離子交換法-zuihou
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1、1 第八章 離子交換法 (ion-exchange) 第一節(jié) 基本原理 離子交換法:利用溶液中 帶電粒子 與離子 交換劑之間 結(jié)合力 的差異進(jìn)行物質(zhì)分離的 操作方法。 帶電粒子與離子交換劑間的作用力是 靜電 力 。 電荷密度、電荷種類 2 離子交換劑 離子交換劑: 由惰性的不溶性載體 、 功能基團和平 衡離子組成 。 陽離子交換劑:平衡離子帶正電荷 。 陰離子交換劑:平衡離子帶負(fù)電荷 。 R-X+ + Y+ R-Y+ + X+ R-表示陽離子交換劑的功能基團和載體; X+ 為平衡 離子; Y+為交換離子。 3 吸附 選擇性吸附 : 調(diào)節(jié)溶液的 pH值, 使目的物帶 有相當(dāng)數(shù)量的靜電荷,而主要雜
2、質(zhì)離子帶相 反電荷或較弱的電荷。 選擇合適的樹脂(如陽離子交換樹脂),使 目的物被離子交換樹脂吸附,而雜質(zhì)較少被 吸附。 4 洗脫 ( 1) 調(diào)節(jié)洗脫液的 pH值 。 ( 2) 用高濃度的同性離子將目的物離子取 代下來 。 對陽離子交換樹脂而言,目的物的 pI值愈大 (愈堿),將其洗脫下來所需溶液的 pH值也 愈高。 5 離子交換樹脂吸附和洗脫過程 ( 1) X+為平衡離子, YH+及 Z+為待分離離子; ( 2) YH+和 Z+取代 X+而被吸附; ( 3)加堿后 YH+失去正電荷,被洗脫; ( 4)提高 X+的濃度取代出 Z+ 動畫 6 樹脂的選擇 pH大于等電點時 , 物質(zhì)帶負(fù)電荷 ,
3、與陰離子交換劑進(jìn)行交換; pH小于等電點時 , 物質(zhì)帶正電荷 , 可以與陽離子交換劑進(jìn)行交換 。 7 蛋白質(zhì)等電點與所用交換劑 8 離子交換技術(shù)的應(yīng)用 9 第二節(jié) 離子交換樹脂的結(jié)構(gòu)和種類 離子交換樹脂構(gòu)成: ( 1)惰性的不溶性高分子固定骨架,稱 載體 。 ( 2)與載體 共價鍵 連接的不能移動的活性基團, 又稱 功能基團 。 ( 3)與功能基團以 離子鍵 連接的可移動的活性離 子,亦稱 平衡離子 。 如聚苯乙烯磺酸型鈉樹脂 。 10 一、樹脂分類 陽離子交換樹脂 強酸型樹脂:磺酸型樹脂,功 能基團為磺酸根 ( SO3H)及甲 基磺酸根 ( CH2SO3H), 有好 的解離能力 。 中酸性樹
4、脂:磷酸型樹脂( PO3H2 ) 弱酸性樹脂:羧酸型樹脂和酚 型樹脂 ( COOH , ) , 在 酸性環(huán)境中解離度受到抑制 。 11 陰離子交換樹脂 強堿型陰離子交換樹脂: 弱堿型陰離子交換樹脂:活性基團為伯 、 仲 、 叔胺 基 。 在堿性環(huán)境中解離度受到抑制 。 中強堿性陰離子交換樹脂:兼有以上兩類活性基團。 12 離子交換樹脂功能基團的電離常數(shù) 13 離子交換樹脂的性能 14 兩性樹脂: 蛇籠樹脂 (snake-cage resins) Na+CI- 15 二、離子交換樹脂的命名: 強酸類 1 100號; 弱酸類 101 200; 強堿類 201 300; 弱堿類 301400; 中強
5、酸類 401 500 交聯(lián)度 :是合成載體骨架時交聯(lián)劑重量的百分?jǐn)?shù) , 用 “ ”將樹脂編號與交聯(lián)度分開 。 弱酸 101 4其交聯(lián)度為 4 。 國內(nèi)常用樹脂命名: 724; 732; 717 16 常用樹脂 724;弱酸陽離子交換樹脂 732;強酸陽離子交換樹脂 717;強堿陰離子交換樹脂 17 三、離子交換樹脂的骨架 (一)苯乙烯型離子交換樹脂 由 苯乙烯 與 二 乙烯苯 經(jīng)過氧 苯甲酰催化聚 合而成 。 交聯(lián)度 18 19 (二) 丙烯酸型離子交換樹脂 丙烯酸型陽離子交換樹脂:是由 丙烯酸甲酯 與 二乙烯苯 經(jīng)過氧苯甲酰催化聚合而成。 20 丙烯酸型陽離子交換樹脂 110樹脂: 丙烯酸甲
6、酯與二乙烯苯聚合而成。 724樹脂: 它是由甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲 酯和二乙烯苯三元共聚而得 。 21 (三)其它離子交換樹脂 蛇籠樹脂 : 脫鹽 螯形樹脂 :金屬離子 吸附樹脂 :“ 脫色樹脂 ” 熱再生離子交換樹脂: 22 第三節(jié) 離子交換動力學(xué) 一 、 離子交換平衡 R代表離子交換樹脂 , Z1及 Z2分別為交換離子 A1和 平衡離子 A2的價電數(shù) 。 23 尼科爾斯基方程式 用 m1、 m2及 C1、 C2分別代表樹脂上和溶液中 的兩種離子的濃度 。 數(shù)量關(guān)系可表示 : 尼科爾斯基方程式 K 1時 交換離子 A1比平衡離子 A2對樹脂有較大 的吸引力 24 二、離子交換速度 R B+
7、 + A+ R A+ + B+ 離子交換過程 : 1、 A+從溶液擴散到樹脂表面 。 2、 A+從樹脂顆粒表面擴散到顆粒中 心 。 3、 交換離子 A+ 與平衡離子 B+交換 。 4、 B+從交換中心擴散到顆粒表面 。 5、 B+ 再擴散到溶液中 。 25 粒子擴散 速度: 顆粒孔徑 、 顆粒半徑 、 樹脂交換容量 、 交換離子 A+的半徑與電荷 、 平衡離子的性質(zhì) ( 電荷 、 半徑 ) 。 26 離子交換速度的影響因素: 1、 樹脂粒度 :樹脂粒度大 , 交換速度慢 。 2、 攪拌速度 3、 樹脂交聯(lián)度 :交聯(lián)度大 , 交換速度低 。 4、 離子半徑和離子價 :離子每增加一個電荷 , 交換
8、速度下降一個數(shù)量級 。 5、 溫度 。 6、 離子濃度 :交換速度隨離子濃度的上升而加 快 。 27 三、離子交換動力學(xué) 交換離子被吸附,平衡離子被釋放。 交換帶 : 交換離子 A1由于被樹脂吸附,其 濃度從起始濃度 Co逐漸下降到 0的樹脂層。 交換帶窄: K 1 ; A1濃度?。涣魉俾?。 28 第四節(jié) 離子交換樹脂的性能 一 、 離子交換對樹脂的基本要求 二 、 影響樹脂性能的幾個因素 三 、 主要理化常數(shù)的測定 29 一、離子交換對樹脂的基本要求: 1、 有盡可能大的 交換容量 。 2、 有良好的 交換選擇性 。 3、 化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定 。 4、 化學(xué)動力學(xué)性能好 。 5、 物理性能好 。
9、 30 二、影響樹脂性能的幾個因素 1、 離子交換樹脂具有的 功能基團性質(zhì) 和 數(shù) 目 , 數(shù)目 是其交換容量的基礎(chǔ) 。 ( pH) 2、 樹脂的 交聯(lián)度 樹脂強度 、 交換選擇 性 、 動力學(xué)性質(zhì) 。 3、 樹脂骨架 和 平衡離子 。 31 pH對交換容量的影響 32 鈉型樹脂與氫型樹脂 偶極離子 RSO3-Na+ + H3+NRCOO - RSO3- H3+ NRCOO - +Na+ RSO3- H + + H3+NRCOO - RSO3- H3+ NRCOO H 鈉鹽樹脂 氫型樹脂 ,被取代的氫離子為羧基所固定,使被吸附 的氨基酸不能形成偶極,與樹脂之磺酸基沒有排斥力。 與鈉型樹脂相比,
10、 氫型樹脂 有較 大 的有效 交換容量 。 33 三、主要理化常數(shù)的測定 1、 含水量 :常用 干燥法和離 心法 測得 。 2、 膨脹度 :膨脹系數(shù) K膨脹 。 3 濕真密度樹脂充滿水時 的密度 。 4.交換容量 :meq/g 樹脂。 34 交換容量測定方法 陽離子交換樹脂 ( 氫型 ) 的測定方法:一定量 樹脂中加入 NaOH溶液 , 一天或數(shù)天后測定 NaOH剩余量 , 從 消耗的堿量 求交換容量 。 陰離子交換樹脂 ( 氯型 ) 的測定方法:一定量 樹脂裝柱 , 用過量 Na2SO4溶液進(jìn)行離子交換 , 測定 流出液中氯離子總量 , 求交換容量 。 35 滴定曲線: 36 滴定曲線 1
11、強酸樹脂 Amberlite IR-120; 2 弱酸樹脂 Amberlite IRC-84; 3 強堿樹脂 Amberlite IRA-400; 4 弱堿樹脂 Amberlite IR-45 強酸強堿樹脂有水平段 轉(zhuǎn)折點位置 功能團種類 交換容量隨 pH值變化 37 第五節(jié) 離子交換的選擇性 影響離子交換選擇性的因素: 離子價與離子水合半徑 離子價與離子濃度 交換環(huán)境 樹脂結(jié)構(gòu) 偶極離子排斥 38 一、離子的化合價與水合半徑的影響: 相對親和力 和相對濃度。 電荷效應(yīng)越強的離子與樹脂的親和力越 大,而決定電荷效應(yīng)的主要因素是 價電 數(shù)和離子半徑 。 39 一價陽離子親和力的次序是: H+Li
12、+ Na+ K+ NH4+ Ag+ 對 強堿性 樹脂陰離子親和力次序: F OH HCOO Cl Br I SO4 2- 對 弱堿性 樹脂陰離子親和力次序: F Cl Br =I =Ac SO4 2- OH 。 40 離子交換樹脂的性能 41 強酸強堿樹脂對各種離子的選擇系數(shù) H+Li+ Na+ K+ NH4+ Pb+ Cs+ Ag+ Ti+ 。 42 二、 離子化合價與離子濃度的影響: 設(shè)離子平衡后溶液中兩種離子的濃度比是定 值 P. C1/C2=P 在稀溶液 (C2較小 )中 , 樹脂吸附高價離子的 傾向很大 。 43 舉例 例如: 當(dāng) k=2 P=1 m1+m2=1 C2=0.1mol/
13、L Z2=1時 若 Z1=2 則 m1 0.9, m2 0.1 若 Z1=3 則 m1 0.97, m2 0.03 在較稀的溶液中,樹脂幾乎僅吸附高價離子。 44 三、交換環(huán)境的影響 1、 溶液的 pH: 解離度 、 交換容量 、 選擇性 。 2、 離子強度 : 交換容量 、 選擇性 、 交換速度 3、 有機溶劑 :能降低有機離子的解 離程度 。 45 四、樹脂結(jié)構(gòu)的影響 ( 一 ) 樹脂載體的交聯(lián)度 : 交聯(lián)度上升 , 膨脹度下降 , K值增大 , 樹 脂潛在的選擇能力提高 。 選擇性 的影響 , 膨脹度增大時 , K值減小 , 促使樹脂吸附量降低; 空隙大小 的影響 , 即膨脹度增大 ,
14、促使樹 脂吸附量增加 。 膨脹系數(shù)值很小時 , 空間效應(yīng)占主要地位 。 膨脹系數(shù)增大到一定值時,選擇性占主要 地位。 圖 8.14 磺酸基樹脂 吸附土霉素的量與樹 脂膨脹度之間的關(guān)系 46 膨脹度與選擇性的關(guān)系 甲基丙烯酸 丙烯酰胺樹脂 , 鏈霉素與鈉離子交換等溫線與樹脂膨脹度 的關(guān)系 1 膨脹系數(shù) 1.9; 2 膨脹系數(shù) 3; 3 膨脹系數(shù) 4.5; 4 膨脹系數(shù) 5.2; m1 樹脂對鏈霉素吸附量; C1, C2 溶液中鏈霉素和鈉離子濃度 47 ( 二 ) 輔助力 :離子交換樹脂與被吸附離子間的 作用力除靜電力外 , 還存在一種輔助力 。 無機離子交換常數(shù) K值多在 110之間 。 有機離
15、子交換時 , K值可高達(dá) 102103。 (三) 其它結(jié)合力:某些樹脂對金屬離子有特殊 的親和力。 羧酸型樹脂 48 五、偶極離子排斥作用: 偶極離子 RSO3-Na+ + H3+NRCOO - RSO3- H3+ NRCOO - +Na+ RSO3- H + + H3+NRCOO - RSO3- H3+ NRCOO H 鈉鹽樹脂 氫型樹脂 與鈉型樹脂相比, 氫型樹脂 有較 大 的有效 交換容量 。 49 氫型與鈉型磺酸基樹脂吸附氨基酸比較 50 第六節(jié) 離子交換操作方法 一 、 樹脂的選擇 目的物是弱酸性或弱堿性的 小分子 物質(zhì)時 , 宜選用強酸強堿樹脂 ( 氨 基酸的分離 ) 。 蛋白質(zhì)、
16、酶 和 其它生物大分子 的分 離多采用 弱堿或弱酸性樹脂 ,減少 生物大分子的變性,利于洗脫,提 高選擇性。 51 二、樹脂的處理和再生 1、 外觀特征 透明或半透明;顆粒圓整 , 粒度 均勻 , 強度 。 2、 樹脂的預(yù)處理 ( 1) 物理處理:去雜 , 過篩 。 ( 2) 化學(xué)處理 :用 8 10倍 的 1mol/L 鹽酸或氫氧化鈉溶液 交替浸泡 。 52 氨基酸分離前樹脂的處理 53 不同類型樹脂的處理 54 樹脂的再生 樹脂再生: 使用過的樹脂重新獲得使用性能的處理 過程 。 再生過程: ( 1) 去雜 , 大量水沖洗 , 除去物理吸附的雜質(zhì) 。 ( 2) 用酸 、 堿處理除去與功能基
17、團結(jié)合的雜質(zhì) 。 (3) 轉(zhuǎn)型: 55 三、基本操作方法 交換: 靜態(tài)交換 動態(tài)交換 洗脫方式:分靜態(tài)洗脫及動態(tài)洗脫兩種 , pH及離子強度改變 。 洗脫液: 酸、堿、鹽 。 56 酸、堿洗脫液 目的是改變 吸附物的電荷 或 改 變樹脂活性基團 的解離狀態(tài),以消除靜電結(jié) 合力,迫使目的物被釋放出來; 鹽類洗脫液 是通過高濃度的同種電荷的離子 與目的物 競爭 樹脂上的活性基團,使吸附物 游離。 57 洗脫方式 動態(tài)洗脫: 1、 溶液 pH及離子強度不變 。 2、 分階段改變?nèi)芤?pH及離子強度 。 3、 連續(xù)改變?nèi)芤?pH及離子強度 。 梯度洗脫 : 自動化的梯度儀 58 梯度洗脫 梯度混合器
18、: A瓶為低濃度鹽溶液 B瓶為高濃度鹽溶液 C=CA ( CA CB) VAA/AB 濃度梯度曲線 59 第七節(jié) 應(yīng)用實例 分離純化 氨基酸制備 無鹽水制備 60 氨基酸制備、分離 豬血粉水解制備 6種氨基酸 : 61 無鹽水制備 無鹽水制備是利用 氫型 陽離子交換樹脂和 羥 型 陰離子交換樹脂的組合以 除去水中所有的 離子 , 其反應(yīng)式如下: 62 無鹽水制備 陽離子交換樹脂用 強酸性 樹脂 , 陰離子交換樹脂可以用 強堿或 弱堿 樹脂 。 強酸 弱堿 或 強酸 強堿; 強酸 弱堿 強酸 強堿 ; 強酸 強堿 混合床 。 63 混合床 混合床系將陽 、 陰兩種樹脂混合而成 , 脫鹽效果好 。
19、 混合床中所發(fā)生的反應(yīng) : 64 混合床無鹽水 圖 8.20 混合床的操作 (a)為水制備時的情形; (b)為制備結(jié)束,用水逆流沖洗。 陽、陰樹脂根據(jù)比重不同分層,陽樹脂較重在 下面,陰樹脂在上面; (c)為上部、下部同時通入堿、酸再生,廢液自中間排出; (d)為再生結(jié)束,通入空氣,將陽、陰樹脂混合、準(zhǔn)備制水 65 混合床抗生素脫鹽 經(jīng)過第一柱 ( 陽樹脂 ) 時 , 溶液變酸 , 而經(jīng)過第二柱 ( 陰樹脂 ) 時 , 溶液又變 堿 。 鏈霉素脫鹽: 強酸 1 25和弱堿 311 4 樹脂組成混合床 , 脫鹽效果較好 。 66 第八節(jié) 新型離子交換劑 一 、 大孔 、 均孔樹脂 ( 一 ) 大
20、孔型離子交換樹脂 ( macro porous ,MP) ( 二 ) 均孔型離子交換樹脂 ( IR ) 二 、 多糖基離子交換劑 ( 一 ) 離子交換纖維素 (二) 葡聚糖凝膠離子交換劑 67 大孔型與凝膠型離子交換樹脂物理性質(zhì) 68 (一)大孔型離子交換樹脂的特征 ( 1) 載體骨架交聯(lián)度高 。 ( 2) 孔徑大 。 ( 3) 表面積大 , 表面吸附強 , 對大分 子物質(zhì)的交換容量大 。 ( 4) 孔隙率大 。 69 大孔型離子交換樹脂主要特性 70 國產(chǎn)大孔離子交換樹脂的命名 D113是大孔弱酸性丙烯酸系樹脂 D代表大孔型樹脂 第一位數(shù)字代表產(chǎn)品的分類 : 0 代表強酸性, 1代表 弱酸性
21、, 2代表強堿性, 3代表弱堿性 第二位數(shù)字代表不同的骨架結(jié)構(gòu) : 0代表苯乙烯系, 1代表丙烯酸系, 2代表酚醛系, 3代表環(huán)氧系等。 第三位數(shù)字為順序號,用以區(qū)別交聯(lián)劑等的差異。 71 國產(chǎn)大孔離子交換樹脂品種 72 (二) 均孔型離子交換樹脂 主要是 陰離子交換樹脂 。 骨架的交聯(lián)度比較均勻 。 代號為 IP或 IR。 交聯(lián)度均勻 , 孔徑大小一致 , 交換容 量都較高 , 膨脹度 、 機械強度好 。 73 二、多糖基離子交換劑 生物大分子對離子交換的要求 : 固相載體具有 親水性 和較大的 交換空間 ; 對其生物活性有穩(wěn)定作用,并便于洗脫。 生物來源穩(wěn)定的高聚物 多糖作載體。 多糖基離
22、子交換劑可以分為: 離子交換纖維素 葡聚糖離子交換劑 74 (一)離子交換纖維素 特點: (1)開放的長鏈骨架, 親水性強 ,表面積大,易 吸附大分子 。 (2)交換 基團稀疏 ,對大分子的實際交換容量大。 (3)吸附力弱, 交換和洗脫條件緩和 ,不宜變性。 (4)分辨率高。 75 常用的離子交換纖維素 羧甲基纖維素( CM-C): 弱酸性陽離子交換纖維素, pK=3.6 。 二乙基氨基乙基纖維素 ( DEAE-C):強堿型陰離 子交換纖維素, pK=9.1。 76 77 離子交換纖維素的制備 78 操作注意點 可靜態(tài)交換,也可動態(tài)交換。 交換基團密度低、吸附力弱。 鹽濃度不宜高 (控制在 0
23、.0010.02 mol/L) 。 79 離子交換纖維素的選擇 解離曲線 80 離子交換纖維素的解吸 洗脫緩和 。 升高環(huán)境的 pH、降低 pH或是增加離子強度都能將 被吸附物質(zhì)洗脫下來。 81 思考題 請以 DEAE-C為例說明離子交換纖維素分離 純化蛋白質(zhì)時的洗脫方法有哪些?并說出各 種方法的洗脫原理。 82 思考題 83 離子交換纖維素的處理和再生 酸堿濃度要適當(dāng)降低 , 處理時間也從 4h縮短 為 0.31h。 以交換緩沖液平衡 。 注意: 不耐酸,用酸處理的濃度和時間須小心控制。 84 (二) 葡聚糖凝膠離子交換劑 是將 活性交換基團 連接于 葡聚糖凝膠 上制成的各種 交換劑 。 命
24、名 : 交換活性基團 -Sephadex C (A)-編號。 具有 離子交換和分子篩 的雙重作用,對生物分子有 很高的分辨率。 85 常用離子交換葡聚糖 86 瓊脂糖凝膠離子交換劑 瓊脂糖凝膠上引入功能基 DEAE sepharose CL-6B CM sepharose CL-6B DEAE Toyopearl CM Toyopearl 87 多糖基離子交換劑應(yīng)用 尿激酶分離純化 88 L-門冬酰胺酶 (L-asparaginase) 能專一地水解 L-門冬酰胺生成 L-門冬氨酸和氨。 外源門冬酰胺被降解,蛋白質(zhì)合成過程中氨基酸的 缺乏,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡。 L-門冬酰胺酶是一種重要的抗腫瘤
25、藥物。 大腸桿菌能產(chǎn)生 2種天冬酰胺酶,即 L-門冬酰胺酶 和 L-門冬酰胺酶 。 重組 L-門冬酰胺酶 pI為 4.85。 89 重組門冬酰胺酶 的純化 90 離子交換劑 弱酸 陽離子交換 樹脂 724 強酸 陽離子交換 樹脂 732 強堿 陰離子交換 樹脂 717 D113 大孔弱酸性丙烯酸系樹脂 CM-C DEAE-C CM-Sephadex C DEAE-Sephadex A 91 第九節(jié) 離子交換聚焦色譜 色譜聚焦 ( chromatofocusing) : 是一種高 分辨的新型的蛋白質(zhì)純化技術(shù) 。 是根據(jù)蛋白 質(zhì)的等電點 , 結(jié)合離子交換技術(shù)的大容量色 譜 , 能分離幾百毫克蛋白質(zhì)
26、樣品 , 洗脫峰被 聚焦效應(yīng)濃縮 , 分辨率高 。 適用 水溶性的兩性分子 ,如蛋白質(zhì)、酶、多 肽、核酸等。 92 一、色譜聚焦的原理 ( 一 ) 自動形成 pH梯度 。 ( 二 ) 蛋白質(zhì)的色譜行為 (三) 聚焦效應(yīng) 93 PH梯度溶液的形成 在 聚焦層析 中,當(dāng) 洗脫液流進(jìn) 多緩沖 交換劑 時,由于交 換劑帶有緩沖能力 的電荷基團,故 PH梯度溶液可以 自動形成 。 94 PBE94柱聚焦色譜的 pH梯度 ( 1) 柱內(nèi)每點的 PH 值從高到低逐漸下降 。 ( 2)從層析柱頂部到 底部就形成了 PH6 9 的梯度。 ( 3) PH梯度會逐漸 向下遷移。 ( 4) 底部流出液的 PH由 9逐
27、漸降至 6。 95 蛋白質(zhì)的色譜行為 當(dāng)柱中 PH低于蛋白質(zhì)的 PI時 , 蛋白質(zhì)帶 正電荷 , 不與陰離 于交換劑結(jié)合 ,隨洗脫液向下移動 。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)移動至環(huán)境 PH高于其 PI時 , 蛋白質(zhì) 由帶正電荷變 為帶負(fù)電荷 , 并與 陰離子交換劑結(jié)合 。 由于洗脫劑的通過 , 蛋白質(zhì)周圍的環(huán)境 PH 再次低于 PI時 , 它又帶 正電荷 , 并 從交換劑解吸下來 而下降 。 移至 pH大于 PI時又重新結(jié)合 , 直至蛋白質(zhì)從柱下流出 。 不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點 , 在被離子交換劑結(jié)合以前 , 移動距離 是不同的 , 洗脫出來的先后次序是按等電點排列的 。 96 聚焦效應(yīng) 當(dāng)一種蛋白質(zhì)在柱上
28、隨洗脫液下移 至等電點處時,移動速度明顯減慢。 此時加上 相同 的 第二個樣品 ,它將 以洗脫液移動的速度下降,直至追 到正在慢移的第一個樣品( 聚焦 )。 如果加入的第二個樣品的等電點比 第一個樣品高,它可以越過第一個 樣品區(qū)先被洗脫出來。 97 二、多緩沖劑 多緩沖劑是一種兩性電解質(zhì)緩沖劑,是 分子 量大小不同的多種組分的多羧基多氨基化合 物 。 Polybuffer96 PBE94 Polybuffer74 PBE94 98 三、多緩沖交換劑 PBE94是以 交聯(lián)瓊脂糖 6B( Sepharose 6B) 為載體 , 并在糖基上通過醚鍵偶合上配基制成的 多緩沖交換劑 , 是 陰離子交換劑
29、 。 當(dāng) Polybuffer96流進(jìn)多緩沖交換劑時 , PH梯度 溶液可以自動形成 ( 9 6) 。 99 四、操作步驟 (一)凝膠和緩沖劑的選擇 PBE94 Polybuffer96 PBE94 Polybuffer74 pH間隔為 3個單位。 pH范圍應(yīng)包含要分離樣品各組分等電點 , 并使其有 2/31/2柱長的吸附解吸時間。 100 (二)凝膠柱的準(zhǔn)備 ( 1) 凝膠按 1 1懸浮于 起始緩沖液 中 , 除氣泡 。 ( 2) 在柱中放 23ml起始緩沖液 , 攪拌下緩緩倒 入 。 ( 3) 打開柱底部開關(guān) , 待凝膠沉降后將柱頂部接 頭裝好 。 ( 4) 用 1015個柱床體積 起始緩
30、沖液平衡 。 101 (三)、樣品的準(zhǔn)備 100mg蛋白質(zhì) /10ml床體積。 樣品體積不超過 0.5個床體積 。 102 (四)、上樣和洗脫 樣品均勻平整地加到床面上; 上樣前應(yīng)先加 5ml洗脫液 。 用洗脫緩沖液淋洗 , pH梯度自動形成 。 梯度的 pH上限由起始緩沖液確定 , 其 下限由淋洗緩沖液的 pH決定 。 103 去除多緩沖劑的方法 ( 1) 沉淀法 ( 2) 凝膠過濾 ( 3) 親和色譜法 ( 4) 疏水色譜法 104 多緩沖離子交換劑的再生 多緩沖交換劑的再生可以在柱上進(jìn)行。 用 23個床體積的 1mol/L NaCl淋洗。 用 0.1mol/L HCl洗滌。 105 10
31、6 五、應(yīng)用實例 -蛋白質(zhì)模擬混合物分離 PBE94柱 ,床高 15cm。 樣品 :4ml洗脫緩沖液含有馬肌 紅蛋白 , 碳酸酐酶和白蛋白 . 起始緩沖液 :0.025mol/L咪唑 HCl, pH7, 洗脫緩沖液 :多緩沖劑 74, pH4。 107 離子交換劑 弱酸 陽離子交換 樹脂 724 強酸 陽離子交換 樹脂 732 強堿 陰離子交換 樹脂 717 D113 CM-C DEAE-C CM-Sephadex C DEAE-Sephadex A ? -Sepharose A ( 聚焦色譜 PBE94 ) 108 思考題 1、 影響樹脂性能的因素有離子交換樹脂具有的 、 和 。 2、 寫出
32、下列離子交換劑類型: 732 , 724 , 717 , D113 ,CM-C ,DEAE-C , PBE94 。 3、 在采用多緩沖陰離子交換劑作固定相的離子交換聚焦色譜過程中 , 當(dāng) 柱中某位點之 pH值下降到蛋白質(zhì)組分 值以下時 , 它因帶 正電荷而 , 如果柱中有兩種蛋白組分 , pI值較 者會 超過另一組分 , 移動至柱下部 pH較 的位點進(jìn)行 。 4、 影響離子交換選擇性的因素主要有 、 、 、 、 等 。 5、 用鈉型陽離子交換樹脂處理氨基酸時 , 吸附量很低 , 這是因為 ( ) A. 偶極排斥 B.離子競爭 C. 解離低 D. 其它 6、 在尼柯爾斯基方程式中 , K值為離子交換常數(shù) , K 1說明樹脂對交 換離子吸引力 ( ) 。 A. 小于平衡離子 B.大于平衡離子 C. 等于平衡離子 D. 其它
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