RHD1227A等位基因在Rh陰性人群和隨機人群中的頻率研究

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1、RHD 1227A等位基因在Rh陰性人群和隨機人群中的頻率研究 作者：吳俊杰　洪小珍　許先國 馬開榮 朱發(fā)明 嚴力行 【摘要】 　　本研究調(diào)查RHD 1227A等位基因在Rh陰性人群和隨機人群中的頻率。采用等位基因特異-聚合酶鏈反應(yīng)(allele specific - polymerase chain reaction, AS-PCR)檢測RHD 1227A等位基因， RHD基因拷貝數(shù)采用D雜合性試驗和RHD外顯子9的核苷酸序列分析方法進行確定。結(jié)果表明： 在143例Rh陰性獻血員中，共檢測到41例RHD 1227A等位基因攜帶者，其中8 例(19.51%)為 RhCCd

2、ee，32例 (78.05%) 為RhCcdee，1例 (2.44%) 為 RhCcdEe。在這41例RHD 1227A等位基因攜帶者中，35例有RHD基因的缺失，另外的6例是RHD 1227A等位基因的純合子。在489例隨機獻血員中檢測到7例RHD 1227A等位基因先證者，都是RHD 1227G/A雜合子，且是正常Rh陽性血型。結(jié)論： RHD 1227A等位基因在Rh陰性人群中的頻率為16.43％，在隨機人群中的頻率為0.72％。 【關(guān)鍵詞】 RHD基因； RHD 1227A等位基因； 基因頻率； Rh陰性人群 　　　RHD 1227A Allele Frequency am

3、ong Rh Negative Population and Random Population 　　　AbstractTo investigate the frequency of RHD 1227A allele in Rh negative population and random population, an AS - PCR (allele specific - polymerase chain reaction) method was emloyed to detect RHD 1227A allele. RHD gene copy was determined by D

4、zygosity test and RHD exon 9 nucleotide sequence analysis. The results showed that among 143 Rh negative donors, forty-one RHD 1227A allele carriers were detected, and 8 (19.51%) out of which were RhCCdee, 32 (78.05%) were RhCcdee, and 1 (2.44%) was RhCcdEe. Thirty-five Rh negative RHD 1227A carrier

5、s had RHD gene deletion, and the remaining carriers were RHD 1227A homozygous. Seven (1.43%) individuals were detected with RHD 1227A allele among 489 random donors. They were all G/A heterozygous at RHD 1227 site. Serological test indicated that they were normal Rh positive phenotype. It is conclud

6、ed that the frequency of RHD 1227A allele is 16.43％ among Rh negative population and 0.72% among the random population. 　　Key wordsRHD gene； RHD 1227A allele； gene frequency; Rh negative population 　　在過去的10多年里，RH血型的分子生物學(xué)研究有了很大的進展，對D抗原的免疫原性也有了更進一步的認識［1-3］。因為DEL抗原（只有通過吸收釋放才能檢測到的弱表達D抗原）有可能快速誘發(fā)抗D免

7、疫事件［4-6］，如何通過準確的基因分型建立一個真正的RH陰性供者庫（目前的RH陰性血型包括DEL表型）和分子鑒定各種D突變體成為輸血醫(yī)學(xué)的一個新熱點［1，2］。充分了解RHD等位基因的多態(tài)性和人群中的頻率是RHD基因分型的必要條件［2］。Gassner等［7］和Doescher等［8］研究發(fā)現(xiàn)，RHD等位基因即使在相鄰地區(qū)也可能有很大的差異； Chen等［9］發(fā)現(xiàn)，從弱D表型推算得到的基因人群頻率和隨機人群調(diào)查得到的基因人群頻率也不盡一致。我們率先用等位基因特異-聚合酶鏈反應(yīng)（allele specific - polymerase chain reaction, AS-PCR)方法調(diào)查DE

8、L表型的主要等位基因RHD 1227A在Rh陰性人群和隨機人群中的頻率，并對結(jié)果的臨床意義作了討論。 　　材料和方法 　　對象 　　在2003年10月—2004年10月期間在浙江省血液中心獻血的無親緣關(guān)系Rh陰性獻血員143名作為Rh陰性人群，隨機選取在浙江省居住或者工作的無親緣關(guān)系獻血員489名作為隨機人群。 　　Rh表型血清學(xué)鑒定 　　RHD表型鑒定采用常規(guī)鹽水平板法，使用加拿大Dominion公司的IgM和IgG混合的抗D試劑（人單克隆IgM抗D,D175-2細胞株； 人單克隆IgG抗D， D415 1E4細胞株）。RhC、Rhc、RhE和Rhe鑒定采用鹽水

9、試管法，試劑為Dominion公司的相應(yīng)單克隆抗體。 　　AS-PCR 　　參照文獻［10］進行。用特異擴增RHD 1227A等位基因的引物： RHDEL－s（上游引物）: GACCAAGTTTTCTGGAAA（位置對應(yīng)于AJ299028的68-85）、 RHDEL－a（下游引物）: CGAGAGAATTTTGAGCAC （位置對應(yīng)于AB035185的849-832）。一對特異擴增人生長激素（HGH）基因429 bp的引物作為內(nèi)對照，HGH-s（上游引物）： GCCTTCCCAACCATTCCCTTA； HGH-a（下游引物）： TCACGGATTTCTGTTGTGTTT。反應(yīng)總體

10、積10 μl，含模板DNA 0.2 μl（約含DNA 20-50 ng），特異性引物終濃度250 nmol/L，內(nèi)對照引物終濃度50 nmol/L，MgCl2 終濃度1.5 mmol/L，dNTP終濃度 200 mmol/L，Taq酶0.2 U（TaKaRa公司產(chǎn)品）。PCR擴增條件： 95℃ 預(yù)變性5分鐘，然后94℃ 變性30秒、58℃ 退火30秒和72℃ 延伸50秒，循環(huán)30次，最后72℃延伸5分鐘。產(chǎn)物通過2％瓊脂糖電泳，用凝膠成像儀（Syngene公司產(chǎn)品）觀察結(jié)果。 　　RHD基因外顯子9序列分析 　　參照文獻［11］進行。用RHD基因外顯子9的特異引物， WD9 s（上

11、游引物）: GGTCCAGGAATGACAGGGCT(位置：對應(yīng)于AB035196的4682-4701)； WD9 a（下游引物）： CGCTGAGGACTGCAGATAGG (位置：對應(yīng)于AB035185的294-275)，擴增覆蓋外顯子9及側(cè)翼序列的532 bp片段。PCR產(chǎn)物用Qiagen公司的膠純化回收試劑盒純化，采用BigDye Sequencing kit（ABI公司產(chǎn)品）試劑盒進行測序反應(yīng)，用ABI PRISM 377測序儀進行PAGE電泳，Sequence Analysis進行數(shù)據(jù)分析。 　　RHD基因缺失檢測 　　根據(jù)Perco等［12］的方法，用特異性引物μ1-

12、s（上游引物）和rnb31（下游引物） PCR檢測Rhesus hybrid box（AJ252313, 4988-7710區(qū)域）。如果可以擴增得到2 778 bp的特異性片段，則表明存在Rhesus hybrid box，有RHD基因的缺失； 反之，則不存在Rhesus hybrid box，沒有RHD基因的缺失。 　　結(jié)果 　　Rh陰性隨機人群中RHD 1227A的人群頻率 　　對143例Rh陰性人群的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，RHD 1227A陽性的個體有41例，占Rh陰性人群的28.67％。其中RhCCdee表型8例（19.51％），RhCcdee表型32例（78.05%），RhCc

13、dEe表型1例（2.44％）（附表）。在RhCCdEe、Rhccdee、RhccdEe和RhCcdEE表型的Rh陰性隨機人群中未檢測到RHD 1227A等位基因。采用Perco等的Rhesus hybrid box檢測方法［12］，RHD 1227A陽性的41例Rh陰性人群中有35例可以擴增得到2 778 bp的特異性片段，表明存在Rhesus hybrid box，有RHD基因的缺失；有6例不能擴增到2 778 bp的片段，表明不存在RHD基因的缺失，RHD 外顯子9序列分析結(jié)果表明，6例都為RHD 1227A等位基因的純合子，即在我們檢測的Rh陰性隨機人群中，RHD 1227A等位基因的拷

14、貝數(shù)為47，基因頻率為16.43％。Table . Frequency of RHD 1227A allele among random Rh negative popoulation（略） 　　隨機人群中RHD 1227A的人群頻率 　　在489例隨機人群中，檢測到7例RHD 1227A陽性個體，占隨機人群的1.43％。血清學(xué)檢測表明，這7例個體都是Rh陽性。外顯子9的序列分析表明，這7例個體在1227位都是G和A的雜合子（附圖）。用Perco等的方法［12］，該7例RHD 1227A陽性個體均未擴增到2 778 bp的片段，結(jié)果也表明不存在RHD基因的缺失。因此，在我們檢測的4

15、89例隨機人群中RHD 1227A等位基因的拷貝數(shù)為7，基因頻率為0.72％?！　∮懻? 　　和歐洲不同，亞洲Rh陰性人群有很高比例的DEL表型。在Gassner等［7］和Wagner等［13］的研究中，發(fā)現(xiàn) DEL個體由RHD 885T（M295I）、RHD 1227A(K409K)、RHD IVS5-38del4、RHD 1252T(Tins)1253A (X418L)和RHDIVS3+1A等位基因引起。在亞洲人群中， DEL表型主要是外顯子9缺失和RHD 1227A［14-19］2種。我們前期的研究結(jié)果表明，浙江漢族DEL表型是由RHD 1227A等位基因引起［10］，并根據(jù)RHD

16、1227A等位基因的序列設(shè)計了DEL表型的AS-PCR基因分型方法［11］。采用該AS-PCR方法，我們在143例Rh陰性人群中檢測到41例（28.67％）攜帶RHD 1227A，其中RHCCdee占19.51％，RHCcdee占78.05%， Rh-CcdEe占2.44%。這些結(jié)果和Chen等［14］和Shao等［17］的研究結(jié)果基本一致。在489例隨機人群中我們發(fā)現(xiàn)7例RHD 1227A陽性個體。序列分析發(fā)現(xiàn)，這些先證者在RHD基因的1227位都是G和A的雜合子；血清學(xué)檢測表明，是Rh陽性血型。Rhesus hybrid box檢測表明，這7例個體都不存在RHD基因的缺失。結(jié)合Rhesus

17、 hybrid box檢測和RHD基因外顯子9的序列分析結(jié)果推斷的RHD 1227A等位基因的拷貝數(shù)和RHD 1227A等位基因攜帶者在人群中陽性的個體比例，我們推算出RHD 1227A等位基因在Rh陰性人群和隨機人群中的基因頻率分別為16.43％和0.72％，和Shao等［14］、Chen等［17］通過Del表型推算的RHD 1227A等位基因在深圳和臺灣隨機人群中的頻率基本一致。 Ishikawa等［20］發(fā)現(xiàn)，日本人群中90％的Rh陰性、C陽性和RHD基因陽性的獻血員攜帶RHD 1227A等位基因，而在歐洲人群中，RHD 1227A的基因頻率只有1/9 091［13］。由上述分析可見，R

18、HD 1227A等位基因主要在亞洲人群中有意義。另外，我們首次在Rh陽性血型個體中檢測到RHD 1227A。這一方面表明RHD 1227A表達的抗原很弱，相對于正常RHD等位基因，DEL抗原不被表現(xiàn)；另一方面，RHD 1227A隱性攜帶者的子代表現(xiàn)為DEL 表型的要比正常對照高1倍。如果在隨機人群中開展RhD血型的基因分型，RHD 1227A等位基因的檢測必須和RHD 1227G(正常RHD對照)相結(jié)合，即當RHD 1227A陽性、RHD 1227G陰性時，有比較大的可能是DEL，而當RHD 1227A和RHD 1227G都為陽性時很可能是RHD 1227A的隱性攜帶者、正常D表型?；蚍中头?/p>

19、法具體實施時還需考慮其它不表達等位基因的突變位點的檢測。 【參考文獻】 　　1 Flegel WA. Homing in on D antigen immunogenicity. Transfusion, 2005; 45: 466-468 　　2 Avent ND. High variability of the RH locus in different ethnic backgrounds. Transfusion, 2005; 45: 293-294 　　3 Garratty G. Do we need to be more concerned about wea

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