《RNA轉(zhuǎn)錄》課件

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1、第 三 章 RNA轉(zhuǎn) 錄 (RNA transcription) 6.1. 基 本 概 念6.2. 原 核 生 物 RNA轉(zhuǎn) 錄 的 起 始6.3. 真 核 生 物 RNA轉(zhuǎn) 錄 的 起 始6.4. 轉(zhuǎn) 錄 的 延 伸6.5. 轉(zhuǎn) 錄 的 終 止6.6. 原 核 生 物 轉(zhuǎn) 錄 產(chǎn) 物 的 后 加 工 6.7. 真 核 生 物 轉(zhuǎn) 錄 產(chǎn) 物 的 后 加 工6.8. 真 核 生 物 轉(zhuǎn) 錄 產(chǎn) 物 中 內(nèi) 元 的 去 除 6.9. 不 連 續(xù) 轉(zhuǎn) 錄 和 反 式 拼 接 第 一 節(jié) 基 本 概 念 轉(zhuǎn) 錄 (transcription):是 指 以 DNA為 模 板 ， 在 依 賴 于 DNA

2、的 RNA聚 和 酶 催 化 下 ， 以 4中 rNTP（ ATP、 CTP、 GTP和 UTP） 為 原 料 ， 合 成 RNA 的 過 程 。 在 有 些 病 毒 中 ， RNA也 可 以 指 導(dǎo) 合 成 RNA。 若 干 基 本 概 念t 是 基 因 表 達(dá) 的 第 一 步 ， 也 是 最 關(guān) 鍵 的 一 步 。t 以 Double Strand DNA中 的 一 條 單 鏈 作 為 轉(zhuǎn) 錄 模 板 (雜 交 實 驗 所 證 實 ) 有 義 鏈 (sense strand) 又 稱 編 碼 鏈 coding strand: 指 不 作 模 板 的 DNA單 鏈 反 義 鏈 (antise

3、nse strand) 又 稱 模 板 鏈 template srand : 指 作 為 模 板 進(jìn) 行 RNA轉(zhuǎn) 錄 的 鏈 (60年 代 以 前 的 表 示 方 法 與 此 相 反 ) 沒 有 A U G C 的 規(guī) 律 t 在 依 賴 DNA的 RNA聚 合 酶 作 用 下 進(jìn) 行 轉(zhuǎn) 錄t A U、 C G 合 成 RNA分 子t 轉(zhuǎn) 錄 合 成 RNA鏈 的 方 向 為 53， 模 板 單 鏈 DNA的 極 性 方 向 為 35， 而 非 模 板 單 鏈 的 極 性 方 向 與 RNA鏈 相 同 ， 均 為 53。 （ 書 寫 ） t 基 因 轉(zhuǎn) 錄 方 式 為 不 對 稱 轉(zhuǎn) 錄

4、(一 條 單 鏈 DNA 為 模 板 ,RNA 聚 合 酶 的 結(jié) 合 ) t RNA 的 轉(zhuǎn) 錄 包 括 promotion. elongation. terminaton 三 過 程 t 從 啟 動 子 (promoter)到 終 止 子 (terminator)稱 為 轉(zhuǎn) 錄 單 位 (transcription unit) (轉(zhuǎn) 錄 起 始 點 )t 原 核 生 物 的 轉(zhuǎn) 錄 單 位 多 為 polycistron in operon,真 核 生 物 中 的 轉(zhuǎn) 錄 單 位 多 為 monocistron, No operon t 轉(zhuǎn) 錄 起 點 即 轉(zhuǎn) 錄 原 點 記 為 1， 其

5、 上 游 記 為 負(fù) 值 ， 下 游 記 為 正 值 upstream start point downstream 10 1 10 第 二 節(jié) 原 核 生 物 RNA轉(zhuǎn) 錄 的 起 始(RNA Transcription promotion in prokaryots) 兩 個 相 關(guān) 概 念 : 操 縱 元 (operon): 是 原 核 生 物 基 因 表 達(dá) 調(diào) 控 的 一 個 完 整 單 元 ， 其 中 包 括 結(jié) 構(gòu) 基 因 、 調(diào) 節(jié) 基 因 、 操 作 子 和 啟 動 子 i p o z y aNo lac mRNAAbsence of lactoseActivei p o z

6、 y a -G alactosidasePermease TransacetylasePresence of lactose Inactive 啟 動 子 (promoter)： 是 指 DNA分 子 上 被 RNA聚 合 酶 識 別 并 結(jié) 合 形 成 起 始 轉(zhuǎn) 錄 復(fù) 合 物 的 區(qū) 域 ， 它 還 包 括 一 些 調(diào) 節(jié) 蛋 白 因 子 的 結(jié) 合 位 點 (頻 率 、 效 率 ) 一 、 原 核 生 物 的 RNA polymerase (E. coli)1、 全 酶 (Holo Enzyme)和 核 心 酶 (Core Enzyme) Core Enzyme Holo Enzyme

7、 (1) 全 酶 （ Holo Enzyme） 用 于 轉(zhuǎn) 錄 的 起 始 依 靠 空 間 結(jié) 構(gòu) 與 DNA模 板 結(jié) 合 (與 核 心 酶 結(jié) 合 后 引 起 的 構(gòu) 象 變 化 ) 專 一 性 地 與 DNA序 列 (啟 動 子 )結(jié) 合 結(jié) 合 常 數(shù) ： 1014 mol 半 衰 期 ： 數(shù) 小 時 （ 10 7 mol 1秒 以 下 ） 轉(zhuǎn) 錄 效 率 低 ， 速 度 緩 慢 （ 的 結(jié) 合 ） （ 2） 核 心 酶 （ Core Enzyme） 作 用 于 轉(zhuǎn) 錄 的 延 伸 過 程 （ 終 止 ） 依 靠 靜 電 引 力 與 DNA模 板 結(jié) 合 （ 蛋 白 質(zhì) 中 堿 性 基

8、 團(tuán) 與 DNA的 磷 酸 根 之 間 ） 非 專 一 性 的 結(jié) 合 （ 與 DNA的 序 列 無 關(guān) ） 結(jié) 合 常 數(shù) ： 1011 mol 半 衰 期 ： 60秒 此 外 ， 新 發(fā) 現(xiàn) 的 一 種 亞 基 的 功 能 尚 不 清 楚 。2、 各 亞 基 的 特 點 和 功 能 （ 1） 因 子 因 子 可 重 復(fù) 使 用 修 飾 RNApol構(gòu) 型 使 Holo Enzyme 識 別 啟 動 子 的 Sextama Box( 35區(qū) ), 并 通 過 與 模 板 鏈 結(jié) 合2 2 2 2（ 3） 全 酶 的 組 裝 過 程 不 同 的 因 子 識 別 不 同 的 啟 動 子 E.co

9、li 中 有 四 種 因 子 （ 70、 32、 54、 28） 枯 草 桿 菌 中 有 11種 因 子 （ 因 子 的 更 替 對 轉(zhuǎn) 錄 起 始 的 調(diào) 控 ）（ 2） 因 子 核 心 酶 的 組 建 因 子 促 使 RNApol 與 DNA模 板 鏈 結(jié) 合 2 2 前 端 因 子 使 模 板 DNA雙 鏈 解 鏈 為 單 鏈 尾 端 因 子 使 解 鏈 的 單 鏈 DNA重 新 聚 合 為 雙 鏈 （ 3） 因 子 促 進(jìn) RNApol NTP RNA elongation 完 成 NMP之 間 的 磷 酸 酯 鍵 的 連 接 Editing 功 能 （ 排 斥 與 模 板 鏈 不 互

10、 補(bǔ) 的 堿 基 ） 與 Rho （ ） 因 子 競 爭 RNA 3 end E site（ elongation site RifR） :對 NTP非 專 一 性 地 結(jié) 合 （ 催 化 作 用 和 Editing功 能 ） （ 4） 因 子 參 與 RNA非 模 板 鏈 （ sense strand） 的 結(jié) 合 （ 充 當(dāng) SSB） 構(gòu) 成 Holoenzyme 后 ， 因 子 含 有 兩 個 位 點 I site（ initiation site . Rifs） : 該 位 點 專 一 性 地 結(jié) 合 ATP或 者 GTP （ 需 要 高 濃 度 的 ATP或 GTP） 由 于 各 亞

11、 基 的 功 能 ， 使 全 酶 本 身 含 有 五 個 功 能 位 點 有 義 DNA鏈 結(jié) 合 位 點 （ 亞 基 提 供 ） DNA/RNA雜 交 鏈 結(jié) 合 位 點 （ 亞 基 提 供 ） 雙 鏈 DNA解 鏈 位 點 （ 前 端 亞 基 提 供 ） 單 鏈 DNA重 旋 位 點 （ 后 端 亞 基 提 供 ） 因 子 作 用 位 點 E. coli RNA polymerase用 于 起 始 和 延 伸 只 用 于 起 始36.5 KD36.5 KD 151 KD155 KD11 KD 70 KD 二 、 啟 動 子 （ promoter） 的 結(jié) 構(gòu) 與 功 能 （ Prok.E.

12、coli） 1、 啟 動 子 由 兩 個 部 分 組 成 （ 1） 上 游 部 分 CAP-cAMP結(jié) 合 位 點 （ 基 因 表 達(dá) 調(diào) 控 的 正 控 制 位 點 ） CAP（ catabolite gene Activator Protein） 降 解 物 基 因 活 化 蛋 白 ， 環(huán) 腺 苷 酸 （ cAMP） 的 受 體 蛋 白 （ 2） 下 游 部 分 RNApol的 進(jìn) 入 （ 結(jié) 合 ） 位 點 35 10 包 括 識 別 位 點 和 結(jié) 合 位 點 （ R B位 點 ） 2、 RNA聚 合 酶 的 進(jìn) 入 位 點 （ 1） Sextama 框 （ Sextama Box）

13、-35序 列 ， RNA聚 合 酶 的 松 弛 （ 初 始 ） 結(jié) 合 位 點 ， RNA聚 合 酶 依 靠 其 亞 基 識 別 該 位 點 識 別 位 點 （ R位 點 ） 大 多 數(shù) 啟 動 子 中 共 有 序 列 為 T82T84G78A65C54A45 重 要 性 :很 大 程 度 上 決 定 了 啟 動 子 的 強(qiáng) 度 （ RNApol 的 因 子 ） 位 置 在 不 同 啟 動 子 中 略 有 變 動 （ 2） Pribonow 框 （ Pribonow Box） -10序 列 ， RNA聚 合 酶 的 牢 固 結(jié) 合 位 點 結(jié) 合 位 點 （ B 位 點 ） 一 致 序 列 ：

14、 T80A95T45A60A50T96 （ TATPUAT） 位 置 范 圍 4 到 13因 此 又 稱 TATA Box 保 守 T （ 3） 起 始 位 點 （ initiation site） ： 1位 點 RNA聚 合 酶 的 轉(zhuǎn) 錄 起 始 位 點 起 始 NTP多 為 ATP或 GTP 起 始 過 程 ： a. 全 酶 與 啟 動 子 結(jié) 合 的 封 閉 型 啟 動 子 復(fù) 合 物 的 形 成 （ R位 點 被 因 子 發(fā) 現(xiàn) 并 結(jié) 合 ） b、 開 放 型 啟 動 子 復(fù) 合 物 的 形 成 RNApol的 一 個 適 合 位 點 到 達(dá) 10序 列 區(qū) 域 ， 誘 導(dǎo) 富 含

15、 AT的 Pribnow 框 的 “ 熔 解 ” ， 形 成 12 17bp的 泡狀 物 ， 同 時 酶 分 子 向 10序 列 轉(zhuǎn) 移 并 與 之 牢 固 結(jié) 合 開 放 型 啟 動 子 復(fù) 合 物 使 RNApol聚 合 酶 定 向 兩 種 復(fù) 合 物 均 為 二 元 復(fù) 合 物 （ 全 酶 和 DNA ） 12 17bp c. 在 開 放 型 的 啟 動 子 復(fù) 合 物 中 ， RNApol的 I位 點 和 E位 點 的 核 苷 酸 前 體 間 形 成 第 一 個 磷 酸 二 酯 鍵 （ 亞 基 ） 三 元 復(fù) 合 物 形 成 +1位 多 為 CAT模 式 ,位 于 離 開 保 守 T

16、69 個 核 苷 酸 處 -6-9 bp- GC T ATTG ACA TATAAT-16-18 bp- +1-35 sequence -10 sequence（ 4） 因 子 解 離 核 心 酶 與 DNA的 親 和 力 下 降 起 始 過 程 結(jié) 束 核 心 酶 移 動 進(jìn) 入 延 伸 過 程 轉(zhuǎn) 錄 的 起 始 過 程 核 心 酶12 17bp （ 亞 基 ） 3、 CAP-cAMP 結(jié) 合 位 點 （ 也 稱 CAP位 點 ） 轉(zhuǎn) 錄 調(diào) 控 中 ， I 阻 遏 蛋 白 負(fù) 調(diào) 控 lac 操 縱 子 模 型 I 許 多 基 因 的 表 達(dá) 還 存 在 正 調(diào) 控 機(jī) 制 例 如 :

17、E.coli 培 養(yǎng) 基 中 乳 糖 和 葡 萄 糖 共 存 時 只 有 葡 萄 糖 被 利 用 原 因 ： CAP位 點 的 正 調(diào) 控 葡 萄 糖 缺 少 時 ， 腺 苷 酸 環(huán) 化 酶 將 ATP cAMP， cAMP與 CAP位 點 結(jié) 合 ,此 時 啟 動 子 的 進(jìn) 入 位 點 才 能 與 RNApol結(jié) 合 葡 萄 糖 存 在 時 ， cAMP不 能 形 成 ， 沒 有 CAP cAMP 與 CAP位 點 結(jié) 合 ， 啟 動 子 的 RNApol進(jìn) 入 位 點 不 能 結(jié) 合 RNApol 因 此 ,一 個 操 縱 元 中 有 兩 道 控 制 開 關(guān) ,只 有 同 時 打 開 ,

18、結(jié) 構(gòu) 基 因 才 能 進(jìn) 行 轉(zhuǎn) 錄 。（ 對 lac操 縱 元 而 言 ， 只 有 沒 有 葡 萄 糖 ， 有 乳 糖 時 才 能 進(jìn) 行 錄 ）（ 1） CAP位 點 的 組 成 （ 70 40） 位 點 ： 70 50 包 括 一 個 IR 序 列 強(qiáng) 結(jié) 合 位 點 位 點 ： 50 40 弱 結(jié) 合 位 點 位 點 對 位 點 具 有 協(xié) 同 效 應(yīng) （ cooperativity） （ 2） 位 點 結(jié) 合 CAP cAMP復(fù) 合 物 后 ， 促 使 RNApol進(jìn) 入 Sextama Box,最 終 與 10序 列 結(jié) 合 起 始 轉(zhuǎn) 錄 原 因 ： CAP cAMP復(fù) 合 物

19、 與 位 點 結(jié) 合 Sextama Box 富 含 GC區(qū) 域 （ GC島 區(qū) ） 穩(wěn) 定 性 降 低 Pribnow Box 的 溶 解 溫 度 降 低 促 進(jìn) 開 放 型 啟 動 子 復(fù) 合 物 的 形 成 促 進(jìn) 轉(zhuǎn) 錄 上 節(jié) 課 內(nèi) 容 回 顧 :1、 原 核 生 物 RNApol：2、 原 核 啟 動 子 的 結(jié) 構(gòu) ： RNApol進(jìn) 入 位 點 起 始 過 程 上 游 位 點 的 組 成 和 功 能 4、 RNApol 在 DNA上 結(jié) 合 位 點 的 鑒 定 DNase 法 -40bp 而 足 跡 法 （ footprinting） 結(jié) 果 相 對 準(zhǔn) 確 足 跡 法 原

20、理 ： 限 制 酶 切 割 結(jié) 合 有 RNApol的 DNA 大 分 子 DNA 末 端 標(biāo) 記 該 DNA（ Klenow片 段 標(biāo) 記 3,堿 性 磷 酸 酯 酶 標(biāo) 記 5） 用 內(nèi) 切 酶 降 解 DNA（ 控 制 反 應(yīng) 條 件 ） 凝 膠 電 泳 分 離 ， 放 射 自 顯 影 觀 察 限 制 酶 切分 離 大 片 段 DNA 末 端 標(biāo) 記 大 分 子 DNA重 新 結(jié) 合 RNApol 作 對 照直 接 用 DNase 進(jìn) 行 降 解電 泳 用 微 量 DNase降 解電 泳 用 足 跡 法 鑒 定 出 來 的 RNApol 與 DNA的 結(jié) 合 區(qū) 域 為 +20 50（

21、40） ， 大 約 60 70 bp 實 驗 中 還 發(fā) 現(xiàn) . 5、 啟 動 子 各 位 點 與 轉(zhuǎn) 錄 效 率 的 關(guān) 系 （ 1） 35 序 列 與 10 序 列 與 轉(zhuǎn) 錄 效 率 的 關(guān) 系 標(biāo) 準(zhǔn) 啟 動 子 35 TTGACA 10 TATAAT 則 不 同 的 啟 動 子 a. 與 標(biāo) 準(zhǔn) 啟 動 子 序 列 同 源 性 越 高 啟 動 強(qiáng) 度 越 大 b. 與 標(biāo) 準(zhǔn) 啟 動 子 同 源 性 越 低 啟 動 強(qiáng) 度 越 小 c. 與 標(biāo) 準(zhǔn) 啟 動 子 差 異 很 大 時 由 另 一 種 因 子 啟 動原 因 : 35序 列 通 過 被 因 子 識 別 的 容 易 決 定 啟

22、 動 子 強(qiáng) 度 10序 列 影 響 開 放 型 啟 動 子 復(fù) 合 物 形 成 的 速 度 決 定 啟 動 子 強(qiáng) 度 （ 2） 35序 列 與 10序 列 的 間 隔 區(qū) 與 轉(zhuǎn) 錄 效 率 的 關(guān) 系 堿 基 序 列 并 不 重 要 間 距 非 常 重 要 ， 17bp的 間 距 轉(zhuǎn) 錄 效 率 最 高 間 距 上 的 突 變 種 類 ： 間 距 趨 向 于 17bp 上 升 突 變 間 距 遠(yuǎn) 離 17bp 下 降 突 變 啟 動 子 上 升 突 變 、 啟 動 子 下 降 突 變 E.Coli各 識 別 的 啟 動 子 的 序 列 第 三 節(jié) 真 核 生 物 RNA轉(zhuǎn) 錄 的 啟 動

23、RNA Transcription promotion in Eukaryots 一 、 真 核 生 物 的 RNApol 1、 三 種 RNApol： 根 據(jù) 對 - 鵝 膏 蕈 堿 的 敏 感 性 不 同 而 分 類 RNApol 最 不 敏 感 （ 動 、 植 、 昆 ） RNApol 最 敏 感 RNApol 不 同 種 類 的 敏 感 性 不 同 2、 位 置 和 轉(zhuǎn) 錄 產(chǎn) 物 RNApol 核 仁 活 性 所 占 比 例 最 大 轉(zhuǎn) 錄 rRNA（ 5.8S、 18S、 28S） RNApol 核 質(zhì) 主 要 負(fù) 責(zé) hnRNA、 snRNA 的 轉(zhuǎn) 錄 hnRNA（ mRNA

24、前 體 ， 核 不 均 一 RNA heterogeneous nuclear RNA） snRNA（ 核 內(nèi) 小 分 子 RNA small nulear RNA) RNApol 核 質(zhì) 負(fù) 責(zé) tRNA、 5S rRNA、 Alu序 列 和 部 分 snRNA 目 前 在 線 粒 體 和 葉 綠 體 內(nèi) 發(fā) 現(xiàn) 少 數(shù) RNApol（ 活 性 較 低 ） 3、 亞 基 組 成 ： 分 子 量 500KDa,含 兩 個 大 亞 基 和 712 個 小 亞 基 RNApol ： 大 亞 基 中 有 C 末 端 結(jié) 構(gòu) 域 (carboxy terminal domain CTD) CTD中 含

25、 一 保 守 氨 基 酸 序 列 的 多 個 重 復(fù) Tyr Ser Pro Thr Ser Pro Ser C 端 重 復(fù) 七 肽 不 同 生 物 中 重 復(fù) 數(shù) 目 不 一 樣 （ 酶 活 性 ） CTD中 的 Ser和 Thr可 被 高 度 磷 酸 化 磷 酸 化 的 RNApol 被 稱 為 A 非 磷 酸 化 的 RNApol 稱 為 B CTD參 與 轉(zhuǎn) 錄 B A 使 RNApol易 于 離 開 啟 動 子 進(jìn) 入 延 伸 過 程 （ 10倍 ） 二 、 真 核 生 物 的 啟 動 子 三 種 RNApol 三 種 轉(zhuǎn) 錄 方 式 三 種 啟 動 子 三 類 基 因 ， 類 類

26、類 1、 RNApol 的 啟 動 子 結(jié) 構(gòu) 最 復(fù) 雜 位 于 轉(zhuǎn) 錄 起 始 點 的 上 游 ,有 多 個 短 序 列 元 件 組 成 通 用 型 啟 動 子 （ 無 組 織 特 異 性 ） （ 1） 帽 子 位 點 （ cap site） ： 轉(zhuǎn) 錄 起 始 位 點 與 Prok.的 “ CAT模 式 ” 相 似 （ 2） TATA框 （ Hogness 框 或 Goldberg-Hogness 框 ） 位 于 30處 一 致 序 列 為 T 82A97T93A85A63（ T37） A83A50（ T37） 定 位 轉(zhuǎn) 錄 起 始 點 的 功 能 （ 類 似 原 核 的 Pribno

27、w框 ） TATA是 絕 大 多 數(shù) 真 核 基 因 的 正 確 表 達(dá) 所 必 需 的（ 3） CAAT框 （ CAAT box） 位 于 75bp處 一 致 序 列 為 GGC/TCAATCT 前 兩 個 G 的 作 用 十 分 重 要 (轉(zhuǎn) 錄 效 率 ) 增 強(qiáng) 啟 動 子 的 效 率 、 頻 率 ， 不 影 響 啟 動 子 的 特 異 性 （ 距 轉(zhuǎn) 錄 起 始 點 的 距 離 ， 正 反 方 向 ） 以 上 三 個 保 守 序 列 在 絕 大 多 數(shù) 啟 動 子 中 都 存 在 （ 4） 增 強(qiáng) 子 （ enhancer） （ 又 稱 遠(yuǎn) 上 游 序 列 far upstream

28、sequence） 在 100以 上 SV40的 兩 個 正 向 重 復(fù) 研 究 得 最 清 楚 （ DR） -107178 、 179 250 各 72bp 該 增 強(qiáng) 子 的 特 點 如 下 ： 對 依 賴 于 TATA框 的 轉(zhuǎn) 錄 的 增 強(qiáng) 效 應(yīng) 高 于 不 依 賴 的 情 況 距 離 效 應(yīng) : 離 72bp越 近 的 容 易 起 始 轉(zhuǎn) 錄 轉(zhuǎn) 錄 方 向 離 開 72bp的 起 始 序 列 優(yōu) 先 轉(zhuǎn) 錄 細(xì) 胞 類 型 的 選 擇 ： 不 同 類 型 中 作 用 有 差 異 表 明 其 作 用 具 有 細(xì) 胞 或 組 織 特 異 性 （ 調(diào) 節(jié) 蛋 白 ）（ 5） GC框

29、（ GC box） 位 于 90附 近 ， 較 常 見 的 成 分 核 心 序 列 為 GGGCGG 可 有 多 個 拷 貝 ， 也 可 以 正 反 兩 方 向 排 列 （ 6） 其 他 元 件 八 聚 核 苷 酸 元 件 （ octamer element OCT元 件 ） 一 致 序 列 為 ATTTGCAT KB元 件 一 致 序 列 為 GGGACTTTCC ATF元 件 一 致 序 列 為 GTGACGT 還 有 一 些 位 于 起 始 點 下 游 的 相 關(guān) 元 件（ 7） 不 同 元 件 的 組 合 情 況 不 同 元 件 的 數(shù) 目 、 位 置 、 和 排 列 方 向 均 有

30、差 異 例 如 ： SV40的 早 期 啟 動 子 中 有 6個 GC框 小 結(jié) ： 不 同 啟 動 子 中 每 種 元 件 與 轉(zhuǎn) 錄 起 始 點 的 距 離 不 同 不 同 啟 動 子 中 的 相 應(yīng) 元 件 互 相 交 換 ,形 成 的 雜 交 啟 動 子 功 能 沒 有 變 化 各 種 元 件 將 相 應(yīng) 的 蛋 白 因 子 結(jié) 合 到 啟 動 子 上 ， 組 成 起 始 復(fù) 合 物 ， 蛋 白 因 子 間 的 相 互 作 用 決 定 了 轉(zhuǎn) 錄 的 起 始 2、 RNApol 啟 動 子 結(jié) 構(gòu) （ 1） 分 為 三 類 ， 每 種 識 別 方 式 不 同 a、 下 游 啟 動 子

31、（ 內(nèi) 部 啟 動 子 ） 位 于 轉(zhuǎn) 錄 起 始 點 的 下 游 5SRNA 和 tRNA基 因 可 分 為 兩 類 b、 上 游 啟 動 子 snRNA （ 2） 內(nèi) 部 啟 動 子 的 發(fā) 現(xiàn) 最 早 發(fā) 現(xiàn) 于 非 洲 爪 蟾 的 5S rRNA基 因 試 驗 設(shè) 置 ： 非 洲 爪 蟾 的 卵 母 細(xì) 胞 提 取 液 作 為 體 外 轉(zhuǎn) 錄 體 系 ， 進(jìn) 行 缺 失 試 驗 以 不 同 長 度 的 5S rRNA基 因 為 模 板 進(jìn) 行 轉(zhuǎn) 錄 結(jié) 果 ： 缺 失 55以 前 和 缺 失 80以 后 的 序 列 都 能 正 常 轉(zhuǎn) 錄 缺 失 55到 80序 列 不 能 轉(zhuǎn) 錄

32、結(jié) 論 ： 5S rRNA基 因 的 啟 動 子 位 于 基 因 內(nèi) 部 該 啟 動 子 可 使 RNApol 在 其 上 游 的 55bp處 起 始 轉(zhuǎn) 錄（ 3） 內(nèi) 部 啟 動 子 分 為 兩 類 均 含 兩 個 短 序 列 元 件 ， 中 間 由 其 他 序 列 隔 開 第 一 類 ： 含 A框 和 C框 （ 5S rRNA基 因 ） 第 二 類 ： 含 A框 和 B框 （ tRNA基 因 、 VARNA基 因 ） 間 隔 序 列 長 短 差 異 很 大 其 中 內(nèi) 部 啟 動 子 起 被 RNApol 識 別 的 作 用 上 節(jié) 課 內(nèi) 容 回 顧 :1、 RNApol在 DNA上

33、結(jié) 合 位 點 的 鑒 定2、 啟 動 子 的 各 部 位 與 轉(zhuǎn) 錄 效 率 的 關(guān) 系3、 真 核 生 物 RNApol： 種 類 及 各 自 轉(zhuǎn) 錄 的 基 因 亞 基 組 成4、 RNApol 的 啟 動 子5、 RNApol 的 啟 動 子 三 、 真 核 生 物 轉(zhuǎn) 錄 的 起 始 三 種 RNApol均 沒 有 對 啟 動 子 特 異 序 列 的 識 別 能 力 轉(zhuǎn) 錄 起 始 過 程 需 要 很 多 的 輔 助 因 子 (轉(zhuǎn) 錄 因 子 )參 與 , 并 且 按 一 定 順 序 與 DNA形 成 復(fù) 合 物 ,協(xié) 助 RNApol定 位 于 轉(zhuǎn) 錄 起 始 點 RNApol T

34、BP因 子 RNApol RNApol 的 轉(zhuǎn) 錄 起 始 兩 種 內(nèi) 部 啟 動 子 的 轉(zhuǎn) 錄 起 始 需 要 三 種 輔 助 因 子 TF A 一 種 含 鋅 指 結(jié) 構(gòu) 的 蛋 白 TF B 由 TBP和 BRT、 B” TF C 至 少 5個 亞 基 以 上 TBP 的 作 用 所 有 RNApol 的 轉(zhuǎn) 錄 起 始 都 需 要 TBP 在 RNApol 的 轉(zhuǎn) 錄 起 始 過 程 中 ,TBP是 SL1的 組 份 ， 起 定 位 RNApol 的 作 用 RNApol 的 轉(zhuǎn) 錄 起 始 由 TBP識 別 TATA框 TBP 起 定 位 作 用 ,所 以 又 稱 定 位 因 子

35、（ positioning factor） 第 四 節(jié) 轉(zhuǎn) 錄 延 伸 Transcription Elongation 一 、 起 始 到 延 伸 的 轉(zhuǎn) 變 始 于 第 一 個 磷 酸 二 酯 鍵 的 形 成 伴 隨 著 DNA分 子 和 酶 分 子 構(gòu) 象 的 變 化 1、 Prok. 起 始 時 ， 因 子 有 利 于 和 亞 基 具 有 與 DNA專 一 性 結(jié) 合 所 要 求 的 構(gòu) 象 起 始 后 , 因 子 解 離 , 和 亞 基 構(gòu) 象 發(fā) 生 變 化 2、 Euk. 多 種 輔 助 因 子 的 共 同 作 用 來 保 證 這 一 轉(zhuǎn) 變 二 、 延 伸 過 程 （ Prok

36、） 酶 與 產(chǎn) 物 RNA不 解 離 底 物 NTP不 斷 加 到 RNA鏈 的 3 -OH 端 形 成 一 個 磷 酸 二 酯 鍵 后 ， 核 心 酶 向 前 滑 動 延 伸 位 點 不 斷 地 接 受 新 的 NTP， RNA鏈 不 斷 延 伸 始 終 保 持 三 元 復(fù) 合 物 的 結(jié) 構(gòu) 1、 轉(zhuǎn) 錄 泡 RNApol 結(jié) 合 和 轉(zhuǎn) 錄 的 DNA模 板 區(qū) 域 ， 有 17bp左 右 DNA形 成 解 鏈 區(qū) 轉(zhuǎn) 錄 泡 處 雜 交 雙 鏈 很 短 胰 臟 RNAase_其 長 度 10bp（ 不 準(zhǔn) 確 ） 推 測 也 就 兩 個 核 苷 酸 左 右 2、 拓 撲 學(xué) 問 題 R

37、NA合 成 過 程 中 ， 轉(zhuǎn) 錄 泡 兩 端 要 發(fā) 生 拓 撲 轉(zhuǎn) 變 RNApol 的 前 沿 .解 螺 旋 作 用 RNApol 后 端 .DNA的 螺 旋 化 （ 保 持 ） 超 纏 問 題 的 解 決 靠 DNA旋 轉(zhuǎn) 酶 RNA-DNA雜 交 鏈 也 要 求 作 旋 轉(zhuǎn) 運 動 旋 轉(zhuǎn) 酶 3、 轉(zhuǎn) 錄 過 程 中 的 延 宕 （ 1） RNA的 合 成 速 度 大 約 30 50 個 核 苷 酸 秒 ,與 蛋 白 質(zhì) 的 合 成 速 度 相 近 （ 15個 AA sec） （ 2） 模 板 DNA中 G C 的 存 在 延 宕 （ G C后 的 810 個 核 苷 酸 ） 延

38、宕 作 用 在 RNA鏈 的 終 止 和 釋 放 中 起 重 要 作 用思 考 : 延 宕 發(fā) 生 的 原 因 ? 第 五 節(jié) 轉(zhuǎn) 錄 的 終 止 Transcri pti on termi nati on 終 止 過 程 ： 酶 停 止 添 加 底 物 釋 放 RNA鏈 酶 解 離 終 止 反 應(yīng) 雜 合 雙 鏈 的 氫 鍵 斷 裂 ， 重 新 形 成 雙 螺 旋 ， 酶 的 解 離 。 終 止 子 （ terminator） ： 在 轉(zhuǎn) 錄 的 過 程 中 ， 提 供 轉(zhuǎn) 錄 終 止 信 號 的 RNA序 列 真 正 起 終 止 作 用 的 是 RNA序 列 與 啟 動 子 不 同 Pro

39、k.和 Euk. 都 具 有 一 種 基 因 表 達(dá) 調(diào) 控 的 手 段 一 、 原 核 生 物 的 終 止 子 1、 終 止 子 的 種 類 （ 1） 內(nèi) 在 終 止 子 （ 不 依 賴 因 子 的 終 止 子 ） 體 外 實 驗 中 ， 只 有 核 心 酶 和 終 止 子 就 足 以 使 轉(zhuǎn) 錄 終 止 （ 2） 依 賴 因 子 的 終 止 子 蛋 白 質(zhì) 輔 助 因 子 因 子 存 在 時 ， 核 心 酶 終 止 轉(zhuǎn) 錄 兩 者 有 共 同 的 結(jié) 構(gòu) 特 征 （ 序 列 差 異 ） 2、 不 依 賴 因 子 的 終 止 子 結(jié) 構(gòu) 特 征 : 一 是 形 成 一 個 發(fā) 夾 結(jié) 構(gòu) 莖

40、 . 720 bp的 IR序 列 形 成 （ 富 含 G/C） 環(huán) .中 間 不 重 復(fù) 序 列 形 成 發(fā) 夾 結(jié) 構(gòu) 的 突 變 可 阻 止 轉(zhuǎn) 錄 的 終 止 二 是 6 8 個 連 續(xù) 的 U串 （ 發(fā) 夾 結(jié) 構(gòu) 末 端 ） 不依賴終止子結(jié)構(gòu) IR IR莖 部 富 含 GC 3、 依 賴 因 子 的 終 止 子 （ 1） 結(jié) 構(gòu) IR序 列 中 的 G C 對 含 量 較 少 發(fā) 夾 結(jié) 構(gòu) 末 端 沒 有 固 定 特 征 （ 2） 靠 與 的 共 同 作 用 而 實 現(xiàn) 終 止 無 連 續(xù) U串G/C 含量較少 二 、 原 核 生 物 轉(zhuǎn) 錄 的 終 止 1、 不 依 賴 因 子

41、的 終 止 子 終 止 轉(zhuǎn) 錄 （ 1） 新 生 RNA鏈 發(fā) 夾 結(jié) 構(gòu) 形 成 與 RNApol發(fā) 生 作 用 造 成 高 度 延 宕 （ 典 型 的 有 60秒 左 右 ） （ 2） RNApol暫 停 為 終 止 提 供 了 機(jī) 會 ， 6 8個 連 續(xù) 的 U 串 可 能 為 RNApol與 模 板 的 解 離 提 供 了 信 號 RNA DNA之 間 的 rU dA 結(jié) 合 力 較 弱 阻 止 RNA鏈 的 釋 放 于 是 ： RNA DNA解 離 三 元 復(fù) 合 體 解 體 RNApol解 離 轉(zhuǎn) 錄 終 止（ 3） 真 正 的 終 止 點 不 固 定 ， 在 U串 中 的 任

42、何 一 處（ 4） IR序 列 和 U串 同 等 重 要 IR中 的 G C對 含 量 的 減 少 U串 的 縮 短 或 缺 失（ 5） DNA上 與 U串 對 應(yīng) 的 為 富 含 A T的 區(qū) 域 說 明 ： AT富 含 區(qū) 在 轉(zhuǎn) 錄 的 終 止 和 起 始 中 均 起 重 要 的 作 用 2、 依 賴 因 子 的 終 止 子 終 止 轉(zhuǎn) 錄 （ 1） 通 讀 （ read through） ： 在 依 賴 因 子 的 轉(zhuǎn) 錄 終 止 過 程 中 ， RNApol 轉(zhuǎn) 錄 了 IR 序 列 之 后 ， 雖 發(fā) 生 一 定 時 間 的 延 宕 ， 但 如 果 沒 有 因 子 存 在 ， 則

43、RNApol 會 繼 續(xù) 轉(zhuǎn) 錄 （ 2） 因 子 a、 活 性 形 式 為 六 聚 體 促 進(jìn) 轉(zhuǎn) 錄 終 止 的 活 性 ， NTPase 活 性 b、 RNA長 度 大 于 50nt時 ， 依 賴 RNA的 NTPase活 性 最 大 說 明 ： 因 子 識 別 和 結(jié) 合 的 是 RNA（ 3） 因 子 對 終 止 子 的 作 用 a、 因 子 與 RNA結(jié) 合 （ 終 止 子 上 游 的 某 一 處 ， RNA的 5端 ） b、 因 子 沿 RNA從 5 3 移 動 （ NTP水 解 供 能 ） （ 終 止 子 處 的 較 長 時 間 的 延 宕 給 因 子 追 趕 的 機(jī) 會 ）c

44、、 因 子 與 RNApol 相 互 作 用 而 造 成 轉(zhuǎn) 錄 的 終 止 結(jié) 合 上 來 追 趕RNApol追 趕 上 來（ 暫 停 ） 與 RNApol相互 作 用 使 雜 交 鏈解 鏈 終 止 子 （ 4） 終 止 反 應(yīng) 還 需 要 RNA 與 DNA 的 相 互 作 用 即 ： 需 要 一 定 的 RNA序 列 因 為 ： 其 與 模 板 的 結(jié) 合 力 必 須 弱 到 一 定 數(shù) 值 ， 才 能 配 合 因 子 與 RNApol 的 作 用 （ 發(fā) 夾 結(jié) 構(gòu) 下 游 的 AU序 列 ） 序 列 不 同 的 終 止 子 不 同 的 終 止 程 度 基 因 表 達(dá) 調(diào) 控 的 途

45、徑 之 一 （ 5） Prok.依 賴 因 子 的 終 止 子 為 基 因 表 達(dá) 調(diào) 控 提 供 了 一 種 方 式 因 為 ： Prok.中 轉(zhuǎn) 錄 與 翻 譯 偶 聯(lián) ？ ？ 為 什 么 同 一 個 轉(zhuǎn) 錄 元 里 近 基 因 的 一 個 無 義 突 變 能 阻 止 遠(yuǎn) 基 因 的 表 達(dá) 這 一 極 性 現(xiàn) 象 RNApol核 糖 體因 子 無 義 突變 位 點 三 、 終 止 與 抗 終 止 及 抗 終 止 因 子 各 種 生 物 采 用 不 同 的 手 段 控 制 不 同 發(fā) 育 階 段 的 基 因 表 達(dá) * 枯 草 桿 菌 -更 替 因 子 * T7噬 菌 體 -更 換 RNA

46、pol * 噬 菌 體 采 用 依 賴 于 因 子 的 終 止 以 及 通 過 抗 終 止 因 子 的 抗 終 止 作 用 Phage 的操縱元組織情況 PMPL PR PR重組 復(fù) 制 裂解溶 原 周 期 溶 菌 周 期 PN PQ抗 終 止 作 用 的 過 程早 期遲 早 期 晚 期 抗 終 止 的 機(jī) 制 依 賴 于 噬 菌 體 本 身 的 依 賴 因 子 的 終 止 子 依 賴 因 子 的 終 止 子 上 游 有 抗 終 止 信 號 (靠 近 PL 的 nutL， 靠 近 tR1的 nutR nutPN utilization) 抗 終 止 蛋 白 和 nut位 點 的 結(jié) 合 ， 等

47、 待 RNApol經(jīng) 過 時 修 飾 RNApol的 構(gòu) 象 ， 拮 抗 寄 主 編 碼 的 終 止 蛋白 的 活 性 ,使 之 通 過 那 些 依 賴 的 終 止 子 上 節(jié) 課 內(nèi) 容 回 顧 :1、 轉(zhuǎn) 錄 的 延 伸2、 轉(zhuǎn) 錄 的 終 止 不 依 賴 因 子 的 終 止 子 終 止 轉(zhuǎn) 錄 依 賴 因 子 的 終 止 子 終 止 轉(zhuǎn) 錄3、 抗 終 止 四 、 真 核 生 物 的 終 止 子 及 轉(zhuǎn) 錄 終 止 了 解 很 少 （ 3 末 端 ） 1、 RNApol 的 終 止 子 類 似 Prok.不 依 賴 因 子 終 止 子 ， 終 止 可 能 靠 RNApol 本 身 完 成

48、 SV40的 終 止 子 : 發(fā) 夾 結(jié) 構(gòu) U串 2、 RNApol 的 終 止 子 類 似 原 核 生 物 （ 發(fā) 夾 結(jié) 構(gòu) U串 ） U串 位 于 發(fā) 夾 結(jié) 構(gòu) 的 頂 端 且 保 守 性 很 強(qiáng) （ 酵 母 人 ） 環(huán) 和 柄 對 轉(zhuǎn) 錄 的 終 止 同 等 重 要 第 六 節(jié) 原 核 生 物 轉(zhuǎn) 錄 產(chǎn) 物 的 后 加 工Pre-RNA processing in Prokaryotes Prok.的 mRNA半 衰 期 只 有 幾 分 鐘 （ 基 因 表 達(dá) 調(diào) 控 的 一 種 手 段 ） rRNA、 tRNA比 較 穩(wěn) 定 半 衰 期 幾 小 時 成 熟 分 子 和 轉(zhuǎn) 錄

49、產(chǎn) 物 的 差 別 ： 5 單 磷 酸 三 磷 酸 分 子 大 小 異 常 堿 基 一 、 rRNA 后 加 工 1、 基 因 排 列 方 式 三 種 rRNA 基 因 （ 5S、 16S、 23S） 與 tRNA 的 基 因 形 成 操 縱 元 （ rrn） （ E.coli 七 個 ） 每 個 rrn中 tRNA 基 因 無 固 定 模 式 （ 種 類 、 數(shù) 量 、 位 置 ） 三 個 rRNA基 因 的 相 對 位 置 有 一 定 規(guī) 律 16S rDNA間 隔 tDNA.23S rDNA.5S rDNA收 尾 tDNA加 工 過 程 主 要 是 RNAse 等 酶 的 作 用 雙 鏈

50、 區(qū) 域 二 、 tRNA的 轉(zhuǎn) 錄 后 加 工 1、 tRNA 基 因 （ 1） 轉(zhuǎn) 錄 單 元 大 多 是 多 基 因 的 同 一 個 tRNA基 因 、 不 同 tRNA基 因 、 與 rRNA基 因 （ 2） 有 兩 種 類 型 的 tRNA 基 因 ： 型 具 有 3端 的 CCA序 列 型 沒 有 3端 的 CCA序 列 （ 3） 型 需 在 酶 的 作 用 下 切 除 CCA下 游 一 段 序 列 （ Prok. 的 tRNA多 為 型 ） 型 需 要 在 酶 的 作 用 下 添 加 CCA序 列 （ 少 數(shù) Phage 、 Euk.） 2、 參 與 tRNA后 加 工 的 酶

51、（ 1） RNAaseP： 內(nèi) 切 核 酸 酶 ， 核 蛋 白 使 tRNA產(chǎn) 生 成 熟 的 5端 識 別 tRNA的 空 間 構(gòu) 象 （ 2） RNAaseD： 外 切 核 酸 酶 ， 使 型 tRNA暴 露 出 CCA端 a、 RNAaseP 存 在 時 RNAaseD可 達(dá) 最 大 活 性 b、 RNAaseQ、 RNAaseY、 RNAaseP 3與 此 酶 功 能 相 同 （ 3） tRNA核 苷 酸 轉(zhuǎn) 移 酶 （ tRNA nucleotidyl transferase） 以 ATP和 CTP為 前 體 ， 催 化 tRNA（ 型 ） 的 3端 生 成 CCA a、 E.col

52、i中 該 酶 基 因 突 變 后 ， 會 影 響 菌 株 生 長 （ CCA末 端 常 丟 失 ） b、 識 別 tRNA的 空 間 結(jié) 構(gòu) ， 無 種 屬 特 異 性（ 4） RNAase ： 與 RNAaseO、 RNAaseP 2的 功 能 相 似 ， 負(fù) 責(zé) 切 開 間 隔 序 列 3、 E.coli 的 tRNATyr1分 子 的 修 飾 過 程 編 碼 基 因 的 原 始 轉(zhuǎn) 錄 物三 磷 酸 有 兩 個 基 因 拷 貝 間 隔 子（ 各 長 350base） 有 一 個 tRNATyr1的 轉(zhuǎn) 錄 單 元 的 原 始 轉(zhuǎn) 錄 物 的 修 飾 過 程 三 、 RNA中 的 甲 基

53、化 及 常 見 的 修 飾 核 苷 酸 m5C m6A H NHH NH O O H NH H N CH 3H 3C Prok.中 主 要 是 堿 基 的 修 飾 Euk. 核 糖 、 堿 基 常 見 tRNA中 的 修 飾 核 苷 酸 Cmnm5U (5-羧 甲 基 氨 甲 基 尿 苷 )mCm5U （ 5-甲 氧 基 羰 甲 基 尿 苷 ）Xm5s2U （ 5-甲 基 -2硫 代 尿 苷 ）K 2C （ 2-賴 氨 酸 胞 苷 ）Com5U （ 5(2)-羥 羧 甲 基 尿 苷 ）I （ Inosine次 黃 嘌 呤 ）m7G (7-甲 基 尿 苷 )m 5C （ 5-甲 基 胞 苷 ）m

54、6A （ 6-甲 基 腺 苷 ）s2C （ 2-硫 代 胞 苷 ） (假 尿 苷 ）Um (2-O-甲 基 尿 苷 )Q （ Queuosine） Xo5U (5-羥 基 尿 苷 ) OH OH NH CH2 H2N R 第 七 節(jié) Euk轉(zhuǎn) 錄 產(chǎn) 物 的 后 加 工 Pre-RNA processing in Eukaryotes 一 、 rRNA的 轉(zhuǎn) 錄 后 加 工 主 體 rRNA基 因 （ 5.8S、 18S、 28SrDNA） 組 成 一 個 轉(zhuǎn) 錄 單 元47S前 體 45S前 體 a、 甲 基 化 位 點 可 能 是 酶 識 別 的 標(biāo) 志 b、 加 工 的 對 象 是 一

55、種 核 蛋 白 c、 哺 乳 動 物 的 45SRNA前 體 有 幾 種 不 同 的 加 工 方 式 二 者 的 共 同 之 處 : 先 切 除 18S rRNA之 前 5端 序 列 18S rRNA部 分 與 后 面 的 5.8S rRNA和 28S rRNA 部 分 分 開 5.8S rRNA和 28S rRNA通 過 堿 基 配 對 相 結(jié) 合 Euk.的 5S rRNA 二 、 mRNA的 轉(zhuǎn) 錄 后 修 飾 -帽 子 1、 帽 子 的 種 類 帽 子 0（ Cap-0） m7GpppXpYp-（ 共 有 ） m7G N7甲 基 鳥 苷 帽 子 1 （ Cap-1） m7GpppXmp

56、Yp- 第 一 個 核 苷 酸 的 2-O 位 上 產(chǎn) 生 甲 基 化 （ A N 6 位 甲 基 化 ） 帽 子 2（ Cap-2） m7GpppXmpYmp 第 二 個 核 苷 酸 的 2-O 位 上 產(chǎn) 生 甲 基 化 （ A、 G、 C、 U） HNCH3m7G帽 子 0 其 中 : 單 細(xì) 胞 真 核 生 物 只 有 Cap0 Cap1 是 其 余 真 核 生 物 的 主 要 帽 子 形 式 Cap2 存 在 于 某 些 真 核 生 物 中2、 帽 子 結(jié) 構(gòu) 的 生 成 甲 基 供 體 都 為 S腺 苷 甲 硫 氨 酸 （ SAM） RNA鳥 苷 酸 轉(zhuǎn) 移 酶 -戴 帽 酶 （

57、capping enzyme） 3、 帽 子 結(jié) 構(gòu) 的 功 能 （ 1） 對 翻 譯 起 識 別 作 用 -為 核 糖 體 識 別 RNA提 供 信 號 Cap0 的 全 部 都 是 識 別 的 重 要 信 號 Cap1,2 的 甲 基 化 能 增 進(jìn) 識 別 （ 2） 增 加 mRNA 的 穩(wěn) 定 性 ， 使 5端 免 遭 外 切 核 酸 酶 的 攻 擊 （ 3） 與 某 些 RNA病 毒 的 正 鏈 合 成 有 關(guān) （ Cap1、 Cap2 ） 除 帽 子 結(jié) 構(gòu) 外 的 Euk.mRNA內(nèi) 部 甲 基 化 m 6A形 式 三 、 mRNA的 轉(zhuǎn) 錄 后 修 飾 二 - 多 聚 （ A）

58、 尾 巴 1、 3端 -約 長 200bp (大 多 數(shù) Euk.的 mRNA) （ poly(A)+ poly(A)- ） 最 近 研 究 發(fā) 現(xiàn) ， 原 核 生 物 的 RNA轉(zhuǎn) 錄 后 也 有 3添 加 poly(A) 的 現(xiàn) 象 E.coli 的 poly(A)+聚 合 酶 早 在 1962年 就 已 發(fā) 現(xiàn) 2、 poly(A) 的 生 成 a、 RNA末 端 腺 苷 酸 轉(zhuǎn) 移 酶 （ poly(A) 聚 合 酶 ） 催 化 前 體 ATP 反 應(yīng) 如 下 ： 多 聚 核 糖 核 酸 + nATP Mg+ 或 Mn+ 多 聚 核 糖 核 酸 (A)n + nPPi b、 添 加 位

59、 點 內(nèi) 切 酶 (360KDa)切 除 一 段 序 列 由 poly(A) 聚 合 酶 催 化 添 加 poly(A)內(nèi) 切 酶 的 識 別 位 點 （ 有 其 它 因 子 參 與 ） 切 點 上 游 13 20bp處 的 AAUAAA 切 點 下 游 的 GUGUGUG （ 單 細(xì) 胞 Euk.除 外 ） 上 節(jié) 課 內(nèi) 容 回 顧 :1、 Prok.轉(zhuǎn) 錄 產(chǎn) 物 的 后 加 工 rRNA tRNA2、 Euk.轉(zhuǎn) 錄 產(chǎn) 物 的 后 加 工尾 巴 的 生 成主 體 rRNA帽 子 結(jié) 構(gòu) 3、 poly(A) 的 功 能 c、 對 含 poly(A) 的 mRNA 失 去 poly(A

60、) 可 減 弱 其 翻 譯 （ 1） 可 能 與 核 質(zhì) 轉(zhuǎn) 運 有 關(guān) ） （ 2） 與 mRNA的 壽 命 有 關(guān) （ 3） 與 翻 譯 有 關(guān) a、 缺 失 可 抑 制 體 外 翻 譯 的 起 始 b、 胚 胎 發(fā) 育 中 ， poly(A) 對 其 mRNA的 翻 譯 有 影 響 （ 非 poly(A) 化 的 為 儲 藏 形 式 ） （ 4） poly(A) 在 分 子 生 物 學(xué) 實 驗 中 有 很 大 應(yīng) 用 價 值 a、 也 可 將 oligo (dT) 與 載 體 相 連 ， 從 總 體 RNA中 分 離 純 化 mRNAb、 用 寡 聚 dT（ oligo (dT)） 為

61、引 物 ， 反 轉(zhuǎn) 錄 合 成 cDNA 第 八 節(jié) Euk.轉(zhuǎn) 錄 產(chǎn) 物 中 內(nèi) 元 的 去 除Intron removing in Eukaryote 一 、 概 述 1、 概 念 割 裂 基 因 （ split gene） ： 指 編 碼 某 一 RNA的 基 因 中 有 些 序 列 并 不 出 現(xiàn) 在 成 熟 的 RNA序 列 中 ， 成 熟 RNA 的 序 列 在 基 因 中 被 其 他 的 序 列 隔 開 內(nèi) 元 （ intron） ： 原 初 轉(zhuǎn) 錄 物 中 通 過 RNA拼 接 反 應(yīng) 而 被 去 除 的 RNA序 列 或 基 因 中 與 這 些 RNA序 列 相 應(yīng) 的 D

62、NA序 列 外 元 （ excon） ： RNA拼 接 （ RNA splicing） ： 一 個 基 因 的 外 元 和 內(nèi) 元 共 同 轉(zhuǎn) 錄 在 一 條 轉(zhuǎn) 錄 產(chǎn) 物 中 ， 將 內(nèi) 元 去 除 而 把 外 元 連 接 起 來 形 成 成 熟 RNA分 子 的 過 程 拼 接 點 ： 5 拼 接 點 或 左 拼 接 點 （ 內(nèi) 元 上 游 ） 3 拼 接 點 或 右 拼 接 點 （ 下 游 ） 2、 內(nèi) 元 的 分 類 1982 Davies等 人 中 部 核 心 結(jié) 構(gòu) （ central core structure） :在 有 些 內(nèi) 元 中 ， 含 有 4個 重 復(fù) 的 保 守

63、 序 列 ， 長 度 為 10 20bp， 4個 保 守 序 列 構(gòu) 成 一 種 二 級 結(jié) 構(gòu) ， 在 拼 接 中 起 重 要 作 用 由 于 并 非 所 有 的 內(nèi) 元 都 有 中 部 核 心 結(jié) 構(gòu) ， 所 以 有 了 內(nèi) 元 的 分 類 類 內(nèi) 元 （ group ） :含 有 中 部 核 心 結(jié) 構(gòu) 的 細(xì) 胞 器 基 因 核 基 因 類 內(nèi) 元 （ group ） :不 含 有 中 部 核 心 結(jié) 構(gòu) 細(xì) 胞 器 線 粒 體 基 因 內(nèi) 核 基 因 類 內(nèi) 元 （ group ） :具 有 GU AG 特 征 的 邊 界 序 列 核 基 因 mRNA前 體 tRNA基 因 的 內(nèi)

64、元 均 位 于 tRNA 的 反 密 碼 環(huán) 上 四 種 內(nèi) 元 的 邊 界 序 列 各 有 一 定 共 同 的 特 征 3、 拼 接 方 式 方 式 一 ： 由 拼 接 裝 置 完 成 （ 核 mRNA內(nèi) 元 ） 可 供 識 別 的 特 異 序 列 拼 接 裝 置 由 多 種 蛋 白 質(zhì) 和 核 蛋 白 組 成 方 式 二 ： 自 我 拼 接 （ 兩 類 內(nèi) 元 、 ） 形 成 特 定 的 二 級 結(jié) 構(gòu) RNA具 有 催 化 拼 接 的 能 力 方 式 三 ： 需 要 蛋 白 質(zhì) 酶 參 與 的 拼 接 （ 酵 母 tRNA） 前 兩 種 拼 接 都 屬 于 轉(zhuǎn) 酯 反 應(yīng) 二 、 tRN

65、A的 拼 接 （ 酵 母 為 例 ） 1、 鏈 的 斷 裂 和 連 接 是 兩 個 獨 立 的 過 程 2、 tRNA的 內(nèi) 元 均 位 于 反 密 碼 環(huán) 的 3端 ， 與 反 密 碼 子 相 距 一 個 Nt（ 40 400） 長 1416bp， 其 中 含 一 段 與 反 密 碼 環(huán) 互 補(bǔ) 的 序 列 反 密 碼 環(huán) 處 形 成 一 個 與 成 熟 tRNA不 同 的 構(gòu) 象 3、 拼 接 酶 系 識 別 的 是 二 級 結(jié) 構(gòu) 酵 母 tRNAphe 4、 拼 接 過 程 研 究 方 法 構(gòu) 建 溫 度 敏 感 突 變 體 （ 高 溫 時 .）分 離 累 積 tRNA前 體體 外 加

66、 入 野 生 型 細(xì) 胞 抽 提 液研 究 拼 接 過 程 第 一 步 ： 內(nèi) 切 酶 作 用 釋 放 一 條 線 狀 內(nèi) 元 分 子和 兩 個 “ tRNA半 分 子 ”兩 個 tRNA半 分 子 采 取 成 熟tRNA分 子 的 構(gòu) 象 (切 刻 ) 第 二 步 ： RNA連 接 酶 連 接 斷 端 其 中 內(nèi) 切 酶 作 用 后 產(chǎn) 生 5OH 和 3磷 酸 ， 3磷 酸 端 很 快 轉(zhuǎn) 變 為 2， 3環(huán) 式 核 苷 酸 因 此 ， 一 個 半 分 子 有 兩 個 磷 酸 末 端 ， 一 個 半 分 子 有 兩 個 OH末 端 連 接 反 應(yīng) 前 要 進(jìn) 行 兩 個 反 應(yīng) ： a、 左 外 元 的 3端 成 為 OH （ 環(huán) 式 磷 酸 二 酯 酶 ） 其 3 位 為 OH， 2 位 為 磷 酸b、 第 二 個 外 元 的 5端 轉(zhuǎn) 變 為 磷 酸 基 （ 多 聚 核 苷 酸 激 酶 ）因 此 連 接 后 還 要 切 除 第 一 個 外 元 的 2磷 酸 這 是 tRNA內(nèi) 元 拼 接 重 要 特 點 之 一 前 體RNA 兩 個 半 分 子 進(jìn) 行 兩 個連 接 反 應(yīng) 成