重組蛋白的表達系統(tǒng)(詳細版)（醫(yī)學研究）

重組蛋白表達系統(tǒng)1.原核表達系統(tǒng)2.酵母表達系統(tǒng)3.昆蟲細胞表達系統(tǒng)4.哺乳動物細胞表達系統(tǒng)5.轉基因植物表達系統(tǒng)6.轉基因動物表達系統(tǒng)7.表達系統(tǒng)的選擇1醫(yī)藥材料一、原核表達系統(tǒng)原核表達系統(tǒng)發(fā)展完善、流程簡單快速、成本低、產(chǎn)量高，對大部分蛋白來說都值得一試，尤其適宜于表達原核來源的以及不需要翻譯后修飾的真核蛋白。2醫(yī)藥材料1.1 表達菌株表達菌株原核表達系統(tǒng)剛用的宿主菌有E.coli，Bacillus等。其中革蘭式陽性的Bacillus更適宜在其周質(zhì)空間分泌表達重組蛋白；革蘭氏陰性的E.coli能夠廣譜表達異源蛋白。大腸桿菌表達系統(tǒng)是目前發(fā)展最完善的重組蛋白表達系統(tǒng)。常用大腸桿菌菌株有BL21（DE3）、BL21（DE3）Star、B834（DE3）等，這些菌株都敲除了蛋白酶，并溶源了噬菌體DE3。DE3是的一種衍生噬菌體，帶有噬菌體21抗性區(qū)和 lacI基因，lacUV5啟動子，以及 T7 RNA聚合酶基因。這一區(qū)段被插入int基因，因此阻止了DE3在沒有輔助噬菌體時整合到染色體上或從染色體切出。一旦形成DE3溶原狀態(tài)，就只有受IPTG誘導的lacUV5啟動子指導T7 RNA聚合酶基因轉錄，在溶原培養(yǎng)體系中加入IPTG誘導T7 RNA聚合酶生產(chǎn)，繼而質(zhì)粒上的目的DNA開始轉錄。同時，還有一些特殊設計的菌株以表達有特殊需要的重組蛋白，如甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型表達硒代甲硫氨酸蛋白，溶解性增強的菌株表達毒性蛋白，補充了稀有密碼子的菌株表達真核蛋白等，表2給出了常用的大腸桿菌表達菌株。3醫(yī)藥材料表2 常用E.coli表達菌株4醫(yī)藥材料1.2 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體大腸桿菌表達系統(tǒng)采用質(zhì)粒為表達載體，質(zhì)粒上的重要元件包括復制子，啟動子，終止子，多克隆位點，信號肽，融合標簽，篩選標記等（圖1）。原核表達載體已經(jīng)發(fā)展得比較完善，有多種質(zhì)?？晒┻x擇(表4)。復制子：復制子決定著質(zhì)粒載體在宿主中的拷貝數(shù)。通常情況下質(zhì)粒拷貝數(shù)越高，重組蛋白的表達量就越高，但是高拷貝的質(zhì)粒也會嚴重影響宿主的生長，質(zhì)粒本身也不穩(wěn)定，容易丟失和突變?？寺≥d體常采用拷貝數(shù)低、嚴謹復制的復制子，如pSC101；表達載體通常選用高拷貝的復制子，如pCoE1，pMBI（pUC），等。如果需要進行多個質(zhì)粒的共轉化，就要根據(jù)復制子的相容性選用不同復制系統(tǒng)的復制子，如pSC101和pUC共表達。5醫(yī)藥材料啟動子：表達重組蛋白時，我們需要考慮啟動子的強弱、作用方式、調(diào)控方式和本底表達水平。表達載體通常選用強啟動子以提高表達量，但弱啟動子也有其優(yōu)點，如降低本底表達、增加可溶表達、表達小量伴侶蛋白等。按照作用方式，啟動子可以分為兩類：組成型表達的啟動子使宿主不停地表達重組蛋白，常用于工業(yè)生產(chǎn)，如S等；誘導型表達的啟動子使宿主僅在受到誘導（誘導劑、溫度等）時表達目的蛋白，誘導型啟動子使重組蛋白的表達容易控制，同時降低了外源蛋白對細菌生長的影響。6醫(yī)藥材料圖1：大腸桿菌表達質(zhì)粒pET-22b(+)圖譜及多克隆位點7醫(yī)藥材料8醫(yī)藥材料早期大腸桿菌表達體系中，常見的啟動子是lac和lacUV5。lac是一個弱啟動子，很難使外源基因得到高表達。目前使用的含有需要小量共表達的蛋白(如分子伴侶，蛋白抑制劑等)的載體，有很多都采用了經(jīng)典的lac啟動子。強啟動子中，tac和trc是lac啟動子的變體，其重組蛋白產(chǎn)率能夠達到細胞總蛋白量的15-30%。araBAD啟動子的誘導劑是便宜無毒的L-阿拉伯糖，本底表達量低，啟動能力比tac稍弱。T7則是目前原核表達系統(tǒng)中最高效的啟動子，pET表達系統(tǒng)即是以它為中心構建的。T7啟動子來源于噬菌體，專一與T7啟動子結合的T7 RNA聚合酶則被整合在宿主菌的基因組中。在噬菌體溶源的表達宿主菌，如BL21（DE3）中，lacI抑制T7 RNA聚合酶的表達，IPTG的加入可以解除這種抑制。當受到誘導時，T7 RNA聚合酶開始表達并結合在T7啟動子上，啟動重組蛋白的表達。T7 RNA聚合酶活性很高，轉錄速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍，使其下游的重組蛋白得到高效表達，其產(chǎn)率可以達到細菌總蛋白量的50%以上。T7lac啟動子則在T7啟動子下游加入了一個lac操縱子，其中帶有一個常規(guī)啟動子和lac阻遏蛋白的編碼序列。lac阻遏蛋白可以抑制宿主合成T7 RNA聚合酶，并阻斷T7 RNA聚合酶導致的目的基因轉錄，從而降低重組蛋白的本底表達水平。PL、cspA啟動子使宿主菌能夠進行溫度依賴型的表達。在溫度敏感型突變體菌株中，PL等啟動子使得宿主在30時抑制重組蛋白表達，而在42 時誘導重組蛋白表達；cspA啟動子則被高溫（37）抑制，低溫（10）啟動。溫度誘導型的啟動子避免了誘導劑的引入，降低了使用成本，同時也降低了誘導劑對細胞的傷害。9醫(yī)藥材料終止子：轉錄終止子按照是否依賴和不依賴因子的作用分為兩類，這兩類終止子均在終止點前含有一段7-20bp的回文序列。終止子可以保護mRNA在核外不被降解，顯著延長mRNA的壽命，由此提高重組蛋白的表達量。但是對于T7系統(tǒng)來說，由于T7 RNA聚合酶效率極高，宿主中隨時都有充足的mRNA以供翻譯，因此大部分在T7系統(tǒng)中表達的重組蛋白并不在意質(zhì)粒上是否有終止子，只有一些自身帶有翻譯起始信號的外源基因需要終止子。啟動子受細胞類型的限制，在不同的細胞系中有很大不同，因此需根據(jù)宿主細胞（尤其是真核宿主）的類型選擇不同的啟動子以便于目的基因的高效表達。10醫(yī)藥材料融合標簽：融合標簽是與目的蛋白共表達的一段多肽，方便重組蛋白的純化、固定和檢測，表3給出了常用的重組標簽。如果不需要對重組蛋白進行純化，盡量不要引入融合標簽，以免影響蛋白性質(zhì)；如果重組蛋白本身能夠結合某種親和柱，如某些金屬結合蛋白可以結合Ni-NTA，某些糖結合蛋白能夠特異識別糖類，也不必引入標簽。融合標簽的引入能夠大大簡化重組蛋白的純化流程，并提高蛋白溶解度。商業(yè)化表達質(zhì)粒，如pET、pGEX等提供了各種純化標簽和融合蛋白供選，應根據(jù)蛋白具體情況進行選擇。His-tag是最常用的純化標簽，它具有很多優(yōu)點：標簽較短（10-20個氨基酸殘基），不帶電（pH8.0），免疫原性差，通常不影響重組蛋白的結構和功能，Ni2+親和力高，能夠通過一步純化達到60%-90%的純度。如果蛋白質(zhì)溶解度不高，導致折疊困難、表達量低，可以選擇較大的融合標簽（GST、MBP、Trx等）幫助重組蛋白表達和折疊，提高重組蛋白溶解度，從而提高表達量。較大的融合標簽有時也會導致翻譯困難甚至提前中止，純化后發(fā)現(xiàn)大部分都是標簽蛋白也是常見現(xiàn)象。翻譯的提前中止會大大影響重組蛋白產(chǎn)率和后續(xù)純化，所以在短標簽能夠達到目的的時候，盡量不要選擇大的融合標簽。標簽位置的選擇也很重要：N端標簽（短的或長的）自身帶有啟動子和適應宿主偏好的密碼子，可以幫助目的蛋白表達，提高表達量，但是提前中止翻譯的蛋白片段也會被一并純化出來，降低重組蛋白純度，對蛋白酶敏感的、自身容易降解的以及一級序列中有集中的疏水殘基區(qū)的蛋白尤其要避免使用N端標簽；C端標簽則可以保證只有完整蛋白得到純化。另外，如果蛋白的近N端或近C端有重要功能區(qū)，如酶活中心、配體結合位點、二硫鍵、多聚體穩(wěn)定界面、相互作用界面等，則要避免純化標簽位于該末端，以免影響重組蛋白的結構和功能。如果融合標簽對蛋白性質(zhì)有較大影響，但又是純化所必須的，就可以考慮在純化過程中去除標簽。主要有三種方法：化學裂解，如溴化氰（CNBr）、羥胺（NH2OH）等，能夠簡單有效地去除標簽，但反應條件苛刻（羥胺需要在pH9.0下反應），特異性較差，而且會引入不必要的修飾，除包含體蛋白的處理外已經(jīng)很少使用了；酶解，如PPase等，其底物一般是一段比較長的肽鏈，特異性強，是目前比較常用的方法，缺點是酶切反應需要較長的時間，也增加了蛋白純化的步驟，使純化變得繁瑣；IMPACT質(zhì)粒，該質(zhì)粒在純化標簽和目的蛋白之間插入了一個蛋白質(zhì)內(nèi)含子（intein），intein具有可誘導的自切割活性，使用IMPACT質(zhì)粒表達的重組蛋白，只需要改變緩沖液的pH和溫度，即可切掉融合標簽。11醫(yī)藥材料表3：常用融合標簽12醫(yī)藥材料篩選標記：在沒有壓力的環(huán)境下培養(yǎng)時，細菌中的外源質(zhì)粒常常隨著細胞復制而丟失。為了穩(wěn)定質(zhì)粒、表達重組蛋白，需要在載體中加入篩選標記，使宿主菌在原則壓力下生長。原核系統(tǒng)中，常見的篩選標記有藍白斑篩選（主要用于克隆）、營養(yǎng)缺陷性篩選和抗生素篩選，也可以將幾種篩選手段混合起來使用。常見的抗生素篩選標記有：青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性、四環(huán)素抗性等。氨芐青霉素由于會被抗性細菌分泌的-內(nèi)酰胺酶和酸性環(huán)境破壞掉，其篩選效果會隨時間降低，不適宜連續(xù)發(fā)酵，將抗性基因反轉或換用對低pH不敏感的羧芐青霉素可以部分解決這個問題；卡那霉素不會被破壞，抗性較強，但是不同菌株的抗性差異較大，平板培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)液有所不同，使用時常需要針對個別菌株摸索適宜濃度；氯霉素抗性常見于有特殊用途的菌株和質(zhì)粒，如pLysS。抗生素濃度的過高或過低都會降低重組蛋白的表達量，另外在使用多個載體進行共表達時，應注意不同的質(zhì)粒要攜帶不同的篩選標記，抗生素濃度也要比單獨表達適當降低。分泌表達：如果不希望重組蛋白表達在細胞質(zhì)中，可以在重組蛋白的N端加入信號肽，引導蛋白穿越細胞膜。大腸桿菌的分泌表達一般是分泌到周質(zhì)空間，各種芽孢桿菌則可以分泌到培養(yǎng)基中，簡化純化流程。分泌表達的表達量通常遠遠低于胞質(zhì)表達，但是也有其優(yōu)勢：跨膜過程可以幫助重組蛋白折疊，提高其溶解性和活性；周至空間和培養(yǎng)基的氧化環(huán)境能夠幫助二硫鍵形成；也可用于除去牢固結合在蛋白上的配體；分泌到細胞外還能降低有毒重組蛋白對細胞的影響。13醫(yī)藥材料表4：常用原核表達載體質(zhì)粒14醫(yī)藥材料1.3 優(yōu)化表達條件優(yōu)化表達條件重組蛋白的表達流程很少有一次成形的，為了提高蛋白表達量、改善蛋白質(zhì)量，表達條件和流程的優(yōu)化是必須的。當重組蛋白不表達時：如果重組蛋白不表達（包含體和可溶蛋白都沒有），首先檢查cDNA和質(zhì)粒是否正確，蛋白對宿主菌是否有很大毒性，然后嘗試更換菌株、質(zhì)粒載體和融合標簽。原核蛋白在大腸桿菌中不能表達的情況很少見，通常是真核蛋白不能表達。不能表達的重組蛋白，即使在更換了宿主、載體后可以表達，表達量也不會很高，如果需要大規(guī)模生產(chǎn)，最好嘗試酵母和昆蟲細胞表達系統(tǒng)。當表達量不理想時：檢查密碼子構成，使其適應宿主菌的密碼子偏好。稀有密碼子，尤其是位于重組蛋白N端的和大量集中的稀有密碼子，會降低mRNA穩(wěn)定性，顯著降低翻譯速度，引起翻譯提前中止、翻譯移碼和突變。將這些稀有密碼子（尤其是N端?。┩蛔?yōu)樗拗髌玫拿艽a子，能夠顯著提高表達水平，必要時可以根據(jù)宿主的偏好重新合成cDNA。另一個解決辦法是與能夠表達稀有tRNA的質(zhì)粒共表達或直接采用帶有該質(zhì)粒的宿主菌，如BL21 codon plus、Rosetta等。更換菌株容易引起一系列問題，如啟動子相溶性、額外的抗生素抗性等，使用時要多加注意。15醫(yī)藥材料檢查外源基因cDNA5端結構，高GC含量、回文結構和相距較近的兩個起始密碼子會阻礙轉錄起始，表達量不理想時應予以去除；檢查終止密碼，mRNA的通讀會降低重組蛋白的質(zhì)量和穩(wěn)定性。不同終止密碼子的終止效率在不同的物種中有很大差異，酵母和哺乳動物偏愛UAA和UGA，昆蟲和大腸桿菌傾向于用UAA；終止密碼子3端緊鄰的堿基也會影響終止效率，對于UAG來說，終止效率U、ACG，其他終止密碼GU、AC；也可以多加一個終止密碼子，以確保翻譯在正確的位點結束。改變?nèi)诤蠘撕灥奈恢茫琋端的標簽可以幫助翻譯起始，從而提高蛋白的表達量?？扇鼙磉_低時：錯誤折疊是引起重組蛋白可溶表達量低，包含體表達量高的一個重要原因。改善重組蛋白折疊的方法有：降低誘導后培養(yǎng)溫度。重組蛋白表達得越慢，其折疊效果就越好，大腸桿菌在4時依然可以表達重組蛋白，而將培養(yǎng)溫度降低至25-30就能顯著改善蛋白折疊。此方法不適用于溫度誘導的重組蛋白表達；減少誘導劑。誘導劑濃度可以降低至1/10；選用Lac滲透酶缺陷型菌株，如Tuner、Rosetta等，也有很好的效果。這類菌株能夠使進入每個細胞的誘導劑濃度相同。重組蛋白在所有細胞中的表達水平相當時，減少誘導劑的效果更好；增加一個融合標簽，或者更換一個分子量更大的標簽。一般來說，越大的融合標簽在提高重組蛋白溶解度方面效果越好，如MBP、GST的效果要優(yōu)于His6標簽。以改善溶解度為目的的融合標簽最好放置在目的蛋白的N端；改善二硫鍵的形成。大腸桿菌細胞內(nèi)的還原環(huán)境會阻礙二硫鍵的形成，如果要表達有一對或多對二硫鍵、特別是需要二硫鍵來穩(wěn)定分子內(nèi)和分子間結構的重組蛋白，最好選用經(jīng)過特別設計的載體和菌株，如pET39b(+)和pET40b質(zhì)粒、BL21trxB，Origami和Rosetta-gami菌株。也可以考慮將蛋白分泌至周至空間，利用周至空間的氧化環(huán)境和酶來幫助二硫鍵的形成；只表達蛋白的可溶片段。16醫(yī)藥材料可溶片段突變體與全蛋白之間經(jīng)常有很大差異，如等電點、抗原性、寡聚狀態(tài)、活性、細胞定位等，突變時一定要謹慎考慮；突變掉可能引起順反異構的Pro。順反異構伴隨著很高的能量躍遷，是蛋白折疊的能量壁壘。突變掉這樣的Pro可以顯著幫助重組蛋白折疊，但是同樣會改變蛋白性質(zhì)，要謹慎考慮；與分子伴侶和折疊酶共表達。微量的分子伴侶即可顯著改善重組蛋白的折疊狀況，與重組蛋白同源的分子伴侶效果更加明顯。引入分子伴侶同樣也會引起復制子相容性、額外的抗生素抗性等問題，常用的分子伴侶有ATP依賴的DnaK-DnaJ-GrpE和GroEL-GroES，以及定位于周質(zhì)空間的分子伴侶SurA、PpiD等。折疊酶可以幫助蛋白跨過折疊過程的能量壁壘，使重組蛋白更快更好的折疊；在重組蛋白N端加入信號肽，將其引導至周質(zhì)空間，用跨膜過程來幫助蛋白折疊和二硫鍵形成，并減輕蛋白降解；在培養(yǎng)基中加入重組蛋白的配體或底物類似物。配體結合，有時僅僅是配體的存在就能大幅度的改善蛋白的折疊和穩(wěn)定性，此法不適用于無法被細菌攝取的配體；如果是多個蛋白共表達，可以考慮用一段柔軟的linker將兩個蛋白連接起來，使溶解度好的蛋白幫助溶解度差的蛋白折疊；改善蛋白穩(wěn)定性。能夠引起蛋白降解的因素很多，從蛋白自身性質(zhì)到宿主性質(zhì)不一而足，如果重組蛋白在表達時就被降解，表達量和穩(wěn)定性就會受到很大影響。在大腸桿菌中表達重組蛋白，需要牢記N端法則：當N端第二個殘基是Leu、Arg、Lys、Phe、Tyr和Trp時，重組蛋白半衰期只有2分鐘，而小側鏈的氨基酸殘基，如Ala，則可以提高蛋白穩(wěn)定性。因此在設計載體時，要特別注意第二個密碼子，避免上述殘基的出現(xiàn)。17醫(yī)藥材料處理高毒性蛋白：外源基因的表達對大腸桿菌總有或多或少的影響，一般來說，經(jīng)過改造的宿主可以在很大程度上容忍重組蛋白，重組蛋白可以占到細胞總蛋白量的50%或更高。但少數(shù)毒性極高的重組蛋白，其本底表達就會殺死原核宿主，質(zhì)粒容易丟失，使其在大腸桿菌中很難得到高表達。以下方法可以降低重組蛋白的本底表達量。在培養(yǎng)基中加入1%的葡萄糖。葡萄糖是大腸桿菌的第一碳源，它的存在可以顯著降低由其他碳源引起的本底表達。采用嚴格啟動的載體和宿主。如PBAD載體、pLacI宿主。采用低拷貝數(shù)的載體。降低表達載體質(zhì)粒的拷貝數(shù)，可以明顯降低基礎表達水平。如pETcoco載體在每個細胞中僅一個拷貝，而受到IPTG誘導時又可以高效表達重組蛋白。采用可表達T7溶菌酶的宿主。T7溶菌酶是T7RNA聚合酶的抑制劑，采用含有T7溶菌酶質(zhì)粒的宿主，如pLysS，可以降低重組蛋白在大腸桿菌快速生長期的本底表達量，在受到IPTG誘導時也能較好的表達蛋白。除此之外，也可以通過共表達重組蛋白的抑制劑、提高抗生素濃度等方法提高毒性蛋白的表達量。18醫(yī)藥材料1.4 包涵體表達：包涵體表達：在使用高效的E.coli表達系統(tǒng)時，過量表達的重組蛋白常會在細胞內(nèi)凝聚，形成無活性的包涵體沉淀。在早期實驗中，包涵體被認為是重組蛋白表達的大敵：包涵體蛋白折疊混亂、二硫鍵配對混亂、沒有生物活性、變復性條件需要長時間摸索等，即使包涵體蛋白成功復性，其均一性和活性依然備受質(zhì)疑。但是包涵體表達也有其優(yōu)勢：能夠很輕松的獲得超高的表達量，不可溶的重組蛋白不會被宿主內(nèi)的蛋白酶降解，重組蛋白的毒性被大大抑制，雜蛋白含量低（10%），容易純化等。由于這些優(yōu)點以及蛋白質(zhì)復性條件的不斷發(fā)展，表達包涵體蛋白逐漸為人們所接受，成為重組蛋白表達的一個常用方案。與可溶蛋白相反，提高培養(yǎng)溫度、延長培養(yǎng)時間、在較高的菌密度下誘導都有利于包涵體的形成；在破菌和變性溶解時加入還原劑能夠打開錯配的二硫鍵；在復性液中加入二硫鍵異構酶、脯氨酸異構酶、分子伴侶和蛋白的輔助因子可以幫助重組蛋白折疊；精氨酸和高分子量PEG能減輕蛋白分子的聚集；嘗試多種物理手段，如透析、快速稀釋和柱上復性等，有時對復性有奇效。包涵體的表達相對簡單，但其復性過程仍是依賴經(jīng)驗的，沒有通用的方法可以套用。19醫(yī)藥材料2.酵母表達系統(tǒng)酵母表達系統(tǒng)酵母表達系統(tǒng)兼有原核和高等真核系統(tǒng)的優(yōu)點。酵母是一種單細胞低等真核生物，培養(yǎng)條件普通，生長繁殖速度迅速，能夠耐受較高的流體靜壓，用于表達基因工程產(chǎn)品時，可以大規(guī)模生產(chǎn)，有效降低了生產(chǎn)成本。酵母表達外源基因具有一定的翻譯后加工能力，收獲的外源蛋白質(zhì)具有一定程度上的折疊加工和糖基化修飾，性質(zhì)較原核表達的蛋白質(zhì)更加穩(wěn)定，特別適合于表達真核生物基因和制備有功能的表達蛋白質(zhì)。某些酵母表達系統(tǒng)具有外分泌信號序列，能夠?qū)⑺磉_的外源蛋白質(zhì)分泌到細胞外，因此很容易純化。應用酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)外源基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物時也有不足之處，如產(chǎn)物蛋白質(zhì)的不均一、信號肽加工不完全、內(nèi)部降解、多聚體形成等，造成表達蛋白質(zhì)在結構上的不一致。另外，還時常遇到表達產(chǎn)物的過度糖基化情況。因此，表達系統(tǒng)應根據(jù)具體情況作適當?shù)母倪M。20醫(yī)藥材料2.1 常用酵母表達系統(tǒng)常用酵母表達系統(tǒng)(宿主宿主-載體系統(tǒng)載體系統(tǒng))3.1.1 釀酒酵母釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表達系統(tǒng)表達系統(tǒng)由于遺傳和生理背景清楚而且安全，釀酒酵母是最早應用于重組蛋白表達的酵母宿主菌。表達菌株：表達菌株：INVSC1是釀酒酵母表達系統(tǒng)的常用菌株，它是一種雙倍體營養(yǎng)缺陷細胞株，在缺少組氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶的培養(yǎng)基中（如SC基本培養(yǎng)基）不能生長。GAL1是釀酒酵母表達系統(tǒng)中常用的啟動子，以半乳糖作為碳源可以誘導轉錄起始，葡萄糖則抑制轉錄。在葡萄糖培養(yǎng)基中，重組蛋白只有本底水平的表達，收集菌體并轉入只含半乳糖的培養(yǎng)基可以誘導重組蛋白表達。也可以使用棉子糖代替葡萄糖作為碳源，棉子糖對GAL1啟動子沒有影響，既不會抑制也不會激活，在菌體達到一定濃度之后直接加入半乳糖即可誘導重組蛋白表達。釀酒酵母可以對重組蛋白進行乙?；揎?，以及沒有位點特異性的Ser/Thr磷酸化修飾，還可以進行Asn N-糖基化和Ser/Thr O-糖基化修飾。釀酒酵母的糖基化修飾采用單一的甘露糖殘基，N-糖基化修飾由1，3-和1，6-甘露糖殘基構成，往往形成40-200個甘露糖殘基的較大糖鏈，通過基因改造可以阻斷N-糖基化過程，使糖鏈縮短為Man8GlcNAc2核心糖鏈，糖鏈末端為1,3-甘露糖，使重組蛋白的抗原性明顯增強。O-糖基化則由不超過5個的甘露糖殘基聚合而成。21醫(yī)藥材料表達質(zhì)粒表達質(zhì)粒真核表達系統(tǒng)常采用穿梭質(zhì)粒為表達載體。穿梭質(zhì)粒含有兩套復制子和啟動子，以及相應的篩選標記，可以在原核和真核兩種宿主中分別完成復制和表達，以方便對質(zhì)粒進行遺傳操作和大量制備。釀酒酵母本身含有質(zhì)粒，其表達載體可以有自主復制型和整合型兩種。自主復制型質(zhì)粒中，高拷貝載體通常采用酵母天然質(zhì)粒的復制子，如2復制子，以使載體在宿主中達到較高的拷貝數(shù)（10-40），并獨立于宿主染色體進行復制；低拷貝復制子則采用從酵母染色體中的自主復制序列（ARS）作為復制子，在宿主中嚴緊復制，通常一個細胞只有1-2個拷貝。真核表達載體常用的篩選標記有營養(yǎng)缺陷型（如URA3、TRP1）和抗生素抗性（如滅瘟素、G418等）。22醫(yī)藥材料表5：常用釀酒酵母表達載體23醫(yī)藥材料整合型質(zhì)粒（如Yip5）不含ARS，必需整合到染色體上，隨染色體復制而復制。整合過程是高特異性的，但是拷貝數(shù)一般很低。多拷貝整合載體pMIRY2通過將目的基因靶向整合到rDNA簇上(rDNA簇為酵母基因組中串聯(lián)存在的150個重復序列)克服了這個缺點，利用pMIRY2質(zhì)?？梢缘玫?00個以上的拷貝。釀酒酵母作為表達菌株具有一定的局限性，如缺乏強有力的啟動子，重組蛋白產(chǎn)率往往只有全細胞蛋白的5%左右；難于高密度培養(yǎng)；分泌效率低，幾乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白，有時蛋白只被分泌到周至空間而非培養(yǎng)基中；重組蛋白容易過度糖基化；內(nèi)部降解復雜，重組蛋白的C端往往被截短。因此，現(xiàn)在一般使用甲醇酵母代替釀酒酵母，用于重組蛋白質(zhì)的真核表達。24醫(yī)藥材料2.1.2 畢赤酵母（畢赤酵母（P.Pastoris）表達系統(tǒng)）表達系統(tǒng)畢赤酵母是一種甲醇營養(yǎng)型酵母，可以依賴甲醇作為唯一碳源生長，甲醇可以誘導代謝所需的酶的表達。目前發(fā)現(xiàn)的所有甲醇營養(yǎng)型酵母，其甲醇代謝途徑都是相同的，甲醇首先被乙醇氧化酶（AOX）氧化，生成甲醛和過氧化氫。為了避免過氧化氫毒害細胞，這步反應在過氧化物酶體中進行。在畢赤酵母中，AOX有兩個編碼基因：AOX1和AOX2，其中AOX1基因編碼了細胞內(nèi)絕大多數(shù)的乙醇氧化酶。AOX1的表達受AOX啟動子的嚴格調(diào)控，本底表達水平極低，而甲醇誘導表達量可以達到細胞總蛋白的30%以上，使用AOX啟動子使得重組蛋白可以達到很高的表達量。畢赤酵母中，His+轉化子可以自發(fā)的進行高拷貝整合，概率為1-10%，選擇帶有HIS4基因的表達載體即可以提高外源基因的拷貝數(shù)，從而提高重組蛋白的表達水平。畢赤酵母也是重組蛋白分泌表達的理想宿主。畢赤酵母本身只分泌表達少量蛋白，而且可以使用不含蛋白的培養(yǎng)基，因此分泌表達的重組蛋白在培養(yǎng)基中占據(jù)了絕對優(yōu)勢，大大簡化了純化步驟。25醫(yī)藥材料表達菌株：表達菌株：畢赤酵母的表達菌株都是由野生型石油酵母NRRL-Y11430改造而來，含有一種或幾種營養(yǎng)缺陷（如his4、arg4等）以方便篩選（表6）。研究發(fā)現(xiàn)，敲除了AOX基因的菌株有時能更好的表達外源蛋白，而且誘導所需的甲醇量也大大降低了。按照AOX基因的敲除情況和利用甲醇的能力，畢赤酵母表達菌株可以分為3類：在甲醇培養(yǎng)基中快速生長的Mut+；敲除了AOX1，在甲醇培養(yǎng)基中慢速生長的MutS和敲除了兩個AOX基因，不能利用甲醇的Mut-。不同的表型可以用來檢測外源基因在畢赤酵母轉化子中的整合方式。除此之外，還有敲除了蛋白酶（prb1、pep4）的菌株，以保護重組蛋白不受宿主蛋白酶的攻擊。蛋白酶缺陷型的菌株生長比較緩慢。與釀酒酵母相同，畢赤酵母也可以進行二硫鍵形成、磷酸化、乙?；?、糖基化等翻譯后修飾，也只能利用甘露糖殘基對蛋白進行糖基化修飾。畢赤酵母的N-糖基化糖鏈較短，平均每個支鏈8-14個甘露糖殘基，有利于重組蛋白的分子均一性；而且糖鏈中和糖鏈末端都沒有1,3-甘露糖，對重組蛋白抗原性的影響也比釀酒酵母低。26醫(yī)藥材料表6：常用畢赤酵母表達菌株27醫(yī)藥材料表達載體：表達載體：畢赤酵母本身沒有質(zhì)粒，自主復制型載體通常不穩(wěn)定，因此一般采用整合型載體。整合型載體的外源基因表達盒由幾部分組成：AOX啟動子、多克隆位點、融合標簽、AOX終止子，有時還有一段AOX1基因的3端非編碼區(qū)，以便將外源基因表達盒導入基因組中的AOX1位點。一些載體還含有外分泌信號肽，使重組蛋白分泌至培養(yǎng)基中。某些載體允許構建多個串聯(lián)的外源基因表達盒，以彌補整合型載體拷貝數(shù)量的缺陷。組成型表達的GAP啟動子可以替代AOX啟動子：GAP啟動子不需要甲醇誘導，表達水平較高，操作簡單，但不能表達對宿主有高毒性的蛋白。除表達盒之外，載體上還有篩選標記（營養(yǎng)缺陷互補基因、抗生素抗性基因）和在細菌中進行拷貝增殖所必須的序列（啟動子、終止子、復制子、抗生素抗性基因等）。遺傳霉素G418抗性和博來霉素Zeocin抗性是常用的抗生素篩選標記，常用于外源基因多拷貝的篩選。博來霉素抗性由于基因很?。?75bp），易于操作，而且也能對原核宿主進行篩選，逐漸成為人們偏愛的篩選標記。載體質(zhì)粒需要首先進行線性化，才能重組到宿主染色體中?？寺≥d體上一般有多個線性化酶切位點供選?；蛑亟M可以發(fā)生在基因組中AOX基因區(qū)域和相應的質(zhì)粒AOX區(qū)域之間，包括AOX啟動子、終止子和3非編碼區(qū)。通過選擇不同的線性化位點控制重組和外源基因的插入，可以導致宿主的不同甲醇利用表型（Mut+/Muts）。如選擇AOX啟動子和3端非編碼區(qū)的酶切位點，會導致染色體中的AOX基因被置換下來，使Mut+表型的宿主變?yōu)镸uts。如果需要多拷貝的外源基因，可以使用帶有HIS4基因的載體，并選擇HIS4中的酶切位點進行線性化。這個線性化位點不會影響宿主的甲醇利用表型，最終得到的表達菌株表型與宿主相同。28醫(yī)藥材料圖2：酵母表達載體pPIC9K質(zhì)粒圖譜29醫(yī)藥材料表7：常用畢赤酵母表達載體30醫(yī)藥材料2.2 表達條件的優(yōu)化：表達條件的優(yōu)化：檢查外源基因的一級序列：5端不能有回文結構；密碼子構成需要適應宿主的密碼子偏好，特別是N端前幾個，如使用了酵母厭惡的密碼子會大大影響表達量；高AT含量的序列會使轉錄提前中止；檢查重組蛋白序列，分泌表達時需要糖基化位點Asn-X-Ser/Thr。宿主表型：嘗試Mut+/MutS/Mut-表型的宿主，不同的基因在不同的宿主菌中可能表達量截然不同，多試幾種菌株，挑選最優(yōu)的表達體系。胞內(nèi)表達盡量使用MutS和Mut-的宿主菌，以降低乙醇氧化酶的表達，提高重組蛋白產(chǎn)率。多拷貝轉化子的篩選：在使用pPIC3.5、pPIC9等多拷貝載體時，需要對轉化子進行大量的篩選工作。以抗生素為篩選標記時，由于酵母的耐受能力與細胞密度有關，可能會出現(xiàn)假陽性，對挑選出來的高抗性轉化子，還應做進一步的PCR驗證，也可以省略平板篩選，直接做PCR鑒定。高克隆并不能一定帶來高表達，表達菌株的最終確定應以表達量為準。在表達分子量不大的蛋白時可以考慮換用pAO815載體，pAO815可以精確控制外源基因拷貝數(shù)，一次轉化即可獲得含有正確數(shù)目插入的轉化子，從而省去了轉化子的篩選工作，其缺點是克隆復雜，載體較大。31醫(yī)藥材料細胞定位：不是所有蛋白都適合分泌表達，如果重組蛋白本身定位于胞質(zhì)中而且沒有糖基化位點，應該嘗試胞內(nèi)表達。培養(yǎng)基：重組蛋白分泌表達時，最好選用pH可在較寬范圍內(nèi)變化的磷酸緩沖液培養(yǎng)基，優(yōu)化培養(yǎng)基pH值能提高蛋白表達量和穩(wěn)定性?；九囵B(yǎng)基可以簡化純化過程，豐富培養(yǎng)基則使表達菌株的生長更好，還有助于穩(wěn)定重組蛋白，表達量偏低時最好使用豐富培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中的甘油濃度有時也會影響重組蛋白的表達量和活性，甘油濃度過高會影響培養(yǎng)基溶氧量，需注意。甲醇濃度：不同的宿主-載體-重組蛋白體系的最優(yōu)甲醇誘導濃度是不同的，從0.5%-5%都有可能，是需要優(yōu)化的一個重要表達條件。搖瓶培養(yǎng)時甲醇濃度不易監(jiān)測，需要根據(jù)經(jīng)驗補加；發(fā)酵培養(yǎng)則可以實現(xiàn)甲醇濃度的精確控制，有利于重組蛋白的高表達。細胞密度：提高細胞密度能夠顯著提高重組蛋白的表達量。在培養(yǎng)基中添加不會抑制AOX啟動子的碳源，如山梨糖醇、甘露糖、海藻糖、丙氨酸等，可以提高生物量。搖瓶培養(yǎng)效果不佳時，可以考慮發(fā)酵培養(yǎng)。蛋白酶：酵母細胞中有多種蛋白酶，也會分泌一些中性蛋白酶至培養(yǎng)基中。如果重組蛋白對這些酶敏感，可以通過幾種方法減輕蛋白酶的影響：降低培養(yǎng)基pH值，使蛋白酶失活；提高培養(yǎng)基中的蛋白含量，加入1%酪蛋白水解物，用雜蛋白保護重組蛋白；換用蛋白酶敲除的宿主菌。溶氧量：越高越好。畢赤酵母的生長對氧氣要求不高，高效表達則需要大量氧氣。使用搖瓶表達時，減少培養(yǎng)基體積并提高轉速可以顯著提高菌液溶氧量，如果培養(yǎng)基中加有抗生素，甚至可以去掉棉塞，只用4-8層紗布封口。32醫(yī)藥材料溫度：培養(yǎng)溫度超過30將使酵母的生長和表達趨于停滯，如果搖床或發(fā)酵罐溫度不穩(wěn)，設置在28。過糖基化：重組蛋白的過糖基化不僅影響均一性，而且有時還會影響表達量。嘗試胞內(nèi)表達、敲除N-糖基化位點可以降低重組蛋白的糖基化水平，也可以在純化時加入酶切除過長的糖鏈以提高蛋白均一性。菌株老化：表達菌株多次傳代后表達量會明顯降低，有時表達第一次、第二次產(chǎn)量都很高，然后突然下降。長期表達時應注意保持菌株的新鮮：用原始菌株多做一些甘油菌，-80凍存，每次表達之前都取出一管重新劃線。重組蛋白不分泌或分泌量低：在分泌之前，重組蛋白必須正確折疊并形成正確的二硫鍵，錯誤和不當折疊都會干擾分泌通路。共表達輔助因子，如分子伴侶（Hsp70、90家族）、二硫鍵異構酶Pdi，過表達未折疊蛋白相應轉錄因子Hac1p（誘導分子伴侶和分泌通路酶的表達）等方法可以幫助重組蛋白進入分泌通路，提高分泌表達量和蛋白活性。33醫(yī)藥材料3.昆蟲細胞表達系統(tǒng)昆蟲細胞表達系統(tǒng)昆蟲細胞表達體統(tǒng)適宜表達高等真核生物蛋白。昆蟲細胞在培養(yǎng)中可以達到較高的細胞密度，具有復雜的翻譯后修飾，如蛋白質(zhì)的正確折疊與切割、二硫鍵形成、糖基化、磷酸化、酰化、酰胺化、羧甲基化等，很多修飾過程與哺乳動物都是相同的。與酵母相同，昆蟲細胞也可以進行胞內(nèi)和分泌表達，啟動子很強，重組蛋白表達量高，而且更適宜表達多元蛋白復合物。昆蟲細胞表達外源重組蛋白可利用質(zhì)粒轉染和病毒載體的感染。利用質(zhì)粒轉染可以獲得穩(wěn)定的轉染細胞，但實驗周期較長，需幾周甚至幾個月時間，適宜連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)；利用病毒表達系統(tǒng)則可快速感染細胞，在幾天內(nèi)使外源基因整合到病毒載體中，適用于目的蛋白的表達檢測。34醫(yī)藥材料3.1 昆蟲細胞表達系統(tǒng)昆蟲細胞表達系統(tǒng)目前常用的昆蟲細胞表達系統(tǒng)有桿狀病毒-昆蟲系統(tǒng)、InsectSelect穩(wěn)定表達系統(tǒng)和果蠅表達系統(tǒng)三種。35醫(yī)藥材料3.1.1 桿狀病毒桿狀病毒-昆蟲（昆蟲（Baculovirus Expression Vector System,BEVS）表達系統(tǒng)：）表達系統(tǒng)：桿狀病毒（baculovirus）是一類以昆蟲細胞為天然宿主的核型多角體病毒，其基因組為80-160kb大小的單一閉合雙鏈超螺旋DNA，約編碼154個基因。目前研究較多的是苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(AcNPV)。AcNPV基因組具有較大的柔韌性，可以容忍較大片斷的外源基因和多個外源基因的插入，病毒感染后期，宿主細胞會被裂解，因此BEVS不適于連續(xù)培養(yǎng)。AcNPV能夠感染大約30種鱗翅類昆蟲細胞，在一定條件下也可以感染果蠅細胞，其中草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda，Sf)卵巢細胞和粉紋夜蛾（Trichoplusia ni）胚胎細胞被發(fā)展成最常用的表達宿主。桿狀病毒常用的表達宿主有來源于草地貪夜蛾的Sf9、Sf21和來源于粉紋夜蛾的High-Five、Tn-368，這些細胞質(zhì)生長較快，能夠達到較高的細胞密度，適應懸浮培養(yǎng)，可以使用無血清培養(yǎng)基，是重組蛋白表達的理想宿主。由于昆蟲細胞的N-糖基化與哺乳動物細胞有較大差異，人們設計了能夠持續(xù)表達多種糖基轉移酶的Mimic Sf9細胞，用以表達更高等生物的蛋白。36醫(yī)藥材料AcNPV的基因表達分為立早期表達、早期表達、晚期表達、極晚期表達4個階段。前兩個階段的基因表達早于DNA復制，而后兩個階段的基因表達則伴隨著一系列的病毒DNA合成。其中在極晚期基因表達過程中，有兩種高效表達的蛋白：多角體蛋白和P10蛋白。多角體蛋白是形成包含體的主要成分，感染后期在細胞中的積累可高達3050，是病毒復制非必需成分，但對病毒粒子卻有保護作用，可使之保持穩(wěn)定和感染能力；P10蛋白也是病毒復制非必需成分，可在細胞中形成纖維狀物質(zhì)，可能與細胞溶解有關。多角體基因和P10基因的啟動子具有較強的啟動能力，因此這兩個基因位點成為桿狀病毒表達載體系統(tǒng)理想的外源基因插入位點。如將外源基因取代多角體蛋白基因構成重組病毒，病毒體內(nèi)不含有包含體。不形成包含體的病毒和形成包含體的病毒在平板中形成的空斑不同,利用這一特征篩選含有外源基因的重組病毒。使用BEVS系統(tǒng)需要將外源基因整合入桿狀病毒基因組中。解決這個問題主要有兩種思路：Bac-to-Bac系統(tǒng)改造了AcNPV基因組，將之構建成為一個超大的穿梭質(zhì)粒（130k），使其能夠在大腸桿菌中復制（單拷貝），再將帶有外源基因的供體質(zhì)粒轉入帶有病毒質(zhì)粒的大腸桿菌中，使它們在原核宿主體內(nèi)完成重組過程，將表達盒插入多角蛋白啟動子下游，純化后感染昆蟲細胞收集重組病毒；In-Fusion系統(tǒng)將野生型桿狀病毒線性化，與帶有外源基因和同源重組序列的載體直接共轉染宿主細胞，只有正確重組的病毒才能進行自我復制并裂解宿主，以此來制備重組病毒。不論使用哪種方法，都需要在收集到大量重組病毒后再感染新鮮宿主，以獲得高質(zhì)量的重組蛋白。37醫(yī)藥材料3.1.2 穩(wěn)定表達系統(tǒng)穩(wěn)定表達系統(tǒng)InsectSelect系統(tǒng)和果蠅表達系統(tǒng)都是使用整合型質(zhì)粒載體的重組蛋白表達系統(tǒng)。整合型載體可以實現(xiàn)重組蛋白的連續(xù)發(fā)酵，外源基因隨機整合入染色體，表達受插入位點的影響，同時還可能會改變宿主細胞的生長特性，因此需要做大量的篩選工作才能獲得穩(wěn)定的表達菌株。InsectSelect（IS）系統(tǒng)：）系統(tǒng)：IS系統(tǒng)可以進行重組蛋白的昆蟲細胞連續(xù)分泌培養(yǎng)。此系統(tǒng)使用的載體為pMIB/V5-His A，B，C質(zhì)粒，包括OpIE2、OpIE1啟動子、蜜蜂蜂毒分泌信號肽（HBM）、滅瘟素抗性基因、C端V5抗原和His標簽，以及在大腸桿菌中復制所必須的組分。OpIE2、OpIE1啟動子來源于桿狀病毒OpMNPV，該病毒的天然宿主為冷杉合毒蛾Orgyia pseudotsugata，常用的表達宿主有Sf9、Sf21、High Five、Kc1（果蠅）、S2（果蠅）。OpIE2啟動子比OpIE1強5-10倍，用于外源基因的表達，后者則用于滅瘟素抗性基因的表達。OpIE2為組成型強啟動子，與HBM信號肽協(xié)同，使得重組蛋白能夠在昆蟲細胞中進行連續(xù)分泌培養(yǎng)。質(zhì)粒C端有可選的V5抗原和His標簽，方便重組蛋白檢測和純化。外源基因插入載體后在大腸桿菌中擴增，純化后轉染宿主細胞。一旦宿主細胞成功表達重組蛋白，即可利用滅瘟素抗性進行篩選，獲得高拷貝的細胞株進行連續(xù)發(fā)酵。IS系統(tǒng)使用的質(zhì)粒很小（3.6K），易于操作，表達流程相對簡單，可以進行連續(xù)發(fā)酵，有些重組蛋白在IS中的表達量比BEVS還高，是一種比較實用的昆蟲表達系統(tǒng)。38醫(yī)藥材料表3：昆蟲表達載體pMIB/V5-His B質(zhì)粒圖譜39醫(yī)藥材料果蠅表達系統(tǒng)（果蠅表達系統(tǒng)（Drosophila Expression System，DES)：果蠅表達系統(tǒng)使用S2果蠅細胞為表達宿主，可以進行重組蛋白的胞內(nèi)、分泌表達，可以連續(xù)表達。在培養(yǎng)瓶中，S2松散半貼壁單層生長，同時也可以很好的適應搖瓶和發(fā)酵罐的懸浮培養(yǎng)，可以使用無血清培養(yǎng)基。外源基因在S2細胞系一般能夠達到500-1000個拷貝。DES有多種表達載體，包括組成型/誘導表達、胞內(nèi)/分泌表達，可以適應不同的需要。誘導表達的載體使用果蠅金屬硫蛋白基因（MT）啟動子。MT啟動子是一個嚴緊調(diào)控的強啟動子，即使在很高的拷貝數(shù)下也可以維持低水平的本底表達。硫酸銅或氯化鎘可以解除抑制，表達MT啟動子的下游基因。MT啟動子在其他昆蟲細胞系（如Sf9，Sf21，High Five）中表現(xiàn)不佳，僅能在S2細胞系中使用。DES的表達載體均沒有果蠅細胞的篩選標記，只能用于短期表達，要建立穩(wěn)定表達的細胞株，必須將帶有外源基因的載體和篩選載體共轉染。常用的篩選載體有攜帶潮霉素抗性基因的pCoHygro和攜帶滅瘟素抗性基因的pCoBlast。將篩選載體和表達載體共轉染宿主細胞，即可根據(jù)宿主耐藥性選出高拷貝的細胞株。40醫(yī)藥材料圖4：果蠅細胞表達載體pMT/V5-His質(zhì)粒圖譜41醫(yī)藥材料表8：果蠅表達體統(tǒng)常用載體42醫(yī)藥材料3.2 昆蟲細胞表達優(yōu)化：昆蟲細胞表達優(yōu)化：檢查外源基因的一級序列：外源基因5端不能有回文結構；密碼子構成需要適應宿主的密碼子偏好，特別是N端前幾個；高AT含量的序列會使轉錄提前中止；檢查重組蛋白序列，分泌表達時需要糖基化位點Asn-X-Ser/Thr，避免蛋白N端出現(xiàn)“PEST”脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸，N端PEST使重組蛋白容易降解。嘗試各種外源基因-載體-宿主組合：不同的載體-宿主體統(tǒng)適合表達的蛋白是不同的，重組蛋白表達量不高時應多嘗試幾種組合。宿主細胞狀態(tài)：桿狀病毒應在適合的時機感染宿主細胞，生長階段、細胞密度、病毒量、收獲時間都值得優(yōu)化，特別是使用無血清培養(yǎng)基時，細胞密度要相應增加。誘導表達系統(tǒng)同樣如此。培養(yǎng)基：培養(yǎng)基成分對重組蛋白表達量和質(zhì)量都有影響，可以考慮增加或減少培養(yǎng)基中某種組分（如血清等），也可以考慮將幾種培養(yǎng)基按比例混合使用。轉速和溶氧量：嬌嫩的昆蟲細胞不一定能適應高轉速培養(yǎng)，這就使培養(yǎng)基中的溶氧量受到了限制，優(yōu)化轉速使細胞狀態(tài)達到最佳，發(fā)酵培養(yǎng)時還應優(yōu)化培養(yǎng)基氧氣飽和度，以提高外源蛋白的表達量。共表達輔助因子：在桿狀病毒表達系統(tǒng)中，過表達抗凋亡基因，如人源bcl-2和桿狀病毒P35可以延長宿主壽命；P-vank-1基因則可以提高分泌表達量。43醫(yī)藥材料4.哺乳動物表達系統(tǒng)哺乳動物表達系統(tǒng)與其它系統(tǒng)相比，哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的優(yōu)勢在于能夠指導蛋白質(zhì)的正確折疊，提供復雜的N-糖基化和準確的O-糖基化等多種翻譯后加工功能，因而表達產(chǎn)物在分子結構、理化特性和生物學功能方面最接近于天然的高等生物蛋白質(zhì)分子。44醫(yī)藥材料4.1 表達宿主：表達宿主：哺乳動物細胞表達外源蛋白最初是將抗體基因重新導人淋巴細胞中由病毒(如SV40)或lgG的啟動子增強子引導。產(chǎn)生的抗體具有相應的結合能力和數(shù)應功能，但表達量很低。常用的非淋巴細胞類有中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、小倉鼠腎(BHK)細胞、非洲綠猴腎（COS）細胞、人類腎細胞（293）、幼倉鼠腎細胞（BHK）等。不同宿主表達的重組蛋白其穩(wěn)定性和翻譯后修飾有所不同，需根據(jù)目的蛋白選擇最佳的宿主細胞。CHO細胞是目前較常用的哺乳動物宿主細胞，被美國FDA確認為安全的基因工程受體細胞（GRAS），廣泛應用于醫(yī)療用重組蛋白的生產(chǎn)。它遺傳背景清楚，生理代謝穩(wěn)定，與人的親緣關系接近，外源蛋白修飾準確，基因轉移和載體表達系統(tǒng)完善，對剪切力的耐受性好，便于大規(guī)模培養(yǎng)，而且能在無血清和蛋白培養(yǎng)基中生長。缺點是產(chǎn)率較低，重組蛋白一般僅占細胞總蛋白的2.5%。CHO細胞有多種亞細胞株，如脯氨酸缺陷型CHO-K1、紫外線敏感型UV20、UV41，二氫葉酸還原酶雙倍體基因缺失型(DHFR-)CHO和轉入了胰島素生長因子IGF基因和轉鐵蛋白基因、更加適應無血清培養(yǎng)基的超級CHO等。45醫(yī)藥材料COS細胞是進行外源基因瞬時表達時最常用的宿主，源于1-1細胞株，基因組內(nèi)含有腺病毒SV40的T抗原基因，允許SV40進行裂解生長，允許SV40早期突變體的復制。COS細胞載體易于構建，便于使用，而且對插入DNA的量或者采用基因組DNA 序列的情況都沒有什么限制，可以通過檢測表達情況來確證cDNA的陽性克隆，也利于快速分析引入克隆化cDNA序列中的突變。來源于MadIin-Darby犬腎的高分化內(nèi)皮細胞株(MDCK)，懸浮培養(yǎng)時重組蛋白產(chǎn)率可以達到細胞總蛋白量的20，在細胞單層貼壁培養(yǎng)情況下表達量也可達到10 mg/L。在多種腎細胞獲得成功后，人源腎臟細胞293細胞也經(jīng)過改造成為常用的表達宿主。293細胞株整合了人類腺病毒5DNA的片段，顯著強化了宿主的部分啟動子，使得重組蛋白可以達到較高的表達量。293細胞能在無血清培養(yǎng)基中生長，其變種有快速生長型293-F、整合了猴腺病毒大T抗原的293-FT、融合了腺病毒部分基因的AD293和HEK293、貼壁好適宜錨定篩選的293-H等。46醫(yī)藥材料4.2 表達載體表達載體與酵母和昆蟲細胞類似，哺乳動物細胞表達外源重組蛋白也可以利用質(zhì)粒轉染和病毒載體的感染。病毒載體病毒載體哺乳動物可用的病毒載體很多，有猿猴空泡病毒（SV40）、腺病毒（Adenovirus）、腺相關病毒（Adeno-associated virus）、人牛痘病毒（Vaccinia virus）、桿狀病毒（Baculovirus）、冠狀病毒（Coronavirus）、埃-巴二氏病毒（Epstein-Barr virus）、單純皰疹病毒（Herpes simplex virus）、慢病毒（Lentiviruses）、脊髓灰質(zhì)炎病毒（Poliovirus）、逆轉錄病毒（Retroviruses）、塞姆利基森林病毒（Semliki Forest virus）等。不同的病毒載體能夠裂解增殖或復制的宿主各不相同，應根據(jù)需要選擇。47醫(yī)藥材料腺病毒（Adenovirus）：腺病毒為線狀雙鏈DNA病毒，基因組長36kb，DNA兩端各有一個反向重復序列ITR。腺病毒宿主范圍廣，可感染一系列哺乳動物細胞，其中人源細胞是腺病毒的允許細胞，腺病毒可以完成復制增殖裂解宿主的周期，不會插入人源細胞基因組中，因而不會致癌；而對嚙齒動物，大部分腺病毒都可以致癌。腺病毒基因按轉錄時間的先后，可以分為早期（E1-E4）和晚期轉錄單位（L1-L5）。E1蛋白調(diào)節(jié)細胞代謝并激活其他早期基因的啟動子，E2啟動病毒DNA復制，E3與病毒復制無關，主要幫助病毒的成熟，E4主要與病毒mRNA的代謝有關。pAdEasy-1載體以人腺病毒AD5基因組為藍本，敲除了E1和E3，擴大載體容量的同時，使病毒不能在非允許細胞中復制。目的基因首先克隆在一個帶有ITR和篩選標記的穿梭質(zhì)粒（如pShuttle-CMV）中，線性化后與pAdEasy共轉染大腸桿菌，以抗生素篩選帶有重組病毒的原核宿主，提取純化后在融合有腺病毒E1基因的293細胞株（如AD293）中增殖和表達。重組病毒中，表達盒插入在腺病毒E1區(qū)，使用E1強啟動子表達重組蛋白。使用人源細胞株作為表達宿主時，腺病毒載體最終會裂解宿主，因此不適于連續(xù)表達。48醫(yī)藥材料慢病毒（Lentivirus）：慢病毒是逆轉錄病毒的一種，由潛伏期較長而得名。慢病毒既可以轉染處于有絲分裂活躍期的細胞，又可以轉染分裂緩慢及處于分裂終末期的細胞，包括造血干細胞，神經(jīng)干細胞，處于分化終末的神經(jīng)元，肝實質(zhì)細胞等。根據(jù)其來源不同，慢病毒可以分為以下幾類：HIV I型、HIV II型、猿類免疫缺陷病毒、貓免疫缺陷病毒。其中HIV I型是目前最常用的慢病毒載體。慢病毒感染宿主細胞后馬上形成前病毒，前病毒的主要基因編碼區(qū)為5LTR-gag-pro-pol-env-3LTR，其中LTR為長末端重復序列、為整合信號，gag基因編碼病毒的核心蛋白，pol基因編碼病毒復制所需的酶類，env基因編碼病毒的包膜糖蛋白，pro基因則編碼切割蛋白前體所需的蛋白酶。HIV-I載體系統(tǒng)由輔助和載體兩個質(zhì)粒組成。載體質(zhì)粒含有整合信號、啟動子、多克隆位點以及包裝、逆轉錄和整合所需的序列；輔助質(zhì)粒則與載體互補，編碼了產(chǎn)生病毒顆粒所必須的蛋白。將兩個質(zhì)粒共轉化到宿主中，由于輔助質(zhì)粒不含整合信號，新生成的病毒中就只有目的基因。將重組病毒感染普通表達宿主，即可進行重組蛋白的穩(wěn)定表達；如感染整合了gag、pol、env基因的宿主，即可進行瞬時表達。慢病毒表達系統(tǒng)的一個主要缺陷是：載體和輔助質(zhì)粒有時會在宿主中發(fā)生同源重組，產(chǎn)生野生型病毒。為了解決這個問題，目前使用的表達系統(tǒng)將輔助質(zhì)粒又分成了三個質(zhì)粒，分別帶有逆轉錄酶rev基因、gag和pol基因、以及env的替代基因VSV-G（囊口腔炎病毒外殼蛋白）。將載體系統(tǒng)分成4個部分增加了野生病毒生成所需的重組步驟，使得HIV載體系統(tǒng)更加穩(wěn)定；外殼蛋白的單獨構建，使得人們可以通過更換病毒外殼蛋白質(zhì)粒來方便的更換宿主種類。49醫(yī)藥材料單質(zhì)粒表達載體單質(zhì)粒表達載體以pcDNA3.1為例，它是一個不依賴病毒的載體，組成元件有人巨細胞病毒早期啟動子pCMV、多克隆位點、用于真核篩選的遺傳霉素抗性基因、f1和SV40復制子、polyA轉錄終止信號，以及原核復制子和氨芐青霉素抗性基因。pcDNA3.1載體的使用與類似的昆蟲表達載體相同：將目的基因克隆入載體中，在原核宿主中擴增純化，轉染真核表達宿主，使用G418篩選高表達細胞株。pcDNA3.1載體很小（5.4kb），易于操作，宿主溶源SV40病毒時可以獨立于染色體自主復制；但是其表達流程復雜，對質(zhì)粒載體純度和轉染效率要求很高，篩選工作費時費力，而且表達盒的插入位點和拷貝數(shù)不可控制，可能影響宿主生理性質(zhì)。使用Flp-In宿主細胞株可以克服這些缺點。50醫(yī)藥材料圖5：A：Flp-In CHO細胞系；B：pEF/FRT/V5-DEST質(zhì)粒圖譜51醫(yī)藥材料常用的哺乳動物細胞株，如CHO、293等都可以改造為Flp-In細胞株。序列SV40啟動子ATGFRTlacZ-Zeocin整合在基因組中活躍表達的區(qū)域（圖5 A），使用博來霉素篩選宿主基因型，帶有外源基因的表達盒插入FRT位點，保證了目的基因的正確整合。使用Flp-In細胞株必須配合表達pOG44質(zhì)粒和帶有FRT重組序列的表達載體，如pEF/FRT/V5-DEST（圖5 B）。pOG44帶有編碼了Flp重組酶的基因，將其與表達載體共轉染，F(xiàn)lp重組酶幫助表達盒插入宿主染色體的FRT位點，即可獲得穩(wěn)定表達重組蛋白的細胞株。除以上介紹的兩種載體外，還有多種單質(zhì)粒載體可供選擇（表9）。52醫(yī)藥材料表9：常用哺乳動物單質(zhì)粒表達載體，新霉素是遺傳霉素類似物，也可用G418篩選53醫(yī)藥材料四環(huán)素誘導表達系統(tǒng)：四環(huán)素誘導表達系統(tǒng)：四環(huán)素誘導表達載體是基于大腸桿菌四環(huán)素操縱子而設計的。大腸桿菌中，四環(huán)素抗性蛋白（TetR）調(diào)控著Tn 10轉座子上的四環(huán)素抗性操縱子。TetR結合在tet操縱序列（tetO）上，抑制下游基因的轉錄。當環(huán)境中存在四環(huán)素時，四環(huán)素結合在TetR上，使其構象發(fā)生改變，從DNA上脫落而解除抑制。TetR和tetO為哺乳動物四環(huán)素誘導表達系統(tǒng)提供了調(diào)控與誘導表達的基礎。哺乳四環(huán)素誘導表達系統(tǒng)有兩種：Tet-On和Tet-Off（圖6）。Tet-On系統(tǒng)在培養(yǎng)基中添加Dox（四環(huán)素類似物）時誘導外源基因表達；Tet-Off則在培養(yǎng)基去除Tet或Dox時誘導外源基因表達。這兩種系統(tǒng)都由2個質(zhì)粒組成：帶有經(jīng)過改造的TetR的調(diào)控質(zhì)粒和tetO及目的基因的表達質(zhì)粒。在Tet-Off的調(diào)控質(zhì)粒中，TetR的N端1-207與單純皰疹病毒VP16的活性結構域（TA）融合，形成一個新的轉錄調(diào)控蛋白tTA。tTA的功能與TetR相反，是一個轉錄激活因子，結合四環(huán)素或Dox時不能結合DNA，表達被抑制，去除配體時蛋白結合在操縱序列上，誘導外源基因表達。在Tet-On的調(diào)控質(zhì)粒中，tTA經(jīng)過4個氨基酸殘基的突變，被改造成抑制轉錄的“反向”tTA（rtTA）。rtTA只應答Dox，四環(huán)素不能啟動轉錄。結合有Dox的rtTA能夠同時結合操縱序列并啟動轉錄，反之則從DNA上脫落，抑制轉錄。除調(diào)控蛋白編碼基因外，兩個系統(tǒng)的調(diào)控質(zhì)粒上還帶有CMV啟動子、新霉素抗性基因、polyA終止子、氨芐青霉素抗性基因及原核復制子Col E1。可以使用G418篩選穩(wěn)定轉染的細胞株。54醫(yī)藥材料Tet-On和Tet-Off系統(tǒng)共用一種表達質(zhì)粒。其中，tetO的連續(xù)7個拷貝和最小化的CMV啟動子組成了Tet應答啟動子hCMV*-1，當調(diào)控蛋白（tTA或rtTA）結合在啟動子上時，下游的外源基因得到轉錄。將調(diào)控質(zhì)粒和表達質(zhì)粒共轉染宿主細胞，利用G418篩選，即可獲得誘導表達重組蛋白的穩(wěn)定細胞株。由于四環(huán)素和Dox的半衰期較短，使用Tet-On系統(tǒng)需要在誘導后定時添加Dox，Tet-Off則需要在誘導前定時補加。四環(huán)素誘導表達系統(tǒng)有很多優(yōu)點：嚴緊調(diào)控，本底表達量低；使用轉錄激活蛋白而不是抑制蛋白，進一步降低了本底表達，并減少了響應時間；特異性強，操縱子來源于原核生物，與表達宿主的同源性很低，調(diào)控蛋白只結合表達質(zhì)粒上的操縱序列；表達量與誘導劑濃度正相關，可以較精確的控制。除基本的Tet-On/Off系統(tǒng)外，還有嚴緊調(diào)控的pTRE-Tight載體、帶有報告基因的pTRE-Tight-DsRed2載體、經(jīng)過進一步改造更加適應哺乳動物宿主的Tet-On/Off 3G載體等，使用時可以根據(jù)需要選擇。5