕 （ 1） RNA的合成速度大約 30 50 個(gè)核苷酸秒 ,與蛋白 質(zhì)的合成速度相近（ 15個(gè) AA sec） （ 2） 模板 DNA中 G C 的存在 延宕 （ G C后的 810 個(gè)核苷酸） 延宕作用在 RNA鏈的終止和釋放中起重要作用 思考 : 延宕發(fā)生的原因 ? 第五節(jié) 轉(zhuǎn)錄的終止 Transcription termination 終止過(guò)程： 酶停止添加底物 釋放 RNA鏈 酶解離 終止反應(yīng) 雜合雙鏈的氫鍵斷裂， 重新形成雙螺旋，酶的解離。 終止子（ terminator）：在轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中，提供轉(zhuǎn)錄終止 信號(hào)的 RNA序列

28、真正起終止作用的是 RNA序列與啟動(dòng)子不同 Prok.和 Euk. 都具有一種基因表達(dá)調(diào)控的手段 一、原核生物的終止子 1、 終止子的種類 （ 1） 內(nèi)在終止子（不依賴 因子的終止子） 體外實(shí)驗(yàn)中，只有核心酶和終止子就足以使轉(zhuǎn)錄終止 （ 2） 依賴 因子的終止子 蛋白質(zhì)輔助因子 因子 存在時(shí)，核心酶終止轉(zhuǎn)錄 兩者有共同的結(jié)構(gòu)特征（序列差異） 2、不依賴 因子的終止子 結(jié)構(gòu)特征 : 一是形成一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu) 莖 . 720 bp 的 IR序列形成（富含 G/C） 環(huán) . 中間不重復(fù)序列形成 發(fā)夾結(jié)構(gòu)的突變可阻止轉(zhuǎn)錄的終止 二是 6 8 個(gè)連續(xù)的 U串（發(fā)夾結(jié)構(gòu)末端） 不依賴 終止子結(jié)構(gòu) IR IR

29、莖部富含 GC 3、依賴 因子的終止子 （ 1） 結(jié)構(gòu) IR序列中的 G C 對(duì)含量較少 發(fā)夾結(jié)構(gòu)末端沒(méi)有固定特征 （ 2） 靠與 的共同作用而實(shí)現(xiàn)終止 無(wú)連續(xù) U串 G/C 含 量 較 少 二、 原核生物轉(zhuǎn)錄的終止 1、不依賴 因子的終止子終止轉(zhuǎn)錄 （ 1） 新生 RNA鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成 與 RNApol發(fā)生作用 造成高度延宕（典型的有 60秒左右） （ 2） RNApol暫停為終止提供了機(jī)會(huì) ， 6 8個(gè)連續(xù)的 U 串可能為 RNApol與模板的解離提供了信號(hào) RNA DNA之間的 rU dA 結(jié)合力較弱 阻止 RNA鏈的釋放 于是： RNA DNA解離 三元復(fù)合體解體 RNApol解離 轉(zhuǎn)

30、錄終止 （ 3） 真正的終止點(diǎn)不固定，在 U串中的任何一處 （ 4） IR序列和 U串同等重要 IR中的 G C對(duì)含量的減少 U串的縮短或缺失 （ 5） DNA上與 U串對(duì)應(yīng)的為富含 A T的區(qū)域 說(shuō)明： AT富含區(qū)在轉(zhuǎn)錄的終止和起始中均起重要的作用 2、依賴 因子的終止子終止轉(zhuǎn)錄 （ 1） 通讀（ read through）： 在依賴 因子的轉(zhuǎn)錄終止 過(guò)程中， RNApol 轉(zhuǎn)錄了 IR 序列之后，雖發(fā)生 一定時(shí)間的延宕，但如果沒(méi)有 因子存在，則 RNApol 會(huì)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄 （ 2） 因子 a、 活性形式為六聚體 促進(jìn)轉(zhuǎn)錄終止的活性， NTPase 活性 b、 RNA長(zhǎng)度大于 50nt時(shí)，依賴

31、 RNA的 NTPase活性最大 說(shuō)明： 因子識(shí)別和結(jié)合的是 RNA （ 3） 因子對(duì)終止子的作用 a、 因子與 RNA結(jié)合（終止子上游的某一處， RNA的 5端 ） b、 因子沿 RNA從 53 移動(dòng)（ NTP水解供 能 ） （終止子處的較長(zhǎng)時(shí)間的延宕給 因子追趕的機(jī)會(huì) ） c、 因子與 RNApol 相互作用而造成轉(zhuǎn)錄的終止 結(jié)合上來(lái)追趕 RNApol 追趕上來(lái) （暫停） 與 RNApol相 互作用使雜交鏈 解鏈 終止子 （ 4） 終止反應(yīng)還需要 RNA 與 DNA 的相互作用 即 ： 需要一定的 RNA序列 因?yàn)椋?其 與模板的結(jié)合力必須弱到一定數(shù)值 ，才能配合 因子 與 RNApol

32、的作用 （發(fā)夾結(jié)構(gòu)下游的 AU序列） 序列不同的終止子 不同的終止程度 基因表達(dá) 調(diào)控的途徑之一 （ 5） Prok.依賴 因子的終止子為基因表達(dá)調(diào)控 提供了一種方式 因?yàn)椋?Prok.中轉(zhuǎn)錄與翻譯偶聯(lián) ？ 為什么同一個(gè)轉(zhuǎn)錄元里近基因的一個(gè)無(wú)義 突變能阻止遠(yuǎn)基因的表達(dá)這一極性現(xiàn)象 RNApol 核糖體 因子 無(wú)義突 變位點(diǎn) 三、終止與抗終止及抗終止因子 各種生物采用不同的手段控制不同發(fā)育階段 的基因表達(dá) * 枯草桿菌 -更替 因子 * T7噬菌體 -更換 RNApol * 噬菌體采用 依賴于 因子的終止以及通過(guò)抗 終止因子的抗終止作用 Ph ag e 的 操 縱 元 組 織 情 況 PM P

33、L PR PR 重 組 復(fù)制 裂 解 溶原周期 溶菌周期 PN PQ 抗終止作用的過(guò)程 早期 遲早期 晚期 抗終止的機(jī)制 依賴于噬菌體本身的依賴 因子的終止子 依賴 因子的終止子上游有抗終止信號(hào) (靠近 PL 的 nutL，靠近 tR1的 nutR nut PN utilization) 抗終止蛋白和 nut位點(diǎn)的結(jié)合，等待 RNApol經(jīng)過(guò) 時(shí)修飾 RNApol的構(gòu)象，拮抗寄主編碼的終止蛋 白 的活性 ,使之通過(guò)那些依賴 的終止子 上節(jié)課內(nèi)容回顧 : 1、轉(zhuǎn)錄的延伸 2、轉(zhuǎn)錄的終止 不依賴 因子的終止子終止轉(zhuǎn)錄 依賴 因子的終止子終止轉(zhuǎn)錄 3、抗終止 四、真核生物的終止子及轉(zhuǎn)錄終止 了解很少

34、（ 3 末端） 1、 RNApol 的終止子類似 Prok.不依賴 因子終止子， 終止可能靠 RNApol 本身完成 SV40的終止子 : 發(fā)夾結(jié)構(gòu) U串 2、 RNApol 的終止子類似原核生物（發(fā)夾結(jié)構(gòu) U串） U串位于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的頂端 且保守性很強(qiáng)（酵母 人） 環(huán)和柄對(duì)轉(zhuǎn)錄的終止同等重要 第六節(jié) 原核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工 Pre-RNA processing in Prokaryotes Prok.的 mRNA半衰期只有幾分鐘 （基因表達(dá)調(diào)控的一種手段） rRNA、 tRNA比較穩(wěn)定 半衰期幾小時(shí) 成熟分子和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的差別： 5 單磷酸三磷酸 分子大小 異常堿基 一、 rRNA 后加工 1

35、、 基因排列方式 三種 rRNA 基因（ 5S、 16S、 23S）與 tRNA 的基因形成操縱元（ rrn）（ E.coli 七個(gè)） 每個(gè) rrn中 tRNA 基因無(wú)固定模式 （種類、數(shù)量、位置） 三個(gè) rRNA基因的相對(duì)位置有一定規(guī)律 16S rDNA 間隔 tDNA.23S rDNA.5S rDNA 收尾 tDNA 加工過(guò)程主要是 RNAse 等酶的作用 雙鏈區(qū)域 二、 tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工 1、 tRNA 基因 （ 1） 轉(zhuǎn)錄單元大多是多基因的 同一個(gè) tRNA基因、不同 tRNA基因、 與 rRNA基因 （ 2） 有兩種類型的 tRNA 基因： 型 具有 3端的 CCA序列 型 沒(méi)有

36、 3端的 CCA序列 （ 3） 型需在酶的作用下切除 CCA下游一段序列 （ Prok. 的 tRNA多為 型） 型需要在酶的作用下添加 CCA序列 （ 少數(shù) Phage 、 Euk.） 2、 參與 tRNA后加工的酶 （ 1） RNAaseP： 內(nèi)切核酸酶，核蛋白 使 tRNA產(chǎn)生成熟的 5端 識(shí)別 tRNA的空間構(gòu)象 （ 2） RNAaseD：外切核酸酶，使 型 tRNA暴露出 CCA端 a、 RNAaseP 存在時(shí) RNAaseD可達(dá)最大活性 b、 RNAaseQ、 RNAaseY、 RNAaseP3與此酶功能相同 （ 3） tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶（ tRNA nucleotidyl tr

37、ansferase） 以 ATP和 CTP為前體，催化 tRNA（ 型 ）的 3端生成 CCA a、 E.coli中該酶基因突變后，會(huì)影響菌株生長(zhǎng) （ CCA末端常丟失） b、 識(shí)別 tRNA的空間結(jié)構(gòu)，無(wú)種屬特異性 （ 4） RNAase ：與 RNAaseO、 RNAaseP2的功能相似，負(fù)責(zé)切 開(kāi)間隔序列 3、 E.coli 的 tRNATyr1分子的修飾過(guò)程 編碼基因的原始轉(zhuǎn)錄物 三磷酸 有兩個(gè)基因拷貝 間隔子 （各長(zhǎng) 350base） 有一個(gè) tRNATyr1的轉(zhuǎn)錄單元的原始轉(zhuǎn)錄物的修飾過(guò)程 三、 RNA中的甲基化及常見(jiàn)的修飾核苷酸 m5C m6A HNH HNH O O HNH H

38、N CH3 H3C Prok.中主要是堿基的修飾 Euk.核糖、堿基 常見(jiàn) tRNA中的修飾核苷酸 Cmnm5U (5-羧甲基氨甲基尿苷 ) mCm5U （ 5-甲氧基羰甲基尿苷） Xm5s2U （ 5-甲基 -2硫代尿苷） K2C （ 2-賴氨酸胞苷） Com5U （ 5(2)-羥羧甲基尿苷） I （ Inosine次黃嘌呤） m7G (7-甲基尿苷 ) m5C （ 5-甲基胞苷） m6A （ 6-甲基腺苷） s2C （ 2-硫代胞苷） (假尿苷） Um (2-O-甲基尿苷 ) Q （ Queuosine） Xo5U (5-羥基尿苷 ) OH OH NH CH2 H2N R 第七節(jié) Euk轉(zhuǎn)

39、錄產(chǎn)物的后加工 Pre-RNA processing in Eukaryotes 一、 rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工 主體 rRNA基因（ 5.8S、 18S、 28SrDNA）組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元 47S前體 45S前體 a、甲基化位點(diǎn)可能是酶識(shí)別的標(biāo)志 b、加工的對(duì)象是一種核蛋白 c、哺乳動(dòng)物的 45SRNA前體有幾種不同的加工方式 二者的共同之處 : 先切除 18S rRNA之前 5端序列 18S rRNA部分與后面的 5.8S rRNA和 28S rRNA 部分分開(kāi) 5.8S rRNA和 28S rRNA通過(guò)堿基配對(duì)相結(jié)合 Euk.的 5S rRNA 二、 mRNA的轉(zhuǎn)錄后修飾 -帽子 1、 帽子

40、的種類 帽子 0（ Cap-0） m7GpppXpYp-（共有） m7G N7 甲基鳥(niǎo)苷 帽子 1 （ Cap-1） m7GpppXmpYp- 第一個(gè)核苷酸的 2-O 位上產(chǎn)生甲基 化 （ A N6 位甲基化） 帽子 2（ Cap-2） m7GpppXmpYmp 第二個(gè)核苷酸的 2-O 位上產(chǎn)生甲基 化（ A、 G、 C、 U） HN CH3 m7G 帽子 0 其中 : 單細(xì)胞真核生物只有 Cap 0 Cap 1 是其余真核生物的主要帽子形式 Cap 2 存在于某些真核生物中 2、 帽子結(jié)構(gòu)的生成 甲基供體都為 S 腺苷甲硫氨酸（ SAM） RNA鳥(niǎo)苷酸轉(zhuǎn)移酶 -戴帽酶（ capping en

41、zyme） 3、 帽子結(jié)構(gòu)的功能 （ 1） 對(duì)翻譯起識(shí)別作用 -為核糖體識(shí)別 RNA提供信號(hào) Cap 0 的全部都是識(shí)別的重要信號(hào) Cap 1,2 的甲基化能增進(jìn)識(shí)別 （ 2） 增加 mRNA 的穩(wěn)定性，使 5端免遭外切核酸酶的攻擊 （ 3） 與某些 RNA病毒的正鏈合成有關(guān) （ Cap 1、 Cap 2 ） 除帽子結(jié)構(gòu)外的 Euk.mRNA內(nèi)部甲基化 m6A形式 三、 mRNA的轉(zhuǎn)錄后修飾 二 - 多聚（ A）尾巴 1、 3端 -約長(zhǎng) 200bp (大多數(shù) Euk.的 mRNA) （ poly(A)+ poly(A)- ） 最近研究發(fā)現(xiàn)，原核生物的 RNA轉(zhuǎn)錄后也有 3添加 poly(A)

42、的現(xiàn)象 E.coli 的 poly(A)+聚合酶早在 1962年就已發(fā)現(xiàn) 2、 poly(A) 的生成 a、 RNA末端腺苷酸轉(zhuǎn)移酶（ poly(A) 聚合酶 ）催化 前體 ATP 反應(yīng)如下： 多聚核糖核酸 + nATP Mg+ 或 Mn+ 多聚核糖核酸 (A)n + nPPi b、添加位點(diǎn) 內(nèi)切酶 (360KDa)切除一段序列 由 poly(A) 聚合酶 催化添加 poly(A) 內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)（有其它因子參與） 切點(diǎn)上游 13 20bp處的 AAUAAA 切點(diǎn)下游的 GUGUGUG （單細(xì)胞 Euk.除外） 上節(jié)課內(nèi)容回顧 : 1、 Prok.轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工 rRNA tRNA 2、

43、Euk.轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工 尾巴的生成 主體 rRNA 帽子結(jié)構(gòu) 3、 poly(A) 的功能 c、對(duì)含 poly(A) 的 mRNA 失去 poly(A) 可減弱其翻譯 （ 1） 可能與核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān) ） （ 2） 與 mRNA的壽命有關(guān) （ 3） 與翻譯有關(guān) a、 缺失可抑制體外翻譯的起始 b、 胚胎發(fā)育中， poly(A) 對(duì)其 mRNA的翻譯有影 響（非 poly(A) 化的為儲(chǔ)藏形式） （ 4） poly(A) 在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中有很大應(yīng)用價(jià)值 a、 也可將 oligo (dT) 與載體相連，從總體 RNA中分離 純化 mRNA b、 用寡聚 dT（ oligo (dT)）為引物，反轉(zhuǎn)錄

44、合成 cDNA 第八 節(jié) Euk.轉(zhuǎn)錄產(chǎn) 物中 內(nèi) 元的去除 Intron removing in Eukaryote 一、概述 1、 概念 割裂基因（ split gene）：指編碼某一 RNA的基因中有些 序列并不出現(xiàn)在成熟的 RNA序列中，成熟 RNA 的序列在基因中被其他的序列隔開(kāi) 內(nèi)元（ intron）：原初轉(zhuǎn)錄物中通過(guò) RNA拼接反應(yīng)而被去 除的 RNA序列或基因中與這些 RNA序列相應(yīng)的 DNA序列 外元（ excon）： RNA拼接（ RNA splicing）： 一個(gè)基因的外元和內(nèi)元共同 轉(zhuǎn)錄在一條轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，將內(nèi)元去除而把外元連 接起來(lái)形成成熟 RNA分子的過(guò)程 拼接點(diǎn)：

45、5 拼接點(diǎn)或左拼接點(diǎn)（內(nèi)元上游） 3 拼接點(diǎn)或右拼接點(diǎn)（ 下游） 2、 內(nèi)元的分類 1982 Davies等人 中部核心結(jié)構(gòu)（ central core structure） :在有些內(nèi)元 中，含有 4個(gè)重復(fù)的保守序列，長(zhǎng)度為 10 20bp， 4個(gè)保守序列構(gòu)成一種二級(jí) 結(jié)構(gòu)，在拼接中起重要作用 由于并非所有的內(nèi)元都有中部核心結(jié)構(gòu)，所以有了內(nèi)元的分類 類內(nèi)元（ group ） :含有中部核心結(jié)構(gòu)的 細(xì)胞器基因 核基因 類內(nèi)元（ group ） :不含有中部核心結(jié)構(gòu) 細(xì)胞器線粒體基因內(nèi) 核基因 類內(nèi)元 （ group ） :具有 GU AG 特征的邊界序列 核基因 mRNA前體 tRNA基因的內(nèi)

46、元 均位于 tRNA 的反密碼環(huán)上 四種內(nèi)元的邊界序列各有一定共同的特征 3、拼接方式 方式一：由拼接裝置完成（核 mRNA內(nèi)元） 可供識(shí)別的特異序列 拼接裝置由多種蛋白質(zhì)和核蛋白組成 方式二：自我拼接（兩類內(nèi)元 、 ） 形成特定的二級(jí)結(jié)構(gòu) RNA具有催化拼接的能力 方式三：需要蛋白質(zhì)酶參與的拼接（酵母 tRNA） 前兩種拼接都屬于轉(zhuǎn)酯反應(yīng) 二、 tRNA的拼接（酵母為例） 1、鏈的斷裂和連接是兩個(gè)獨(dú)立的過(guò)程 2、 tRNA的內(nèi)元均 位于反密碼環(huán)的 3端，與反密碼子相距 一個(gè) Nt（ 40 400） 長(zhǎng) 1416bp，其中含一段與反密碼環(huán)互補(bǔ)的序列 反密碼環(huán)處形成一個(gè)與成熟 tRNA不同的構(gòu)象

47、 3、拼接酶系識(shí)別的是二級(jí)結(jié)構(gòu) 酵母 tRNAphe 4、 拼接過(guò)程 研究方法 構(gòu)建溫度敏感突變體（高溫時(shí) . ） 分離累積 tRNA前體 體外加入野生型細(xì)胞抽提液 研究拼接過(guò)程 第一步： 內(nèi)切酶作用 釋放一條線狀內(nèi)元分子 和兩個(gè)“ tRNA半分子” 兩個(gè) tRNA半分子采取成熟 tRNA分子的構(gòu)象 (切刻 ) 第二步： RNA連接酶連接斷端 其中 內(nèi)切酶作用后產(chǎn)生 5OH 和 3磷酸， 3磷酸端很快轉(zhuǎn) 變?yōu)?2， 3環(huán)式核苷酸 因此， 一個(gè)半分子有兩個(gè)磷酸末端，一 個(gè)半分子有兩個(gè) OH末端 連接反應(yīng)前要進(jìn)行兩個(gè)反應(yīng)： a、左外元的 3端成為 OH （環(huán)式磷酸二酯酶） 其 3 位為 OH， 2

48、 位為磷酸 b、第二個(gè)外元的 5端轉(zhuǎn)變?yōu)?磷酸基 （多聚核苷酸激酶） 因此 連接后還要切除第一個(gè)外元的 2 磷酸 這是 tRNA內(nèi)元拼接重要特點(diǎn)之一 前體 RNA 兩個(gè)半分子 進(jìn)行兩個(gè)連接反應(yīng) 成熟 tRNA 三、第 類內(nèi)元的拼接 特點(diǎn)： 拼接屬于自我拼接 形成明顯的二級(jí)結(jié)構(gòu) 1、 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： （ 1） 5 拼接點(diǎn)和 3 拼接點(diǎn) -U G 5 exon U intron G exon 3 （ 2） 有由保守序列形成的二級(jí)結(jié)構(gòu) a、 保守序列為 5 P Q R S 3 距拼接點(diǎn)很遠(yuǎn)，各 1012bp P與 Q互補(bǔ)、 R與 S互補(bǔ)而形成中部核心結(jié)構(gòu) b、 二級(jí)結(jié)構(gòu)中還包括內(nèi)元與外元的某一序列互補(bǔ)所

49、形成 的二級(jí)結(jié)構(gòu) 內(nèi)部引導(dǎo)序列（ interal guide sequence IGS）：內(nèi) 元中能與兩個(gè)拼接點(diǎn)邊界序列配對(duì)的一 段序列 # 第一類內(nèi)元的拼接依賴于以上二級(jí)結(jié)構(gòu) 為自我拼接的進(jìn)行提供活性位點(diǎn) 2、 拼接機(jī)制（以四膜蟲(chóng)的大 rRNA前體的拼接為例） （ 1） 兩種 rRNA轉(zhuǎn)錄在一條 35S的產(chǎn)物中， 26SrRNA 有內(nèi)元 5 U G 3 小 rRNA 大 rRNA（ 26S 有內(nèi)元） （ 2） 35SRNA體外有自我拼接的能力 反應(yīng)需要：一價(jià)和二價(jià)離子 鳥(niǎo)苷酸輔助因子（ GTP GDP GMP和 鳥(niǎo)嘌呤核苷） 不需能量的供給 （ 3） 拼接反應(yīng)后， G與內(nèi)元（ 414base

50、） 5端以磷酸二酯 鍵相連 （放射性標(biāo)記試驗(yàn)） （ 4） 具體的拼接過(guò)程 第一步： 游離 G發(fā)動(dòng)的轉(zhuǎn)酯反應(yīng) G 的 3-OH 攻擊內(nèi)元的 5拼接點(diǎn) G- 內(nèi)元、左外元（有游離 3OH） 第二步： 游離外元（左）發(fā)動(dòng)的轉(zhuǎn)酯反應(yīng) 左外元的 3-OH 攻擊 3拼接點(diǎn)，同時(shí)釋放 線狀的內(nèi)元 ,形成 成熟 RNA分子 兩次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)是緊密偶聯(lián)的 釋放出的內(nèi)元可繼續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)酯反應(yīng) 而形成環(huán)狀 （ 5） 自我拼接過(guò)程主要由轉(zhuǎn)酯反應(yīng)構(gòu)成，且完全由內(nèi)元自身 完成 -自我拼接的最大特點(diǎn) 轉(zhuǎn)酯反應(yīng)是 . 內(nèi)元自身能形成特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生適于拼接反 應(yīng)的構(gòu)象和活性位點(diǎn) ,在 G的參與下完成拼接反應(yīng) (內(nèi)部引導(dǎo)序列 )

51、這一機(jī)制如下圖所示 : 科羅拉多大學(xué) Cech等人完成（美） 活性位點(diǎn) 上節(jié)課內(nèi)容回顧 : 1、 pol(A)的生物學(xué)功能 2、 Euk.轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物內(nèi)元的去除 tRNA內(nèi)元的拼接 內(nèi)元的分類 拼接方式的種類 第類內(nèi)元的拼接： 結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 、拼接機(jī)制 3、內(nèi)元的催化功能 35SRNA前體拼接釋放的內(nèi)元（ 414base）進(jìn)行的自身轉(zhuǎn) 酯反應(yīng) （ 1）線狀分子自身環(huán)化能力及環(huán)化后的逆環(huán)化 A 16 （線性片段） U20 (線性片段 ) 逆 環(huán) 化 逆 環(huán) 化 （ 2） C 15: 逆環(huán)化 將 UUU加到 5端的能力 表明 : 該環(huán)形產(chǎn)物具有連接兩個(gè) RNA分子的能力 （ 3） L 19： 具有酶活性

52、即 Cech等人證明的 L 19 的 polyC 聚合酶活性 L 19 分子 L 19 分子 （ 4） 總結(jié)： a、 四膜蟲(chóng)的 35SRNA 的內(nèi)元有自身催化的性質(zhì) 即 - 將一處已有的磷酸二酯鍵轉(zhuǎn)變成另一處新的磷 酸二酯鍵，不需要額外的能量 因此： 內(nèi)元可以看作是 RNA重排酶（ RNA rearrangease） 或 RNA異構(gòu)酶（ RNA isomerase） 其中： 拼接反應(yīng)中，“酶” 和底物是同一個(gè)分子，且反應(yīng)后 變成了不同的分子 b、 L 19的 polyC 聚合酶活性進(jìn)一步表明 L 19 具有酶的 主要特征： 專一性強(qiáng) 加快反應(yīng)速度 反應(yīng)前后酶分子保持不變 人們稱這種由 RNA構(gòu)

53、成的酶為 - 核糖核酸酯酶（ ribozyme） 可簡(jiǎn)稱 R酶 四、第二類內(nèi)元的拼接 1、拼接點(diǎn)序列 7核苷酸的保守序列 （ Branch Site ） 3 拼接點(diǎn)上游 6bp 12bp 處 5-exon- GUGCG-B.S-Py AU -exon-3 供點(diǎn) 受點(diǎn) -Py Pu Py Py U A Py- 100% 在 Branch Site 的兩側(cè)存在一些短的序列， 與其上游 10-50Nt處互成 IR,形成莖環(huán)結(jié)構(gòu) (但 A 不包含在 IR序列內(nèi) , 從而被排除成芽狀突起） 5-GUGCG-PyPuPyPyUAPy-PyAU3 Intron IR IR 5 G AU 3 A 2、拼接機(jī)制

54、（ Splicing mechanism） Int ron IR IR A 5 G AU 3 Exon 1 Exon2 G A intron PyAU Matural RNA “Lariat” intron 套索狀內(nèi)元 轉(zhuǎn)酯攻擊位點(diǎn) intron OH AU 2 A 3 G 五、核基因 mRNA內(nèi)元的拼接 1、相關(guān)概念 Euk.的細(xì)胞中，有許多堿基數(shù)在 100 300之間 的 小分子 RNA,每個(gè)細(xì)胞有 105106個(gè) snRNA： 細(xì)胞核中的 （ snRNP） scRNA： 細(xì)胞質(zhì)中的 （ scRNP） 2、核 mRNA內(nèi)元拼接的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 內(nèi)元拼接與其他加工同時(shí)進(jìn)行 拼接點(diǎn)序列 Breath

55、nach-Chambon rule （ GU AG規(guī)則） 5-exon- GU-intron-AG -exon-3 供點(diǎn) 100% 94% 受點(diǎn) 7Nt branch site 3拼接點(diǎn)的上游 py X py U pu A py 3、拼接機(jī)制（ Splicing mehanism ) SnRNA (or ScRNA) 與拼接點(diǎn)序列間存在互補(bǔ)區(qū)域 并參與剪接 , 形成拼接體 ( spliceosome)。 Spliceosome 逐級(jí)組裝， SnRNA（ U1、 U2、 U5和 U4 U6） 分步替代 U1通過(guò)與 5拼接點(diǎn)互補(bǔ)而結(jié)合 U2識(shí)別并結(jié)合分支 點(diǎn) A U1和 U2作用使內(nèi)元的 5端和

56、3端帶到 一起（ U1與 3拼接點(diǎn)配對(duì)） U1、 U2、 mRNA與 U4 U5 U6復(fù)合物形成一個(gè)完整的拼接體 第一次轉(zhuǎn)酯左外元、內(nèi)元剪切套索 lariat 第二次轉(zhuǎn)酯 exons連接、套索狀內(nèi)元釋放 拼接體（ spliceosome） 解體與 lariat降解同步 第九節(jié) 不連續(xù)轉(zhuǎn)錄和反式拼接 Discontinuous transcription and Trans-splicing 順式拼接： 通過(guò)拼接將一個(gè) RNA分子的內(nèi)元拼接掉，使外元 連接在一起（ cis-splicing） 反式拼接： 發(fā)生在兩個(gè) RNA分子之間的拼接（ trans-spling） 一、不連續(xù)轉(zhuǎn)錄的發(fā)現(xiàn) 198

57、2 Vander Ploeg等人 研究錐蟲(chóng)的可變表面糖蛋白基因時(shí) 發(fā)現(xiàn) 在其 mRNA的 5端有 35個(gè) bases 是其基因中所沒(méi)有的 錐蟲(chóng)的全部 mRNA都含有這個(gè) 35bases 序列 稱其為前導(dǎo)序列（ leader sequence） 1、 前導(dǎo)序列 由位于基因組其它區(qū)域的連續(xù)重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄而來(lái) 200 copies左右 每個(gè)重復(fù)單位的 3端還有 100base 的一段序列 （內(nèi)元） 因此 一種完整 mRNA 的 前導(dǎo)序列 及 特異基因編碼的 mRNA序列 部分 的轉(zhuǎn)錄是 不連續(xù)的 每個(gè)重復(fù)單位的前導(dǎo)序列后面存在一個(gè)真核生物典型的 5拼接點(diǎn) GU 而完整 mRNA 的特異基因編碼的 mR

58、NA 序列的前面都 有一個(gè)保守的 3拼接點(diǎn) AG,以及分支點(diǎn) A 二、反式拼接 前導(dǎo)序列與特異基因編碼的 mRNA 序列部分形成成熟的 mRNA 的拼接方式屬反式拼接 1986 W. J. Marphy 和 R. E. Sutton 1、 前導(dǎo)序列的 3 區(qū)和 mRNA的 5區(qū)各相當(dāng)于一個(gè)內(nèi)元 的一半 2、 拼接過(guò)程形成 Y 型結(jié)構(gòu) 線蟲(chóng)的肌動(dòng)蛋白基因、植物葉綠體基因 本章內(nèi)容結(jié)束 名詞解釋 轉(zhuǎn)錄 啟動(dòng)子 RNA拼接 左、右拼接點(diǎn) 不連續(xù)轉(zhuǎn)錄 反式拼接 轉(zhuǎn)錄終止子 簡(jiǎn)答題 1、說(shuō)明 RNApol全酶各個(gè)亞基的主要功能。 2、以 E.coli為例，說(shuō)出 Prok.啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)及各部分功能。 3、以

59、 Prok.為例簡(jiǎn)述轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程。 4、終止子和終止密碼子有何區(qū)別？ 5、試述 Prok.中轉(zhuǎn)錄終止子的類型及終止機(jī)制。 6、解釋 E.coli的 噬菌體調(diào)控不同發(fā)育階段基因表達(dá)的抗終止機(jī) 制。 7、 簡(jiǎn)述內(nèi)元的種類及拼接方式 8、 說(shuō)明 tRNA內(nèi)元拼接的簡(jiǎn)單步驟和特點(diǎn)。 9、 tRNA基因的類型及各類型的前體在加工過(guò)程中所要解決的 問(wèn)題。 10、說(shuō)明 poly(A)在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用價(jià)值。 11、為什么在細(xì)菌（ Prok.）中很少涉及到 因子？ 12、 Euk.mRNA帽子的種類。 13、以四膜蟲(chóng)的大 rRNA前體的拼接為例，說(shuō)明第 類內(nèi)元拼接 的簡(jiǎn)單過(guò)程及特點(diǎn)。 15、綜合比較四種內(nèi)元拼接方式的異同。 16、解釋“套索結(jié)構(gòu)”，及內(nèi)元中的套索結(jié)構(gòu)中的磷酸二酯鍵有 何 特殊之處。 14、真核生物 mRNA的 3poly(A)的編碼情況及其準(zhǔn)確生成的機(jī)制 為何