《RNA生物合成》PPT課件

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1、第 四 講 RNA的 生 物 合 成 RNA代 謝一 、 RNA合 成 的 特 征二 、 原 核 生 物 RNA合 成三 、 真 核 生 物 RNA的 合 成四 、 原 核 與 真 核 生 物 mRNA的 比 較目 錄五 、 內(nèi) 含 子 的 剪 接 、 編 輯 、 再 編 碼 及 化 學 修 飾 RNA代 謝 除 了 某 些 RNA病 毒 之 外 ， 所 有 RNA分 子 都 來 自 于 DNA。 基 因組 DNA通 過 一 個 被 稱 為 轉(zhuǎn) 錄 的 過 程 把 貯 存 在 雙 鏈 DNA分 子 中的 遺 傳 信 息 轉(zhuǎn) 換 到 與 模 板 DNA鏈 相 互 補 的 RNA單 鏈 上 。mR

2、NA， 編 碼 了 一 個 或 多 個 蛋 白 質(zhì) 序 列 。 tRNA， 把 mRNA上 的 遺 傳 信 息 變 為 多 肽 中 的 氨 基 酸 信 息 ；rRNA， 是 合 成 蛋 白 質(zhì) 的 工 廠 核 糖 體 中 的 主 要 成 份 。 一 、 RNA合 成 的 特 征1、 RNA的 前 體 是 四 種 核 糖 核 苷 三 磷 酸 （ rNTP） ： ATP、GTP、 CTP和 UTP。2、 RNA鏈 的 生 長 方 向 也 是 從 5 3 ， 核 苷 三 磷 酸 加 到 新生 鏈 的 3 端 ， 同 時 除 去 一 分 子 焦 磷 酸 而 生 成 磷 酸 二 酯 鍵 。3、 轉(zhuǎn) 錄

3、必 需 以 一 條 DNA鏈 作 為 模 板 ， 按 照 堿 基 互 補 原 則進 行 轉(zhuǎn) 錄 ， 因 此 DNA中 的 A、 G、 C、 T將 被 分 別 轉(zhuǎn) 錄 為 U、C、 G、 A。 有義鏈（或編碼鏈）： 與 mRNA序 列 相 同 的 那 條 DNA鏈 。反義鏈（或模板鏈）： 指 根 據(jù) 堿 基 互 補 配 對 原 則 指 導 RNA合 成 的 DNA鏈 。4、 RNA聚 合 酶 與 DNA聚 合 酶 不 同 ， RNA聚 合 酶 能 起 始一 條 新 鏈 的 合 成 ， 起 始 的 核 苷 酸 一 般 是 嘌 呤 核 苷 三 磷 酸 。 5、 轉(zhuǎn) 錄 有 一 定 的 起 始 、 終

4、 止 位 點 。 轉(zhuǎn) 錄 起 始 點 及 有 關(guān) 位 置 表 示 方 法 ：轉(zhuǎn) 錄 起 始 點 是 指 mRNA開 始 轉(zhuǎn) 錄 的 第 一 個 堿 基 ， 此 點 通 常用 +1表 示 ， 由 此 與 轉(zhuǎn) 錄 方 向 相 一 致 的 下 游 序 列 的 堿 基 位 置用 正 值 表 示 ； 與 轉(zhuǎn) 錄 方 向 相 反 的 上 游 序 列 的 堿 基 位 置 用 負 值表 示 。 -30 -20 -10 +1 +10 +20 +30 +40上 游 下 游 1. RNApol的 結(jié) 構(gòu) 表 4-1 RNApol的 結(jié) 構(gòu)亞 基 亞 基 數(shù) WM（ K D） 功 能 編 碼 基 因 全 酶 2 40

5、 P識 別 、 核 心 酶 裝 配 rpoA 465K D。 1 155 rpoB 1 160 rpoC 催 化 中 心 32-90 啟 動 子 特 異 選 擇 rpoD核心酶全酶二 、 原 核 生 物 RNA合 成（ 一 ） 原 核 生 物 RNA聚 合 酶 （ RNA polymerase) 因 子 不 僅 增 加 聚 合 酶 對 啟 動 子 的 親 和 力 ， 還 降 低 了 它 對 非專 一 位 點 的 親 和 力 。 1. 定 義 啟 動 子 是 一 段 位 于 結(jié) 構(gòu) 基 因 5 端 上 游 區(qū) 的 DNA序 列 ， 能 活化 RNA聚 合 酶 ， 使 之 與 模 板 DNA準 確

6、 地 結(jié) 合 并 具 有 轉(zhuǎn) 錄 起 始 的 特異 性 。 啟 動 子 的 位 置 ， 可 在 +1上 游 ， 也 可 在 +1下 游 （ 個 別 ） 。（ 二 ） 啟 動 子 （ promoter) 2. Promoter的 結(jié) 構(gòu) 可 被 RNA全 酶 保 護 的 區(qū) 域 -50 +20。 同 源 性 序 列 ： - 10 區(qū) 、 -35區(qū) 有 同 源 性 ； 強 啟 動 子 更 保 守 。 Pribnow box -10區(qū) ， 100個 測 定 啟 動 子 中T46 T41 T40 T43 G43 N T80 A95 T45 A60 A50 T96 G37 富 含 A/T。此 序 列 突

7、 變 ， 導 致 啟 動 受 阻 或 活 力 下 降 。 - 35 區(qū) ， 識 別 區(qū)T 82 T84 G78 A65 C54 A54 TTGACA 16 19bp TATAAT 5 9bp +1-35 -10 圖 4 6 一 個 典 型 的 啟 動 子 含 有 三 個 部 分 ， 由 在 -35、 -10 和起 始 原 點 的 共 有 序 列 組 成 。在 原 核 生 物 中 ， 35區(qū) 與 10區(qū) 之 間 的 距 離 大 約 是 16 19bp。下 降 突 變 ： 如 果 把 Pribnow區(qū) 從 TATAAT變 成 AATAAT就 會 大 大降 低 其 結(jié) 構(gòu) 基 因 的 轉(zhuǎn) 錄 水 平

8、 。上 升 突 變 ： 即 增 加 區(qū) 共 同 序 列 的 同 一 性 。 如 ： 乳 糖 操 縱 子 的啟 動 子 中 ， 將 其 Pribnow區(qū) 從 TATGTT變 成 TATATT， 就 會 提 高啟 動 子 的 效 率 。 圖 4 4 啟 動 子 的 共 有 序 列 和 RNA聚 合 酶 的 結(jié) 合 部 位 。 表 4-2 E.coli 不 同 的 識 別 序 列 （ promote區(qū) ） rpoD 70 通 常 TTGACA 16-18bp TATAAT rpoH 32 熱 休 克 CCCTTGAA 13-15bp CCCGATNT rpoE E 熱 休 克 未 知 未 知 未 知

9、 rpoN 54 N利 用 CTGGNA 66bp TTGCA fliA F 鞭 毛 CCAAA 15bp GCCGATAA Gene 因 子 用 途 - 35區(qū) 間 隔 區(qū) -10區(qū) 1 RNA合 成 的 起 始（ 1） RNApol全 酶 識 別 。 RNApol酶 與 啟 動 子 DNA雙 鏈 相 互 作 用 并 與 之 相 結(jié) 合 的 過程 。 聚 合 酶 與 啟 動 子 結(jié) 合 形 成 封 閉 復 合 物 。 此 時 ， DNA仍 處于 雙 鏈 狀 態(tài) 。 伴 隨 著 DNA構(gòu) 象 上 的 重 大 變 化 ， 封 閉 復 合 物 變?yōu)?開 放 復 合 物 。（ 2） pppA或 pp

10、pG起 始 。 開 放 復 合 物 與 最 初 兩 個 NTP相 結(jié) 合 并 在 這 兩 個 核 苷 酸 之間 形 成 磷 酸 二 酯 鍵 后 轉(zhuǎn) 變 為 包 括 RNA聚 合 酶 、 DNA和 新 生RNA的 三 元 復 合 物 。 第 一 個 堿 基 通 常 為 嘌 呤 。 通 過 啟 動 子 階 段 （ 合 成 6-9個 核 苷 酸 ） 。（ 3） 因 子 脫 落（ 三 ） RNA的 酶 促 合 成 Figure 4 12 RNA polymerase passes through several steps prior to elongation. A closed binary co

11、mplex is converted to an open form and then into a ternary complex. 圖 4 12 在 延 伸 以 前 ， RNA聚 合酶 要 通 過 若 干 步 。 一 個 緊 密 的 二聚 體 復 合 物 被 轉(zhuǎn) 變 成 一 種 開 放 形式 ， 然 后 變 成 三 聚 體 復 合 物 。 v RNA-DNA雜 交 區(qū) 約 12bpv RNApol解 鏈 的 DNA的 長 度 為 17bp（ 1.6個 螺 旋 ）v 因 子 脫 落 后 ， NusA蛋 白 （ 防 止 轉(zhuǎn) 錄 終 止 的 調(diào) 節(jié) 因 子 ）與 RNApol結(jié) 合 作 用 （

12、不 牢 固 ） 。 2 RNA鏈 的 延 長 圖 4 16 RNA延 伸 的 圖 解 3 RNA合 成 的 終 止 一 旦 RNA聚 合 酶 啟 動 了 基 因 轉(zhuǎn) 錄 ， 它 就 會 沿 著 模 板53方 向 不 停 地 移 動 ， 合 成 RNA鏈 ， 直 到 遇 到 終 止 信 號 時才 釋 放 新 生 的 RNA鏈 ， 并 與 模 板 DNA脫 離 。 研 究 RNA鏈 終 止 時 遇 到 最 常 見 的 問 題 是 3端 核 苷 酸 的 定位 ， 因 為 活 細 胞 內(nèi) 部 根 據(jù) 終 止 信 號 正 確 終 止 的 RNA與 一 個 經(jīng)過 剪 接 的 RNA在 3端 沒 有 兩 樣

13、 ， 都 是 -OH基 團 。 模 板 DNA上都 有 終 止 轉(zhuǎn) 錄 的 特 殊 信 號 -終 止 子 ， 每 個 基 因 或 操 縱 子 都 有一 個 啟 動 子 ， 一 個 終 止 子 。 在 新 生 RNA中 出 現(xiàn) 發(fā) 卡 式 結(jié) 構(gòu) 會導 致 RNA聚 合 酶 的 暫 停 ， 破 壞 RNA-DNA雜 合 鏈 5端 的 正 常結(jié) 構(gòu) 。 寡 聚 U的 存 在 使 雜 合 鏈 的 3端 部 分 出 現(xiàn) 不 穩(wěn) 定 的rUdA區(qū) 域 。 （ 1） 依 賴 于 因 子 的 終 止 因 子 是 一 個 相 對 分 子 質(zhì) 量 為 2.0 105的 六 聚 體 蛋 白 ，它 能 水 解 各

14、種 核 苷 三 磷 酸 ， 實 際 上 是 一 種 NTP酶 ， 同 時 具 有解 螺 旋 酶 的 活 性 。 有 人 認 為 ， 在 RNA合 成 起 始 以 后 ， 因 子 即 附 著 在 新 生的 RNA鏈 上 ， 靠 ATP水 解 產(chǎn) 生 的 能 量 ， 沿 著 5 3 方 向朝 RNA聚 合 酶 移 動 ， 到 達 RNA的 3 -OH端 后 取 代 暫 停 在 終止 位 點 上 的 RNA聚 合 酶 ， 它 所 具 有 的 RNA-DNA解 螺 旋 酶 活性 使 轉(zhuǎn) 錄 產(chǎn) 物 RNA從 模 板 DNA上 釋 放 ， 隨 后 ， 轉(zhuǎn) 錄 復 合 體解 體 ， 完 成 轉(zhuǎn) 錄 過 程

15、 。 終 止 過 程 需 要 消 耗 能 量 。 Figure 4 19 A rho-dependent terminator has a sequence rich in C and poor in G preceding the actual site(s) of termination. RNApol識 別 終 止 子 ， 在 轉(zhuǎn) 錄 此 終 止 后 合 成 速 度 減 慢 ， 從RNA5 移 動 至 RNApol處 ， 使 RNA釋 放 。 （ 圖 4 19 ）圖 4 19 依 賴 rho的 一 種 終 止 子 在 終 止 作 用 的 實 際 位 點 前 方 有一 段 富 含 C而 極

16、 少 含 G的 序 列 。 RNA聚 合 酶 沿 模 板 移 動因 子 依 附 在 RNA的 5端因 子 沿 RNA鏈 運 動 ， 跟 蹤 聚 合 酶因 子 趕 上 在 終 止 位 點 暫 停 的 聚 合 酶終 止 三 元 復 合 體 解 體聚 合 酶 在 終 止 位 點 暫 停 （ 2） 不 依 賴 于 因 子 的 終 止 若 終 止 點 上 游 存 在 一 個 富 含 GC堿 基 的 二 重 對 稱 區(qū) ，由 這 段 DNA轉(zhuǎn) 錄 產(chǎn) 生 的 RNA容 易 形 成 發(fā) 卡 式 結(jié) 構(gòu) ； 在 終止 點 前 面 有 一 段 由 4-8個 A組 成 的 序 列 ， 導 致 轉(zhuǎn) 錄 產(chǎn) 物 的3

17、 端 為 寡 聚 U。 這 兩 種 結(jié) 構(gòu) 特 征 的 存 在 同 樣 決 定 了 轉(zhuǎn) 錄的 終 止 。 在 新 生 RNA中 出 現(xiàn) 發(fā) 卡 式 結(jié) 構(gòu) 會 導 致 RNA聚 合 酶 的暫 停 ， 破 壞 RNA-DNA雜 合 鏈 5端 的 正 常 結(jié) 構(gòu) 。 寡 聚 U的存 在 使 雜 合 鏈 的 3端 部 分 出 現(xiàn) 不 穩(wěn) 定 的 rUdA區(qū) 域 。 圖 4 18 RNA合 成時 的 發(fā) 卡 終 止 結(jié) 構(gòu) 。 （ 3） 抗 終 止 破 壞 終 止 位 點 RNA的 莖 環(huán) 結(jié) 構(gòu) 依 賴 于 蛋 白 因 子 的 轉(zhuǎn) 錄 抗 終 止 噬 菌 體 中 由 N基 因 編 碼 產(chǎn) 生 的 N

18、蛋 白 具 有 抗 轉(zhuǎn)錄 終 止 作 用 ， 但 是 其 功 能 的 發(fā) 揮 依 賴 于 宿 主 所 產(chǎn) 生的 NusA、 NusB、 S10、 2.5 104等 幾 種 蛋 白 質(zhì) ，這 些 蛋 白 質(zhì) 結(jié) 合 到 終 止 子 附 近 的 DNA位 點 是 實 現(xiàn) 抗終 止 的 必 要 條 件 （ 圖 3-21） 。 DNA與 RNA合 成 的 不 同 點 ： 從 DNA合 成 反 應 的 化 學 本 質(zhì) 、 極 性 和 模 板 的 使 用這 三 方 面 來 說 ， 轉(zhuǎn) 錄 與 復 制 是 相 同 的 。 但 是 ， 也 存在 三 個 主 要 不 同 點 ： A 轉(zhuǎn) 錄 中 不 需 要 RN

19、A引 物 ； B 轉(zhuǎn) 錄 反 應 一 般 只 用 一 小 段 DNA做 模 板 ； C 在 轉(zhuǎn) 錄 區(qū) ， 一 般 都 只 有 一 條 DNA鏈 可 以 作 為模 板 。 表 4-3 真 核 生 物 RNA聚 合 酶 種 類 存 在 功 能 （ 合 成 產(chǎn) 物 ） 結(jié) 構(gòu) 對 -鵝 蕈 堿 敏 感 性 RNApol 核 仁 5.8S、 18S、 28S rRNA 2個 大 亞 不 敏 感 - 基 、 4-8 個 小 亞 基RNApol 核 質(zhì) mRNA 敏 感 +RNA pol 核 質(zhì) tRNA、 5S rRNA、 SnRNA 存 在 物 種 特 異 性線 粒 體葉 綠 體 RNApol(核

20、基 因 編 碼 ）三 、 真 核 生 物 RNA的 合 成1. 真 核 生 物 RNA聚 合 酶 真 核 生 物 的 RNA聚 合 酶 一 般 由 8 16個 亞 基所 組 成 ， 相 對 分 子 質(zhì) 量 超 過 5x105 。 雖 然 不 同 生 物 3類 RNA聚 合 酶 的 亞 基 種 類 和大 小 各 異 ， 但 具 有 相 似 性 。 存 在 兩 個 普 遍 遵 循 的原 則 ： 一 、 聚 合 酶 有 兩 個 相 對 分 子 質(zhì) 量 超 過 1x105的 大 亞 基 ； 二 是 同 種 生 物 3類 聚 合 酶 有 共 享 小 亞 基的 傾 向 。 （ 見 下 表 ） RNA聚 合

21、 酶 I RNA聚 合 酶 II RNA聚 合 酶 IIIRPA1 RPB1 RPC1RPA2 RPB2 RPC2RPC5 RPB3 RPC5RPC9 RPB11 RPC9RPC6 RPB6 RPB6其 它 9個 亞 基 其 它 7個 亞 基 其 它 11個 亞 基真 核 生 物 RNA聚 合 酶 的 亞 基 2. 真 核 生 物 啟 動 子 的 主 要 部 位 位 于 -25 -35區(qū) ， 其 共 有 序 列 為 TATA A ， TATA框 主 要決 定 轉(zhuǎn) 錄 的 精 確 起 始 ， RNA聚 合 酶 同 TATA框 牢 固 結(jié) 合 之 后才 能 開 始 轉(zhuǎn) 錄 。（ 1） TATA框（

22、 2） CAAT框位 于 -70 -80區(qū) ， 共 有 序 列 GG CAATCT。（ 3） GC框 ATATCT位 于 -80 -110區(qū) ， 共 有 序 列 GCCACACC或 GGGCGGG。CAAT區(qū) 和 GC區(qū) 主 要 控 制 轉(zhuǎn) 錄 起 始 頻 率 ， 基 本 不 參 與 起 始位 點 的 確 定 。（ 4） 增 強 子 （ 4） 增 強 子增 強 子 是 一 類 遠 程 調(diào) 控 序 列 。遠 距 離 效 應 它 們 可 調(diào) 控 的 基 因 有 相 當 遠 的 距 離 ， 甚 至相 距 10kb也 能 發(fā) 揮 作 用 。無 方 向 性 可 處 于 被 轉(zhuǎn) 錄 序 列 的 上 游 ，

23、 下 游 ， 甚 至 處 于 轉(zhuǎn)錄 序 列 中 。順 勢 調(diào) 節(jié) 只 調(diào) 節(jié) 位 于 同 一 染 色 體 上 的 靶 基 因 。具 有 組 織 特 異 性 增 強 子 在 行 使 功 能 時 可 具 有 組 織 特 異 性或 給 定 細 胞 中 特 定 的 分 化 階 段 發(fā) 揮 作 用 。有 相 位 性 其 作 用 與 DNA的 構(gòu) 象 有 關(guān) 。無 物 種 和 基 因 特 異 性 可 以 連 接 到 異 源 基 因 上 發(fā) 揮 作 用 。 有 的 增 強 子 可 以 對 外 部 信 號 產(chǎn) 生 反 應 。 3. 真 核 生 物 RNA的 轉(zhuǎn) 錄（ 1） 起 始 ： 轉(zhuǎn) 錄 因 子 （ 反

24、式 作 用 因 子 ） 。（ 2） 延 伸 ： 合 成 速 度 30 50 nt/s, 速 度 不 恒 定 。（ 3） 終 止 對 于 真 核 生 物 轉(zhuǎn) 錄 的 終 止 信 號 和 機 制 了 解 很 少 。 爪 蟾5SRNA的 3-末 端 為 4個 U， 而 這 4個 U的 前 后 均 為 富 含 G/C的 序列 ， 在 G/C序 列 中 分 布 著 寡 聚 T（ 4個 以 上 ） 是 所 有 真 核 生 物RNA聚 合 酶 III的 終 止 信 號 。 表 3-4 真 核 生 物 RNA聚 合 酶 II所 形 成 的 轉(zhuǎn) 錄 起 始 復 合 物蛋 白 質(zhì) 亞 基 數(shù) 亞 基 的 相 對

25、分 子 量 /103 功 能RNA聚 合 酶 II 12 10 220 催 化 RNA的 生 物 合 成TBP 1 38 與 啟 動 子 上 的 TATA區(qū) 結(jié) 合TFIIA 3 12、 19、 35 使 TBP及 TFIIB啟 動 子 的 結(jié) 合 比 較 穩(wěn) 定 TFIIB 1 35 與 TBP相 結(jié) 合 ， 吸 引 RNA聚 合 酶 和TFIID 12 15 250 與 各 種 調(diào) 控 因 子 相 互 作 用TFIIE 2 34、 57 吸 引 TFIIH， 還 有 ATP酶 及 解 鏈 酶 活 性 TFIIF 2 30、 74 結(jié) 合 RNA聚 合 酶 II并 在 TFIIB幫 助 下

26、阻TFIIH 12 35 89 在 啟 動 子 區(qū) 解 開 DNA雙 鏈 ， 使 RNA聚 合TFIIF到 啟 動 子 上止 聚 合 酶 與 非 特 異 性 DNA序 列 相 結(jié) 合酶 II磷 酸 化 ， 接 納 核 苷 酸 切 除 修 復 系 統(tǒng) RNA聚 合 酶 II及 轉(zhuǎn) 錄 因 子 在 啟 動 子 上 的 裝 配TBP（ orTFIID and/orTFIIA）TFIIBTFIIF-RNA polymerase IITFIIETFIIH 轉(zhuǎn) 錄 的 抑 制第 一 類 ： DNA模 板 功 能 抑 制 劑 ， 通 過 與 DNA結(jié) 合而 改 變 模 板 的 功 能 。第 二 類 ： RN

27、A聚 合 酶 的 抑 制 物 ， 它 們 與 RNA聚 合酶 結(jié) 合 而 抑 制 其 活 力 。 抑 制 劑 靶 酶 抑 制 作 用利 福 霉 素 細 菌 全 酶 和 亞 基 結(jié) 合 ， 抑 制 起 始利 迪 鏈 霉 素 細 菌 核 心 酶 和 亞 基 結(jié) 合 ， 抑 制 起 始放 線 菌 素 D 真 核 生 物 RNA聚 合 酶 I 與 DNA結(jié) 合 ， 阻 止 延 伸 鵝 膏 蕈 堿 真 核 生 物 RNA聚 合 酶 II 與 RNA聚 合 酶 II 結(jié) 合常見的轉(zhuǎn)錄抑制劑 1.原 核 生 物 mRNA的 特 征（ 1） 原 核 生 物 mRNA的 半 衰 期 短 。（ 2） 許 多 原

28、核 生 物 mRNA可 能 以 多 順 反 子 的 形 式 存 在 。 后 面 幾 個 順 反 子 的 翻 譯 起 始 會 受 到 其 上 游 順 反 子 結(jié) 構(gòu) 的 調(diào)控 （ 圖 3-14）（ 3） 原 核 生 物 mRNA的 5端 無 帽 子 結(jié) 構(gòu) ， 3 端 沒 有 或只 有 較 短 的 polyA結(jié) 構(gòu) 。 原 核 生 物 起 始 密 碼 子 AUG上 游 7-12個 核 苷 酸 處 有 一 個 被稱 為 SD序 列 的 保 守 區(qū) ， 因 為 該 序 列 與 16S rRNA 3端 反 向 互補 ， 所 以 被 認 為 在 核 糖 體 mRNA的 結(jié) 合 過 程 中 起 作 用 。

29、 四 、 原 核 與 真 核 mRNA特 征 比 較 帽 子 結(jié) 構(gòu) 有 三 種v 0類 帽 子 ： m7GpppX， 真 核 單 細 胞 生 物 ， 如 ； 酵 母 。v 1類 帽 子 ： m7GpppXm , 真 核 普 遍 存 在 。v 2類 帽 子 ： m7GpppXmpYm ， 10 15%的 真 核 有 此 結(jié) 構(gòu) 。 形 成 ： 帽 子 結(jié) 構(gòu) 在 剪 切 前 已 形 成 。2.真 核 生 物 mRNA特 征（ 1） 5 端 存 在 帽 子 結(jié) 構(gòu)（ 1） 使 mRNA免 遭 核 酸 酶 的 破 壞 。 （ 2） 有 帽 子 結(jié) 構(gòu) 的 mRNA更 容 易 被 蛋 白 質(zhì) 合 成

30、 的 起始 因 子 所 識 別 ， 從 而 促 進 蛋 白 質(zhì) 的 合 成 。作 用 ： 圖 4 25 （ 2） 絕 大 多 數(shù) 真 核 生 物 3端 具 有 多 聚 A尾 巴 形 式 mRNApoly(A)+ 示 有 poly; mRNApoly(A)- 示 無 poly polyA是 在 polyA合 成 酶 作 用 下 逐 個 湊 加 的 。15-30bpAAUAAA + nATPmRNA polyA合 成 酶PP iAAUAAA AAAAA AAAA AAUAAA為 poly(A)附 加 的 識 別 序 列 。poly A的 作 用 ： （ 1） 是 mRNA由 細 胞 核 進 入 細

31、 胞 質(zhì) 所 必 需 的形 式 ， 它 大 大 提 高 了 mRNA在 細 胞 質(zhì) 中 的 穩(wěn) 定 性 。 （ 2） 可 用 于 cDNA的 合 成 。 五 、 內(nèi) 含 子 的 剪 接 、 編 輯 、 再 編 碼 及 化 學 修 飾1. RNA中 的 內(nèi) 含 子內(nèi) 含 子 ： 在 RNA原 初 轉(zhuǎn) 錄 本 中 被 切 除 ， 而 最 終 不 表 達 的 片 段 。外 顯 子 ： 在 RNA原 初 轉(zhuǎn) 錄 本 中 剪 接 中 保 留 并 連 在 一 起 最 終 表達 的 片 段 。部 分 人 類 基 因 中 內(nèi) 含 子 序 列 所 占 的 比 例 分 析基 因 長 度 /kb 內(nèi) 含 子 數(shù) 量

32、 內(nèi) 含 子 所 占 比 例胰 島 素 1.4 2 67 -球 蛋 白 1.4 2 69血 清 蛋 白 18 13 89 膠 原 蛋 白 組 分 31 117 71 因 子 186 25 95萎 縮 性 肌 強 直 因 子 2400 78 99 RNA加 工 過 程 及 其 生 理 功 能 加 帽 反 應 mRNA從 細 胞 核 向 細 胞 質(zhì) 轉(zhuǎn) 運 ， 翻 譯 起 始 加 工 過 程 推 測 的 生 理 功 能 加 polyA反 應 轉(zhuǎn) 錄 終 止 ， 翻 譯 起 始 和 mRNA降 解 RNA的 剪 接 從 mRNA, tRNA和 rRNA分 子 中 切 除 內(nèi) 含 子 RNA的 切 割

33、 從 前 體 RNA中 釋 放 成 熟 tRNA和 rRNA 5 A B C D E F G 3DNA m RNA(cDNA)卵 清 蛋 白 基 因 與 cDNA的 雜 交 。 2. mRNA前 體 中 的 內(nèi) 含 子 的 保 守 序 列（ 1） GU-AG法 則 ， Chambon法 則多 數(shù) 細 胞 核 mRNA前 體 中 內(nèi) 含 子 的 5邊 界 序 列 為 GU， 3邊 界序 列 為 AG。 因 此 ， GU表 示 供 體 銜 接 點 的 5端 ， AG代 表 接納 體 銜 接 點 的 3端 。 這 種 寶 石 序 列 模 式 稱 為 GU-AG法 則 ，又 稱 為 Chambon法

34、則 。（ 2） 外 顯 子 與 內(nèi) 含 子 交 界 處 的 序 列 ， 內(nèi) 含 子 內(nèi) 部 的 部 分序 列 也 可 能 參 與 內(nèi) 含 子 的 剪 接 。 A/CAG GUPuAGU A Py rich AG G5 35剪 接 位 點 分 支 點 3剪 接 位 點外 顯 子 內(nèi) 含 子 外 顯 子圖 脊 椎 動 物 mRNA前 體 中 常 見 的 內(nèi) 含 子 剪 接 所 必 需 的 保 守 序 列許 多 發(fā) 生 分 叉 剪 接 的 核 mRNA內(nèi) 含 子 3 端 上 游 18-50個 核苷 酸 處 ， 存 在 一 個 序 列 Py80NPy87Pu75APy95， 其 中 A為 百 分之 百

35、 保 守 。 3.剪 接 體 進 行 的 mRNA的 剪 接 核 內(nèi) mRNA原 始 轉(zhuǎn) 錄 產(chǎn) 物 的 剪 輯 方 式 可 能 是 最 常 見 的 。在 這 一 模 式 中 ， RNA的 剪 輯 需 要 特 異 性 RNA-protein-復 合物 small nuclear rebonucleoproteins（ snRNP） 和 small nuclear RNAs（ snRNAs） 。 已 經(jīng) 發(fā) 現(xiàn) 至 少 有 5種 snRNAs-U1， U2， U4， U5， U6。 剪 切 位 點 特 征 ： b. 無 互 補 。 c. 位 于 內(nèi) 含 子 和 外 顯 子 交 界 處 。 d.

36、以 GU開 始 ， 以 AG告 終 。AG上 游外 顯 子 GUAAGU A分 支 點UACUAAC（ 酵 母 ） (P Y)nNCAG G 下 游外 顯 子5剪 接 位 點 3剪 接 位 點 剪 接 信 號 ：v 分 支 點 序 列 。v 5和 3剪 切 位 點 序 列 。a. 是 保 守 序 列 ， 有 共 同 的 結(jié) 構(gòu) 基 元 ： 5AGGUAAGU。 免 疫 球 蛋 白 1內(nèi) 含 子 UCAG GUCAGC UUGCAG GGGC表 4-3 剪 接 區(qū) 序 列 基 因 區(qū) 域 外 顯 子 內(nèi) 含 子 外 顯 子卵 清 蛋 白 內(nèi) 含 子 2 UAAG GUGAGC UUACAG GU

37、UG卵 清 蛋 白 內(nèi) 含 子 3 UCAG GUACAG AUUCAG UCUG 珠 蛋 白 內(nèi) 含 子 1 GCAG GUUGGU CCUUAG GCUG 珠 蛋 白 內(nèi) 含 子 2 CAGG GUGAGU CCACAG UCUC起 始 終 止SV40病 毒 早 期 T-抗 原 UAAG GUAAAU UUUUAG AUUC U1 U2AFsU1 snRNPU2 snRNPU2 沒 有 SXL蛋 白 的 合 成 SXL蛋 白 合 成2 3 4 SXL1 21 2 1 2 U2AF651 2 1 Part of 2沒 有 TRA蛋 白 的 合 成 TRA蛋 白 的 合 成果蠅中與性別分化相關(guān)

38、基因產(chǎn)物的特異性剪接過程 3 4 53 54雄 性 特 異 的 DSX蛋 白 雌 性 特 異 的 DSX蛋 白3 5Sxl pre-mRNAtra pre-mRNA dsx pre-mRNA 核 酶 的 發(fā) 現(xiàn) 最 早 認 為 RNA的 剪 接 由 蛋 白 質(zhì) （ 酶 ） 進 行 。實 驗 1： 材 料 ， 四 膜 蟲 26S rRNA6.4kb的 RNA前 體（ rRNA)（ rRNA加 工 過 程 慢 ） 分 析 ： 是 否 RNA前 體 中 混 有 某 種 蛋 白 ？細 胞 提 取 液 （ 未 加 ）414nt（ 內(nèi) 含 子 ）GTP4. I類 和 II類 內(nèi) 含 子 的 剪 接 實 驗

39、 2： 用 重 組 DNA制 備 RNA前 體重 組 DNA in vitro 轉(zhuǎn) 錄 RNA前 體GTP414nt 26S rRNA結(jié) 論 ： RNA具 有 自 我 剪 接 能 力 ， 稱 之 為 Ribozyme.1986年 獲 諾 貝 爾 獎 I類 內(nèi) 含 子 的 剪 切 機 制 剪 接 反 應 由 2個 轉(zhuǎn) 酯 反 應 完 成 （ 四 膜 蟲 、 細 菌 ） 。 a. 第 一 個 轉(zhuǎn) 酯 反 應 由 一 個 游 離 的 鳥 苷 或 鳥 苷 酸 介 導 ， 鳥苷 或 鳥 苷 酸 3-OH 作 為 親 核 基 團 攻 擊 內(nèi) 含 子 5的 磷 酸 二 酯 鍵 ，從 上 游 切 開 RNA鏈

40、 。 b. 上 游 外 顯 子 3-OH 攻 擊 內(nèi) 含 子 3位 核 苷 酸 上 的 磷 酸 二 酯鍵 ， 使 外 顯 子 1和 外 顯 子 2聯(lián) 結(jié) 。 c. 釋 放 內(nèi) 含 子 環(huán) 。 Group I內(nèi) 含 子 切 除 體 系 II類 內(nèi) 含 子 的 剪 切 機 制細胞內(nèi)定位： 存 在 于 真 核 生 物 的 線 粒 體 和 葉 綠 體 rRNA基 因 中特點： 轉(zhuǎn) 酯 反 應 無 需 游 離 鳥 苷 酸 或 鳥 苷 。過程：a. 由 內(nèi) 含 子 本 身 的 靠 近 3端 的 腺 苷 酸 2 OH作 為 親 核 基 團 攻擊 內(nèi) 含 子 5 端 的 磷 酸 二 酯 鍵 ， 從 上 游 切

41、 開 RNA鏈 后 形 成 套 索結(jié) 構(gòu) 。b. 再 由 上 游 外 顯 子 的 自 由 3 OH作 為 親 核 基 團 攻 擊 內(nèi) 含 子 3 位 核 苷 酸 上 的 磷 酸 二 酯 鍵 ， 使 內(nèi) 含 子 被 完 全 切 開 。c. 上 下 兩 個 外 顯 子 通 過 磷 酸 二 酯 鍵 相 連 。 Group II內(nèi) 含 子 切 除 體 系 剪 接 體 形 成 錘 頭 狀 構(gòu) 象 已 經(jīng) 發(fā) 現(xiàn) 有 幾 類 RNA的 自 我 剪 切 類 型 。 四 膜 蟲 的 rRNA剪 接 屬 類 。 酵 母 A- 2-OH 攻 擊 屬 類 。 無 論 哪 一 類 ， 均 要 形 成 一 定 的 催

42、化 構(gòu) 象 ， 如 已 確 定 的 錘 頭型 構(gòu) 象 。 4-28 4-29 剪 切 位 點 突 變 導 致 地 中 海 貧 血 癥 （ thalassemia) 地 中 海 貧 血 癥 起 因 于 血 紅 蛋 白 合 成 缺 陷 。 此 類 貧 血 癥 中 有 一 類 是 異 常 剪 接 引 起 。mRNA前 體 中 的 內(nèi) 含 子 （ intron)必 須 精 確 的 剪 切 掉 ，剪 切 位 置 發(fā) 生 一 個 核 苷 酸 的 差 異 ， 即 會 導 致 閱 讀 框（ reading frame)的 改 變 ， 從 而 合 成 非 功 能 蛋 白 。 -珠 蛋 白 的 第 一 內(nèi) 含 子

43、 發(fā) 生 突 變 ， 突 變 位 點 發(fā) 生 在 正 常 3剪接 位 點 上 游 ， 離 位 點 20個 N處 。 正 常 人 是 G， 病 人 是 A， 即 G A。 從 而 導 致 產(chǎn) 生 了 一個 新 的 3剪 接 位 點 （ 原 位 點 上 游 ） ， 新 剪 切 位 點 剪 切 ， 使mRNA中 密 碼 子 變 化 。 在 新 剪 切 點 后 的 第 7個 密 碼 子 是 蛋 白質(zhì) 合 成 的 終 止 密 碼 。 結(jié) 果 是 合 成 不 正 常 的 血 紅 蛋 白 -亞 基 ，導 致 貧 血 癥 。貧 血 病 人 5 CCTATTAGTCTATTTTCCACCCTTAGGCTGCTG

44、 3 正 常 人 5CCTATTGGTCTATTTTCCACCCTTAGGCTGCTG 3內(nèi) 含 子 區(qū) 外 顯 子 核 酶 發(fā) 現(xiàn) 的 意 義a. 生 命 的 最 初 形 式 可 能 是 RNA， 其 兼 有 DNA和 蛋 白 質(zhì) 的功 能 。b. 在 進 化 過 程 中 作 為 遺 傳 模 板 的 功 能 讓 位 于 DNA（ RNA不 穩(wěn) 定 ） 作 為 催 化 劑 的 功 能 讓 位 于 蛋 白 質(zhì) 。 c. 利 用 其 機 制 ， 設(shè) 計 合 成 特 異 性 切 割 病 毒 RNA或 其 它RNA的 核 酶 ， 以 便 于 治 療 包 括 愛 滋 病 、 癌 癥 在 內(nèi) 的 疾病 。

45、 核 酶 的 類 型 ：a.剪 切 型b.剪 接 型 2. RNA的 編 輯 、 再 編 碼 及 化 學 修 飾（ 1） RNA的 編 輯RNA的 編 輯 是 某 些 mRNA前 體 的 一 種 加 工 方 式 ，如 插 入 、 刪 除 或 取 代 一 些 核 苷 酸 殘 基 ， 導 致DNA所 編 碼 的 遺 傳 信 息 的 改 變 ， 因 為 經(jīng) 過 編輯 的 mRNA序 列 發(fā) 生 了 不 同 于 模 板 DNA的 變化 。類 型 位 點 特 異 性 脫 氨 基 作 用引 導 RNA指 導 的 尿 嘧 啶 插 入 或 刪 除 哺 乳 動 物 載 脂 蛋 白 mRNA的 編 輯CAA UA

46、A肝 中 剪 接 的 mRNA編 碼 含 4563個 殘 基 的 蛋 白 質(zhì) 腸 中 mRNA有 密 碼 子 在 第2153位 密 碼 子 終 止 合 成第 2153位 密 碼 子 編 碼 GlnCAA 哺 乳 動 物 中 RNA編 輯 的 實 例 組 織 靶 標 RNA 所 改 變 的 堿 基 結(jié) 果 肝 臟 、 腸 載 脂 蛋 白 C U 谷 氨 酰 胺 密 碼 子 終 止 子肌 肉 半 乳 糖 苷 酶 U A 苯 丙 氨 酸 密 碼 子 酪 氨 酸睪 丸 、 腫 瘤 等 Wilms腫 瘤 因 子 1 U C 亮 氨 酸 密 碼 子 脯 氨 酸腫 瘤 神 經(jīng) 纖 維 瘤 基 因 1 C U

47、 精 氨 酸 密 碼 子 終 止 子腦 谷 氨 酸 受 體 蛋 白 A I 多 個 谷 氨 酸 密 碼 子 精 氨 酸 利 什 曼 原 蟲 屬 細 胞 色 素 b mRNA的 編 輯AAAUAUAAUAGAAA G G C AAA UAUAA UAGAAUUUAUGUUGUCUU 與 指 導RNA配 對 U插 入釋 出 mRNAUUUAUGUUGUCUU 指 導 RNAmRNAmRNA RNA編 輯 的 生 物 學 意 義（ 1） 校 正 作 用（ 2） 調(diào) 控 翻 譯（ 3） 擴 充 遺 傳 信 息 2. RNA的 再 編 碼mRNA在 某 些 情 況 下 不 是 以 固 定 的 方 式 翻

48、 譯 ， 而是 可 以 改 變 原 來 的 編 碼 信 息 ， 以 不 同 的 方 式 進行 翻 譯 ， 科 學 上 把 RNA編 碼 和 讀 碼 方 式 的 改 變稱 為 RNA的 再 編 碼 。核 糖 體 1/-1移 位核 糖 體 跳 躍 3.RNA的 化 學 修 飾有 些 RNA， 特 別 是 rRNA和 tRNA， 還 可 能 有 特異 性 化 學 修 飾 。 圖 3-31例 如 ： 人 細 胞 內(nèi) rRNA分 子 就 存 在 106種 甲 基 化和 95種 假 尿 嘧 啶 產(chǎn) 物 。 2. rRNA轉(zhuǎn) 錄 后 的 加 工 真 核 生 物 有 4種 rRNA。 大 亞 基 （ 60S）

49、 rRNA: 28S(4700nt); 5S(120nt); 5.8S(160nt)。 小 亞 基 （ 40S） rRNA ： 18S（ 1900nt)。 其 中 5.8S rRNA 、 18S rRNA 、 28 S rRNA 為 一 個 轉(zhuǎn) 錄 單位 ， 前 體 為 45S RNA， 其 加 工 過 程 如 圖 。 5S rRNA與 tRNA在 一 個 轉(zhuǎn) 錄 單 位 中 。 4-30 轉(zhuǎn) 錄 后 加 工 步 驟 ： 切 除 成 熟 tRNA 5、 3序 列 ： 5- ： RNaseP。 3 ： 核 酸 內(nèi) 切 酶 和 外 切 酶 。 3-末 端 CCA湊 加 ： tRNA核 苷 酸 轉(zhuǎn) 移 酶 。 修 飾 ： 甲 基 化 ： 甲 基 轉(zhuǎn) 移 酶 。 氫 化 ： DHU 轉(zhuǎn) 位 ： 3. tRNA轉(zhuǎn) 錄 后 加 工 4-31