生物化學(xué)：Chapter 10 復(fù)制

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1、基因信息的傳遞第第 十十 章章 DNADNA 的生物合成的生物合成生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry第一節(jié)第一節(jié) DNADNA的生物合成（復(fù)制）的生物合成（復(fù)制）第二節(jié)第二節(jié) DNADNA損傷與修復(fù)損傷與修復(fù)內(nèi)容提要：內(nèi)容提要：基基 因因 (gene)： 為蛋白質(zhì)或為蛋白質(zhì)或RNARNA編碼的編碼的DNADNA功能片段功能片段，是是以堿基排列順序的方式儲存的遺傳信以堿基排列順序的方式儲存的遺傳信息息?；?因因 組組（genome)： 某一物種擁有的全部遺傳物質(zhì)，從某一物種擁有的全部遺傳物質(zhì)，從分子意義上說，是指分子意義上說，是指全部全部DNADNA序列序列。生物化學(xué)生物化學(xué) Bioc

2、hemistry 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 翻譯翻譯 復(fù)制復(fù)制 DNA RNA 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄 * 中心法則中心法則(the central dogma) 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 翻譯翻譯 復(fù)制復(fù)制 DNA RNA 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 翻譯翻譯 復(fù)制復(fù)制 DNA RNA 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 翻譯翻譯 復(fù)制復(fù)制 DNA RNA 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 翻譯翻譯 復(fù)制復(fù)制 DNA RNA 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 翻譯翻譯 復(fù)制復(fù)制 DNA RNA 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄 生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemis

3、tryDNA的生物合成(復(fù)制)DNA Biosynthesis (Replication) 第第 一一 節(jié)節(jié)生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry DNA的生物合成的生物合成復(fù)制復(fù)制(replication)：以以親代親代DNADNA為模板為模板，按照，按照堿基互補配對堿基互補配對規(guī)律規(guī)律合成子代合成子代DNADNA的過程的過程。復(fù)制復(fù)制逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制親代親代DNA子代子代DNA生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry一、半保留復(fù)制一、半保留復(fù)制 DNADNA生物合成時，生物合成時，親代親代DNADNA解開為兩股單解開為兩股單鏈，各自作為模板鏈，各自作為模板(template)(t

4、emplate)按堿基配對規(guī)按堿基配對規(guī)律律，合成與模板互補的新鏈。在子代，合成與模板互補的新鏈。在子代DNADNA分子分子的兩條鏈中，的兩條鏈中，一條來自親代，另一條是新合成一條來自親代，另一條是新合成的的，這種復(fù)制方式稱為，這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。半保留復(fù)制。（一）半保留復(fù)制的概念（一）半保留復(fù)制的概念A(yù) TG CC GT A親代DNATCGAA G C TA G C TTCGA子代DNA生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 DNA復(fù)制的三種可能方式復(fù)制的三種可能方式（二）（二）DNA半保留復(fù)制的實驗依據(jù)半保留復(fù)制的實驗依據(jù) 含含

5、N15-DNA的細菌的細菌培養(yǎng)于普培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液通培養(yǎng)液 第一代第一代繼續(xù)培養(yǎng)于繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液普通培養(yǎng)液 第二代第二代生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry按半保留復(fù)制方式，子代按半保留復(fù)制方式，子代DNADNA與親代與親代DNADNA的的堿基序列一致堿基序列一致，即子代保留了親代，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性保守性。（三）半保留復(fù)制的意義（三）半保留復(fù)制的意義遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但基礎(chǔ)，但不是絕對的不是絕對的。生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry二、復(fù)制的方向二、復(fù)制的方向雙

6、向復(fù)制雙向復(fù)制復(fù)制原點復(fù)制原點（origins of replication）：）：又又叫復(fù)制的起始點，是指叫復(fù)制的起始點，是指DNADNA復(fù)制開始的特定復(fù)制開始的特定的位點的位點。這個區(qū)域通常由。這個區(qū)域通常由富含富含A/TA/T堿基對堿基對的的特殊堿基序列組成，能特殊堿基序列組成，能結(jié)合各種蛋白結(jié)合各種蛋白，有，有助于解開螺旋，啟動復(fù)制。助于解開螺旋，啟動復(fù)制。生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry 復(fù)制時雙鏈打開，分開成兩股，各自復(fù)制時雙鏈打開，分開成兩股，各自作為模板，子鏈沿模板延長所形成的作為模板，子鏈沿模板延長所形成的Y Y字字形的結(jié)構(gòu)稱為形的結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制叉復(fù)制叉(replic

7、ation (replication fork) fork) 。35535353復(fù)復(fù)制制方方向向生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry原核生物：原核生物： 基因組是環(huán)狀基因組是環(huán)狀DNADNA 只有一只有一個復(fù)制起始點個復(fù)制起始點 復(fù)制時，復(fù)制時，DNADNA從復(fù)制原點向兩個方向解鏈，從復(fù)制原點向兩個方向解鏈，形成兩個延伸相反的復(fù)制叉，兩個叉均參與形成兩個延伸相反的復(fù)制叉，兩個叉均參與DNADNA的復(fù)制，并以幾乎相等的速率移動，稱為的復(fù)制，并以幾乎相等的速率移動，稱為雙向雙向復(fù)制（復(fù)制（bidirectional replicationbidirectional replication）。

8、生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry 在原核生物雙向在原核生物雙向復(fù)制中，復(fù)制中，DNADNA被描述被描述為為眼睛眼睛狀，稱為狀，稱為復(fù)復(fù)制。制。oriCoriC生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry真核生物：真核生物：染色體染色體DNADNA有有多個復(fù)制起始點多個復(fù)制起始點。兩個起始點之間的兩個起始點之間的DNADNA片段稱為片段稱為復(fù)制子復(fù)制子(replicon(replicon) )。復(fù)制子是獨立完成復(fù)制的功能單位。復(fù)制子是獨立完成復(fù)制的功能單位。真核生物多個復(fù)制起始點、復(fù)制子與復(fù)制叉真核生物多個復(fù)制起始點、復(fù)制子與復(fù)制叉生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry3 5 3 5

9、 3 5 3 5 解鏈方向解鏈方向前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈(leading strand)后隨鏈后隨鏈(lagging strand)復(fù)制的半不連續(xù)性復(fù)制的半不連續(xù)性3 5 生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry 順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進行的這順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進行的這股鏈稱為股鏈稱為前導(dǎo)鏈或領(lǐng)頭鏈前導(dǎo)鏈或領(lǐng)頭鏈(leading strand)。 另一股鏈因為復(fù)制的方向與解鏈方向相反，不能另一股鏈因為復(fù)制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為為后隨鏈或隨從鏈后隨鏈或隨從鏈(lagging strand

10、)。 前導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制而后隨鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制前導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制而后隨鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的的半不連續(xù)性半不連續(xù)性。生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry 岡崎片段：岡崎片段： 1968 1968年日本生化學(xué)者岡崎用電鏡及放射年日本生化學(xué)者岡崎用電鏡及放射自顯影技術(shù)，觀察到自顯影技術(shù)，觀察到DNADNA復(fù)制中出現(xiàn)一些復(fù)制中出現(xiàn)一些不連續(xù)的片段不連續(xù)的片段，將這些不連續(xù)的片段稱，將這些不連續(xù)的片段稱為為岡崎片段岡崎片段。岡崎片段再由。岡崎片段再由DNADNA連接酶連連接酶連成一條完整的新鏈。成一條完整的新鏈。 原核生物原核生物: : 1000-20001000-2000個核苷酸個核苷酸 真核

11、生物真核生物: : 100-200100-200個核苷酸個核苷酸生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry3 5 3 5 3 5 3 5 解鏈方向解鏈方向前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈(leading strand)后隨鏈后隨鏈(lagging strand)3 5 岡崎岡崎片段片段半不連續(xù)復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry半不連續(xù)復(fù)制動畫半不連續(xù)復(fù)制動畫生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry DNA復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)The chemistry reaction of DNA Replication 三、三、（一）（一）DNA復(fù)制的體系復(fù)制的體系 底物底物: : dNTP

12、(dATP、dGTP 、dCTP 、dTTP) 聚合酶聚合酶: 依賴依賴DNADNA的的DNADNA聚合酶聚合酶(DNA-pol(DNA-pol) ) 模板模板: 解開成單鏈的解開成單鏈的DNADNA母鏈母鏈 引物引物: : 提供提供3-OH3-OH末端的一段末端的一段RNARNA 其他酶和蛋白質(zhì)因子其他酶和蛋白質(zhì)因子: : 拓撲異構(gòu)酶、解螺旋酶、拓撲異構(gòu)酶、解螺旋酶、單鏈單鏈DNADNA結(jié)合蛋白、引物酶、連接酶結(jié)合蛋白、引物酶、連接酶生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry（二）復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)（二）復(fù)制的化學(xué)反應(yīng) (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi 生物化學(xué)生物化

13、學(xué) Biochemistry聚合反應(yīng)的特點聚合反應(yīng)的特點DNADNA新鏈生成需要以單鏈新鏈生成需要以單鏈DNADNA為為模板模板需要需要RNARNA引物引物提供提供3 3 -OH-OH，以，以dNTPdNTP為原料為原料新鏈的延長只可沿新鏈的延長只可沿5 5 3 3 方向進行方向進行 聚合反應(yīng)機理聚合反應(yīng)機理3 5 3 5 5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性 5 3 外切酶活性外切酶活性?能切除引物和突變的能切除引物和突變的DNAD

14、NA片段。片段。能辨認錯配的堿基對，并將其水解。能辨認錯配的堿基對，并將其水解。 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry四、參與復(fù)制的主要酶類四、參與復(fù)制的主要酶類全稱：全稱：依賴依賴DNADNA的的DNADNA聚合酶聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)簡稱：簡稱：DNA-pol活性：活性： 1. 1. 5 53 3 的聚合活性的聚合活性 2. 2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性（一）（一）DNA聚合酶聚合酶生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry 1959 1959 年獲諾貝爾生理學(xué)

15、或醫(yī)學(xué)獎年獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎 奧喬亞奧喬亞 科恩伯格科恩伯格 Severo Ochoa Arthur Kornberg生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry1. 原核生物的原核生物的DNA聚合酶聚合酶 DNA-pol DNA-pol DNA-pol 生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry（1） DNA-pol 多功能酶：多功能酶： 5 5聚合酶活性聚合酶活性，對復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙，對復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進行填補；進行填補； 5 5 外切酶活性外切酶活性，對復(fù)制中的錯誤進行校對，對復(fù)制中的錯誤進行校對，保證復(fù)制準(zhǔn)確性；保證復(fù)制準(zhǔn)確性； 5 5外切酶活性外切酶活性，去除，去除RN

16、ARNA引物和突變堿基。引物和突變堿基。生物化學(xué)生物化學(xué) BiochemistryDNA聚合酶聚合酶I的的5 外切酶活性：外切酶活性： 識別切除生長鏈識別切除生長鏈3 3 端的錯配核苷酸，每次切除端的錯配核苷酸，每次切除1 1個核苷酸，個核苷酸，該活性對雙鏈該活性對雙鏈DNADNA不起作用不起作用； 正常聚合條件下，活性很低正常聚合條件下，活性很低，一旦出現(xiàn)堿基錯，一旦出現(xiàn)堿基錯配，配，DNADNA聚合酶聚合酶I I的聚合活性被抑制，聚合反應(yīng)停的聚合活性被抑制，聚合反應(yīng)停止，止，5 5 外切酶活性切除錯配核苷酸，再繼續(xù)外切酶活性切除錯配核苷酸，再繼續(xù)聚合；聚合； 有效的保證有效的保證DNADN

17、A復(fù)制的高度忠實性復(fù)制的高度忠實性。323個氨基酸個氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 605個氨基酸個氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol 928 AaKlenowKlenow片段是實驗室合成片段是實驗室合成DNADNA，進行分子生物學(xué)，進行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。研究中常用的工具酶。 （2）DNA聚合酶聚合酶II (DNA-pol II) 具有具有5 5聚合酶活性聚合酶活性和和5 5 外切外切酶活性，沒有酶活性，沒有5 5外切酶活性外切酶活性。 只是在無

18、只是在無polpol及及polpol的情況下暫的情況下暫時起作用。時起作用。 對模板的特異性不高對模板的特異性不高, , 參與參與DNADNA損傷損傷 的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry （3）DNA聚合酶聚合酶III (DNA-pol III) 是復(fù)制延長中是復(fù)制延長中真正起催化作用的酶真正起催化作用的酶。 由由1010種亞基組成不對稱的聚合體。種亞基組成不對稱的聚合體。 ，/ksi/ksi/ /，/it/it/ /亞基組成亞基組成核心酶，核心酶，亞基具有亞基具有5533的聚合活性，的聚合活性，亞基具亞基具有有3535外切酶活性和堿基選擇功能，外切酶活性

19、和堿基選擇功能，亞基可能起組裝作用亞基可能起組裝作用。生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry 亞基亞基(DNA(DNA夾子夾子) )能夾穩(wěn)模板鏈，負責(zé)酶能夾穩(wěn)模板鏈，負責(zé)酶沿沿DNADNA模板滑動的作用。模板滑動的作用。 其余亞基統(tǒng)稱為其余亞基統(tǒng)稱為-復(fù)合物復(fù)合物, , 促進全酶的促進全酶的組裝及增強核心酶活性。組裝及增強核心酶活性。DNA-pol 53聚聚合活性合活性35外切外切組裝組裝核心酶核心酶DNA夾子夾子-復(fù)合復(fù)合物物大腸桿菌每個細胞中只有大腸桿菌每個細胞中只有10102020個個DNA polDNA pol-III-III酶分子，但催化脫氧核苷酶分子，但催化脫氧核苷酸摻入酸摻入

20、DNADNA鏈的速率分別是鏈的速率分別是DNADNA聚合酶聚合酶I I和和IIII的的1515倍和倍和3030倍，可達倍，可達150150個核苷個核苷酸酸/ /秒。并且它可連續(xù)催化多達秒。并且它可連續(xù)催化多達50005000個核苷酸的加入，因此是真正意義上個核苷酸的加入，因此是真正意義上的的DNADNA復(fù)制酶。復(fù)制酶。生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry催化催化DNA聚合聚合參與參與DNADNA損傷損傷的應(yīng)急狀態(tài)修的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)復(fù)校讀、修復(fù)合校讀、修復(fù)合成、成、切除引物切除引物填補空隙填補空隙功能功能2040400分子數(shù)分子數(shù)/細胞細胞+5 外切酶活性外切酶活性+ 5 外切酶活性外切酶活

21、性+5 聚合酶活性聚合酶活性pol IIIpol IIpol IE. Coli中的中的DNA聚合聚合酶酶生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry2. 真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶起始引發(fā)，催化起始引發(fā)，催化后隨鏈的不連續(xù)合成后隨鏈的不連續(xù)合成。復(fù)制的主要酶復(fù)制的主要酶，參與，參與前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈的合成。的合成。參與參與DNADNA的的修復(fù)修復(fù)。在復(fù)制過程中起在復(fù)制過程中起校讀、修復(fù)和填補缺校讀、修復(fù)和填補缺口口的作用。的作用。在在線粒體線粒體DNADNA復(fù)制中起催化作用。復(fù)制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol （二）（二）DNA

22、拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶(DNA topoisomerase) 1010 8 8 局部解鏈后局部解鏈后拓撲是指物體或圖像作彈性位移而又保持不變的性質(zhì)。拓撲是指物體或圖像作彈性位移而又保持不變的性質(zhì)。生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry解鏈過程中，解鏈過程中，DNADNA分子會過度擰緊、打結(jié)、纏繞、連環(huán)分子會過度擰緊、打結(jié)、纏繞、連環(huán)等現(xiàn)象，等現(xiàn)象，DNADNA拓撲異構(gòu)酶催化拓撲異構(gòu)酶催化DNADNA鏈的瞬時斷裂和閉合鏈的瞬時斷裂和閉合釋放長螺旋產(chǎn)生的扭轉(zhuǎn)張力，使復(fù)制順利進行。釋放長螺旋產(chǎn)生的扭轉(zhuǎn)張力，使復(fù)制順利進行。生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry 拓撲異構(gòu)酶作用特點拓撲異構(gòu)酶作用

23、特點兼有兼有內(nèi)切酶活性內(nèi)切酶活性和和連接酶活性連接酶活性克服解鏈過程中的打結(jié)、纏繞現(xiàn)象克服解鏈過程中的打結(jié)、纏繞現(xiàn)象 拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶 分分 類類拓撲異拓撲異構(gòu)酶構(gòu)酶切斷切斷DNADNA雙鏈中雙鏈中一股一股鏈，使鏈，使DNADNA解解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時候封閉鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時候封閉切口，切口，DNADNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)反應(yīng)不需不需ATPATP。拓撲異拓撲異構(gòu)酶構(gòu)酶切斷切斷DNADNA分子分子兩股兩股鏈，斷端通過切口鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用利用ATPATP供能，連接斷端，供能，連接斷端，DNADNA分子分子進入負超螺

24、旋狀態(tài)。（主要）進入負超螺旋狀態(tài)。（主要）作用機制作用機制 生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶的作用的作用拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶的作用的作用（三）解螺旋酶（三）解螺旋酶(helicase) 位于復(fù)制叉前，位于復(fù)制叉前，利用利用ATPATP供能供能，作用于氫鍵作用于氫鍵，使，使DNADNA雙鏈雙鏈解開成為兩條解開成為兩條單鏈單鏈，便于，便于DNA polDNA pol III III和和引物酶作用。引物酶作用。 每解開一對堿基，需消耗每解開一對堿基，需消耗2 2分子分子ATPATP。Dna BDna C解鏈方向解鏈方向（四）引物酶（四）引物酶(primase) 依賴依賴

25、DNADNA的的RNARNA聚合酶聚合酶。 可以催化游離可以催化游離NTPNTP聚合形成聚合形成小段小段RNARNA。 催化催化RNARNA引物的生成，對于引物的生成，對于DNADNA合成是必需的。合成是必需的。 在大腸桿菌，是在大腸桿菌，是dnadna G G基因的表達產(chǎn)物。基因的表達產(chǎn)物。引物（引物（primer）：）：是一小段是一小段單鏈單鏈DNADNA或或RNARNA，作為，作為DNADNA復(fù)制的起始點復(fù)制的起始點，在核，在核酸合成反應(yīng)時，作為每個多核苷酸鏈進行延伸的出發(fā)點而酸合成反應(yīng)時，作為每個多核苷酸鏈進行延伸的出發(fā)點而起作用的多核苷酸鏈，引物的起作用的多核苷酸鏈，引物的3-OH3

26、-OH，必須是游離的。，必須是游離的。 生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry（五）（五）DNA連接酶連接酶連接連接DNADNA鏈鏈3 3 -OH-OH末端和相鄰末端和相鄰DNADNA鏈鏈5 5 -P-P末端，使二者生成末端，使二者生成磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵，從而把兩，從而把兩段相鄰的段相鄰的DNADNA鏈連接成一條完整的鏈。鏈連接成一條完整的鏈。生物化學(xué)生物化學(xué) BiochemistryPOO-O-OHO5POO-O-O335DNA連接酶連接酶ATP（NAD+）AMP5353生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry 在復(fù)制中起接合在復(fù)制中起接合雙鏈中單鏈缺口雙鏈中單鏈缺口的作用。的作用。

27、 在在DNADNA修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用。作用。 是基因工程的重要工具酶之一。是基因工程的重要工具酶之一。DNA連接酶的功能連接酶的功能 （六）（六） 單鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白 (single stranded DNA binding protein, SSB) 在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護單鏈的完整性單鏈的完整性。生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry解旋解鏈酶類的作用解旋解鏈酶類的作用 解螺旋酶、引物酶和單鏈解螺旋酶、引物酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白理順理順DNA鏈鏈拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶 (gyr

28、A, B)穩(wěn)定已解開的單鏈穩(wěn)定已解開的單鏈單鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白SSB催化催化RNA引物生成引物生成引物酶引物酶DnaG(dnaG)運送和協(xié)同運送和協(xié)同DnaBDnaC(dnaC)解開解開DNA雙鏈雙鏈解螺旋酶解螺旋酶DnaB(dnaB )辨認起始點辨認起始點DnaA(dnaA)蛋白質(zhì)（基因）蛋白質(zhì)（基因）通用名通用名功能功能原核生物復(fù)制起始的相關(guān)蛋白質(zhì)原核生物復(fù)制起始的相關(guān)蛋白質(zhì)生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry（一）復(fù)制的起始（一）復(fù)制的起始需要解決三個問題：需要解決三個問題： 復(fù)制起始位點的識別；復(fù)制起始位點的識別； DNADNA解開成單鏈，提供模板；解開成單鏈，提供模板

29、； 合成引物，提供合成引物，提供3 3 -OH-OH末端；形成引發(fā)體。末端；形成引發(fā)體。五、原核生物的五、原核生物的DNA生物合成生物合成 DNADNA的復(fù)制可以分為的復(fù)制可以分為3 3個階段：個階段：起始、延伸起始、延伸和和終止終止。生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry1. 復(fù)制起始位點的識別復(fù)制起始位點的識別在細菌和病毒中，在細菌和病毒中，DNADNA復(fù)制的起始發(fā)生在特定的復(fù)制的起始發(fā)生在特定的DNADNA位點。在位點。在E.coli中，中，oriC是復(fù)制的唯一起始位點是復(fù)制的唯一起始位點。復(fù)制起點的序列特征復(fù)制起點的序列特征富含富含ATATDnaADnaA蛋白蛋白( (解旋酶解旋酶

30、) )結(jié)合位點結(jié)合位點生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry腺嘌呤被甲基化，與腺嘌呤被甲基化，與DNA復(fù)制的啟動相關(guān)復(fù)制的啟動相關(guān)13 bp13 bp13 bp9 bp9 bp9 bp9 bp GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 5 3 2. DNA的解鏈的解鏈E.coli復(fù)制起始點復(fù)制起始點 oriC 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 245 串聯(lián)重復(fù)序列串聯(lián)重復(fù)序列 反向重復(fù)序列反向重復(fù)序列5 3 DNA解鏈的過

31、程：解鏈的過程：DnaADnaA蛋白與蛋白與DNA DNA orioriC C的重復(fù)序的重復(fù)序列結(jié)合形成列結(jié)合形成DNA-PrDNA-Pr起始復(fù)合體起始復(fù)合體富含富含ATAT區(qū)域雙螺旋變性，區(qū)域雙螺旋變性，orioriC C局部解鏈形成開鏈復(fù)合物局部解鏈形成開鏈復(fù)合物DnaCDnaC蛋白將解旋酶蛋白將解旋酶(DnaB(DnaB蛋白蛋白) )運送到復(fù)制模板，與模板結(jié)合運送到復(fù)制模板，與模板結(jié)合解旋酶解旋酶(DnaB(DnaB) )作用于氫鍵，消作用于氫鍵，消耗耗ATPATP，解開雙螺旋變成單鏈，解開雙螺旋變成單鏈單鏈單鏈DNADNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白(SSB)(SSB)與單鏈與單鏈DNADNA結(jié)合

32、，避免重新配對和降解結(jié)合，避免重新配對和降解 Dna A Dna B、 Dna CDNA拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 3. 引物的合成引物的合成含有解螺旋酶含有解螺旋酶(DnaB(DnaB) )、DnaCDnaC蛋白、引物酶蛋白、引物酶(DnaG(DnaG) )和和DNADNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體引發(fā)體(primosome(primosome) )。 生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry3 5 3 5 引物是由引物酶引物是由引物酶(DnaG(DnaG蛋白蛋白) )催化合成的催化合成的短鏈短鏈RNARNA分分子子，其合成需要，其

33、合成需要ATPATP供能供能和和NTP(NTP(不是不是dNTPdNTP) )的參與的參與。 引物引物3 HO5引物引物酶酶DnaADNA拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶DnaB、 DnaCSSB生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry（二）復(fù)制的延長（二）復(fù)制的延長復(fù)制的延長指在復(fù)制的延長指在DNA-polDNA-pol催化下，催化下，dNTPdNTP以以dNMPdNMP的方式逐個加入引物或延長中的子的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，其鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成成。 生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCT

34、PdTTPdGTPdATPdCTPOH 3 3DNA-pol復(fù)復(fù)制制過過程程簡簡圖圖領(lǐng)頭鏈的合成領(lǐng)頭鏈的合成隨從鏈的合成隨從鏈的合成后隨鏈的合成是由引物酶沿著模板在有規(guī)則的后隨鏈的合成是由引物酶沿著模板在有規(guī)則的間隔的間隔的合成合成短的短的RNARNA引物引物，當(dāng)一段新的岡崎片段合成后，當(dāng)一段新的岡崎片段合成后，DNA-polDNA-pol I I利用利用5353外切活性外切活性將將RNARNA引物引物切除切除，又利用，又利用DNA-polDNA-pol I I的聚合酶活性的聚合酶活性合成一段合成一段DNADNA作為替換作為替換，留下的，留下的缺口缺口由由DNADNA連接酶連接連接酶連接。5

35、5 5 RNA酶酶OHP5 DNA-pol dNTP5 5 PATP AMP+PPi5 5 DNA連接酶連接酶 隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry 原核生物基因是環(huán)狀原核生物基因是環(huán)狀DNADNA，雙向復(fù)制的復(fù)制片，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點段在復(fù)制的終止點(ter(ter) )處匯合。處匯合。 E.colioriter8232 ori terSV40500（三）復(fù)制的終止（三）復(fù)制的終止生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry（四）（四） 復(fù)制保真性的酶學(xué)依據(jù)復(fù)制保真性的酶學(xué)依據(jù) DNA DNA復(fù)制的出錯率僅為復(fù)制的出錯率僅

36、為1010-9-9-10-10-10-10左右，左右，即大約每合成即大約每合成10109 9-10-101010個核苷酸才會出現(xiàn)個核苷酸才會出現(xiàn)一個誤差。一個誤差。 生物體內(nèi)有多種機制保證生物體內(nèi)有多種機制保證DNADNA復(fù)制的高復(fù)制的高度忠實性。度忠實性。 DNADNA復(fù)制時按照復(fù)制時按照堿基配對規(guī)律堿基配對規(guī)律進行，是遺傳信進行，是遺傳信息能準(zhǔn)確傳代的基本原理。息能準(zhǔn)確傳代的基本原理。 DNA-polDNA-pol具有具有3-53-5核酸外切酶活性和即時核酸外切酶活性和即時校對功能校對功能，可以檢測并消除偶然出現(xiàn)的錯誤。，可以檢測并消除偶然出現(xiàn)的錯誤。 RNARNA引物也是保證復(fù)制忠實性的

37、因素。引物也是保證復(fù)制忠實性的因素。 細胞內(nèi)具有完整的細胞內(nèi)具有完整的DNADNA修復(fù)機制修復(fù)機制，可以校正、，可以校正、修復(fù)新合成修復(fù)新合成DNADNA中的堿基錯誤及中的堿基錯誤及DNADNA損傷。損傷。DNA復(fù)制高保真性的酶學(xué)機制復(fù)制高保真性的酶學(xué)機制 DNA-pol的核酸外切酶活性和即時校讀的核酸外切酶活性和即時校讀（一）復(fù)制的特點（一）復(fù)制的特點六、真核生物的六、真核生物的DNA生物合成生物合成 真核生物真核生物DNADNA分子包裝在分子包裝在核小體核小體中，與組蛋白緊密結(jié)中，與組蛋白緊密結(jié)合。在合。在DNADNA復(fù)制過程中，也要復(fù)制過程中，也要合成組蛋白合成組蛋白，親代親代DNADN

38、A的的組蛋白仍保留和組蛋白仍保留和DNADNA復(fù)制子的結(jié)合復(fù)制子的結(jié)合，而，而新合成的組蛋新合成的組蛋白與子代鏈結(jié)合白與子代鏈結(jié)合。3 5 5 3 領(lǐng)頭鏈領(lǐng)頭鏈3 5 3 5 親代親代DNA隨從鏈隨從鏈引物引物組蛋白組蛋白 真核生物真核生物DNADNA分子比較大，每個染色體有分子比較大，每個染色體有多個多個起始點起始點，是，是多復(fù)制子復(fù)制多復(fù)制子復(fù)制。復(fù)制有時序性復(fù)制有時序性，即復(fù)制子以分組方式激活而不是同步啟動。即復(fù)制子以分組方式激活而不是同步啟動。 生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry 復(fù)制的起始需要復(fù)制的起始需要DNA-polDNA-pol（引物酶活性）（引物酶活性）和和DNA-p

39、olDNA-pol（解螺旋酶活性）參與。還需（解螺旋酶活性）參與。還需拓撲酶和復(fù)制因子拓撲酶和復(fù)制因子(replication factor, (replication factor, RF)RF)。 DNA-polDNA-pol主要負責(zé)主要負責(zé)前導(dǎo)鏈的合成前導(dǎo)鏈的合成；而；而后隨后隨鏈的合成則由鏈的合成則由DNA-polDNA-pol負責(zé)負責(zé)，不連續(xù)的合，不連續(xù)的合成岡崎片段后去除引物，由連接酶連接成成岡崎片段后去除引物，由連接酶連接成完整的完整的DNADNA。生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry 增殖細胞核抗原增殖細胞核抗原(proliferation (proliferation

40、cell nuclear antigen, PCNA)cell nuclear antigen, PCNA)在復(fù)在復(fù)制起始和延長中起關(guān)鍵作用。制起始和延長中起關(guān)鍵作用。PCNAPCNA可可以協(xié)同以協(xié)同DNA-polDNA-pol取代取代DNA-polDNA-pol，合，合成前導(dǎo)鏈。成前導(dǎo)鏈。 生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry DNADNA復(fù)制與核小體裝配同步進行。復(fù)制與核小體裝配同步進行。 染色體染色體DNADNA呈線狀，復(fù)制在末端停止。呈線狀，復(fù)制在末端停止。 復(fù)制終止包括：復(fù)制終止包括：1.1.岡崎片段、復(fù)制子之間的連接。岡崎片段、復(fù)制子之間的連接。2.2.端粒的合成。端粒的合成

41、。（二）（二）端粒和端粒酶端粒和端粒酶(09諾貝爾生理學(xué)獎諾貝爾生理學(xué)獎)生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry 真核生物端粒的形成真核生物端粒的形成 1.端粒（端粒（telomere）是指真核生物染色是指真核生物染色體線性體線性DNADNA分子末分子末端的結(jié)構(gòu)部分，通端的結(jié)構(gòu)部分，通常膨大成粒狀。常膨大成粒狀。功能功能 維持染色體的穩(wěn)定性維持染色體的穩(wěn)定性 維持維持DNADNA復(fù)制的完整性復(fù)制的完整性端粒結(jié)構(gòu)特點端粒結(jié)構(gòu)特點 由由末端末端DNADNA序列序列和和蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)構(gòu)成。構(gòu)成。 末端末端DNADNA序列是多次重復(fù)的富含序列是多次重復(fù)的富含G G、T T堿基的短序列。堿基的短序列。

42、TTTTGGGGTTTTGGGG 線性線性DNADNA在復(fù)制完成后，其末端由于引物在復(fù)制完成后，其末端由于引物RNARNA的的水解而可能出現(xiàn)縮短水解而可能出現(xiàn)縮短。故需要在。故需要在端粒酶端粒酶（telomerasetelomerase）的催化下，進行延長反應(yīng)。）的催化下，進行延長反應(yīng)。2.端粒酶端粒酶(telomerase)端粒酶是一種端粒酶是一種RNA-RNA-蛋白蛋白質(zhì)復(fù)合體質(zhì)復(fù)合體，它可以與端，它可以與端粒區(qū)重復(fù)序列互補，粒區(qū)重復(fù)序列互補，以以自身自身RNARNA為模板為模板，通過，通過逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄對末端對末端DNADNA鏈進鏈進行延長。行延長。端粒酶的分子結(jié)構(gòu)端粒酶的分子結(jié)構(gòu)生物化學(xué)

43、生物化學(xué) Biochemistry端粒酶端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTRRNA (human telomerase RNA, hTR) )端粒酶協(xié)同蛋白端粒酶協(xié)同蛋白 (human telomerase (human telomerase associated protein 1, hTP1)associated protein 1, hTP1)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶 (human telomerase (human telomerase reverse transcriptase, hTRTreverse transcriptase, hTRT) )

44、端粒酶的組成端粒酶的組成3. 端粒的復(fù)制機制端粒的復(fù)制機制 端粒端粒DNADNA的的33端和端粒酶所含的端和端粒酶所含的RNARNA分子的分子的33端形成端形成堿堿基配對基配對； 端粒酶端粒酶以自身以自身RNARNA為模板為模板，將，將dNTPdNTP加到端粒加到端粒DNADNA的的33端；端； 端粒酶發(fā)生轉(zhuǎn)位，端粒酶發(fā)生轉(zhuǎn)位，DNA-RNADNA-RNA雜交鏈之間發(fā)生相對滑動，雜交鏈之間發(fā)生相對滑動，新生成的端粒新生成的端粒DNADNA鏈鏈33端重新與端粒酶端重新與端粒酶RNARNA堿基配對，堿基配對，暴露出部分暴露出部分RNARNA模板序列；模板序列； 繼續(xù)逆轉(zhuǎn)錄，結(jié)合繼續(xù)逆轉(zhuǎn)錄，結(jié)合聚合

45、聚合轉(zhuǎn)位的過程周而復(fù)始，直至轉(zhuǎn)位的過程周而復(fù)始，直至端粒的端粒的DNADNA形成足夠長度的單鏈突出；形成足夠長度的單鏈突出； 端粒端粒33端的單鏈突出彎轉(zhuǎn)形成后隨鏈合成的起始端，端的單鏈突出彎轉(zhuǎn)形成后隨鏈合成的起始端，再由再由DNADNA聚合酶復(fù)制聚合酶復(fù)制DNA5DNA5末端空缺的末端空缺的DNADNA，最后由，最后由連接連接酶連接酶連接。生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry端粒的復(fù)制（動畫演示）端粒的復(fù)制（動畫演示）DNADNA聚合酶復(fù)制子鏈聚合酶復(fù)制子鏈進一步加工進一步加工生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry4.端粒端粒及端粒酶的意義及端粒酶的意義 成年人端粒比胚胎細胞端粒短

46、；成年人端粒比胚胎細胞端粒短； 老化與端粒酶活性下降有關(guān)；老化與端粒酶活性下降有關(guān)； 腫瘤的發(fā)生與端粒酶活性有關(guān)。腫瘤的發(fā)生與端粒酶活性有關(guān)。生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry 簡單地說，簡單地說，端粒變短，細胞就老化。相端粒變短，細胞就老化。相反，如果端粒酶活性很高，端粒的長度就能反，如果端粒酶活性很高，端粒的長度就能得到保持，細胞的老化就被延緩。得到保持，細胞的老化就被延緩?！叭旧w染色體攜有遺傳信息。攜有遺傳信息。端粒是細胞內(nèi)染色體末端的端粒是細胞內(nèi)染色體末端的保護帽保護帽，它能夠保護染色體，而端粒酶，它能夠保護染色體，而端粒酶在端粒受損時能夠恢復(fù)其長度。在端粒受損時能夠恢復(fù)其長

47、度?！?生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry七、逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式七、逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry（一）（一）逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄 (reverse transcription) 在在逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，以的催化下，以RNARNA為模板為模板合成合成DNADNA的過程，又稱反轉(zhuǎn)錄。的過程，又稱反轉(zhuǎn)錄。 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄酶酶逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶 生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry（二）逆轉(zhuǎn)錄病毒（二）逆轉(zhuǎn)錄病毒 逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄

48、病毒的基因組是基因組是RNARNA，復(fù)制方式是逆，復(fù)制方式是逆轉(zhuǎn)錄，故稱逆轉(zhuǎn)錄病毒，也叫做轉(zhuǎn)錄，故稱逆轉(zhuǎn)錄病毒，也叫做RNARNA病毒。病毒。 如：許多種腫瘤病毒都是如：許多種腫瘤病毒都是RNARNA病毒；病毒； 人類免疫缺陷病毒（人類免疫缺陷病毒（HIVHIV）, ,它可引起艾滋它可引起艾滋?。ú。ˋIDSAIDS）。）。生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry（三）（三）逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 (reverse transcriptase) 從從RNARNA病毒中發(fā)現(xiàn)，能催化以病毒中發(fā)現(xiàn)，能催化以RNARNA為模板合成為模板合成雙鏈雙鏈DNADNA的酶，全稱為依賴的酶，全稱為依賴RNARNA的

49、的DNADNA聚合酶。聚合酶。 有三種活性：有三種活性： RNARNA指導(dǎo)的指導(dǎo)的DNADNA聚合活性聚合活性 RNaseRNase H H活性活性 DNADNA指導(dǎo)的指導(dǎo)的DNADNA聚合活性聚合活性（四）逆轉(zhuǎn)錄病毒細胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄過程（四）逆轉(zhuǎn)錄病毒細胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄過程RNA 模板模板逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA 雜化雙鏈雜化雙鏈RNA酶酶單鏈單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈雙鏈DNA分子生物學(xué)研究可應(yīng)用分子生物學(xué)研究可應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶，作為獲取基因工逆轉(zhuǎn)錄酶，作為獲取基因工程目的基因的重要方法之一，程目的基因的重要方法之一，此法稱為此法稱為cDNAcDNA法。法。 以以mRNAmRNA為模板，經(jīng)

50、逆轉(zhuǎn)為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成的與錄合成的與mRNAmRNA堿基序列互堿基序列互補的補的DNADNA鏈鏈。 試管內(nèi)合成試管內(nèi)合成cDNAcDNA complementary DNA 逆轉(zhuǎn)錄酶活性逆轉(zhuǎn)錄酶活性 A AA A T T T T DNA聚合酶聚合酶AAAA堿水解堿水解 T T T T生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry 逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生物學(xué)逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生物學(xué)研究中的重大發(fā)現(xiàn)。研究中的重大發(fā)現(xiàn)。 逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，RNARNA同樣兼有遺傳信息傳遞與表達功能。同樣兼有遺傳信息傳遞與表達功能。 對逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究，拓

51、寬了對逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究，拓寬了2020世紀(jì)初世紀(jì)初已注意到的病毒致癌理論。已注意到的病毒致癌理論。 （五）逆轉(zhuǎn)錄研究的意義（五）逆轉(zhuǎn)錄研究的意義 生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry 滾環(huán)復(fù)制滾環(huán)復(fù)制(rolling circle replication)滾環(huán)復(fù)制和滾環(huán)復(fù)制和D環(huán)復(fù)制環(huán)復(fù)制 是某些低等生物的復(fù)制形式，如是某些低等生物的復(fù)制形式，如 X X174174和和M13M13噬菌體等。噬菌體等。滾環(huán)復(fù)制滾環(huán)復(fù)制生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry滾環(huán)復(fù)制動畫滾環(huán)復(fù)制動畫生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry D環(huán)復(fù)制環(huán)復(fù)制(D-loop replication) 是線粒體

52、是線粒體DNA (mitochondrial DNADNA (mitochondrial DNA，mtDNA) mtDNA) 的復(fù)制形式。的復(fù)制形式。由由DNADNA聚合酶聚合酶催化。催化。線粒體線粒體DNADNA的雙股鏈由于浮力密度不同分為輕的雙股鏈由于浮力密度不同分為輕鏈（鏈（L L鏈）和重鏈（鏈）和重鏈（H H鏈）。鏈）。兩條鏈的兩條鏈的復(fù)制起點的位置不同復(fù)制起點的位置不同。生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry D環(huán)復(fù)制環(huán)復(fù)制H鏈鏈L鏈鏈生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry是一種在是一種在體外體外利用酶促反應(yīng)利用酶促反應(yīng)大量獲大量獲得特異序列得特異序列的基因組的基因組DNAD

53、NA的專門技術(shù)，又的專門技術(shù)，又稱為無細胞的分子克隆。稱為無細胞的分子克隆。聚合酶鏈反應(yīng)（聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry模板模板DNA引物引物4種種dNTPTaq DNA聚合酶聚合酶含含Mg2+的緩沖液。的緩沖液。PCR的反應(yīng)體系的反應(yīng)體系生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry（1）變性變性，加熱至，加熱至95 ，使模板使模板DNA解開成單鏈；解開成單鏈；（2）退火退火，溫度降至適宜，使引物與模板互補結(jié)合；，溫度降至適宜，使引物與模板互補結(jié)合；（3）延伸延伸，溫度升至，溫度升至72 ，DNA聚合酶以聚合酶以4種種dNTP為底物，在引物的為底物，在引物的3-

54、OH上，合成與模板互上，合成與模板互補的補的DNA新鏈。新鏈。PCR的基本反應(yīng)步驟及原理的基本反應(yīng)步驟及原理生物化學(xué)生物化學(xué) BiochemistryPCR反應(yīng)條件反應(yīng)條件變性變性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5CPCRPCR技技術(shù)術(shù)原原理理示示意意圖圖靶序列靶序列變性和引變性和引物復(fù)性物復(fù)性循環(huán)循環(huán)1循環(huán)循環(huán)2循環(huán)循環(huán)3變性和引變性和引物復(fù)性物復(fù)性鏈延伸鏈延伸Taq酶酶鏈延伸鏈延伸生物化學(xué)生物化學(xué) BiochemistryDNA損傷（突變）與修復(fù)損傷（突變）與修復(fù)DNA Damage (Mutation) and Repair第二節(jié)第二節(jié)一、一、 DNA損傷損傷 (DNA damage)

55、： 泛指一切泛指一切DNADNA結(jié)構(gòu)和功能的變化結(jié)構(gòu)和功能的變化。包括各。包括各種突變類型、堿基的損傷和種突變類型、堿基的損傷和DNADNA鏈的斷裂。鏈的斷裂。（一）突變（一）突變 (mutation)的定義的定義： 是由遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而引起的遺傳信息是由遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而引起的遺傳信息的改變。從分子水平來看，突變就是的改變。從分子水平來看，突變就是DNADNA分子分子上堿基的改變上堿基的改變。生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry（二）突變的意義（二）突變的意義1. 1. 突變是進化、分化的分子基礎(chǔ)突變是進化、分化的分子基礎(chǔ)2. 2. 突變導(dǎo)致基因型改變突變導(dǎo)致基因型改變3. 3. 突

56、變導(dǎo)致死亡突變導(dǎo)致死亡4. 4. 突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry（三）引發(fā)突變的因素（三）引發(fā)突變的因素 自發(fā)性自發(fā)性: 自然錯配率約為自然錯配率約為1010-9-91010-10-10 左右。左右。 物理因素物理因素: 如如UV (ultra violet)UV (ultra violet)、各種輻射。、各種輻射。 化學(xué)因素化學(xué)因素: 烷化劑、堿基類似物、以及其他烷化劑、堿基類似物、以及其他一些人工合成或環(huán)境中存在的化學(xué)物質(zhì)，這一些人工合成或環(huán)境中存在的化學(xué)物質(zhì)，這些誘發(fā)突變的化學(xué)物質(zhì)些誘發(fā)突變的化學(xué)物質(zhì), ,稱為致癌劑。稱為致癌劑

57、。 生物因素生物因素: 抗菌素類、黃曲霉素和病毒等?？咕仡?、黃曲霉素和病毒等。生物化學(xué)生物化學(xué) BiochemistryNNOOCH3RPNNOOCH3RNNOOCH3RPNNORUVOCH3胸嘧啶二聚體( T T )1.1.自發(fā)自發(fā)因素因素（物理因素）（物理因素）2.誘變誘變因素（化學(xué)因素）因素（化學(xué)因素）常見的化學(xué)誘變劑常見的化學(xué)誘變劑化合物類別化合物類別作作 用用 點點分子改變分子改變堿基類似物堿基類似物如：如：5-BUA 5-BU G- A - T - G - C -羥胺類（羥胺類（NH2OH）T C- T - A - C - G -亞硝酸鹽（亞硝酸鹽（NO2）C U- G - C

58、- A - T -烷化劑烷化劑如：氮芥類，如：氮芥類， NitrominsG mGG mGDNA缺失缺失G生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry（四）突變分子改變的類型（四）突變分子改變的類型錯配錯配 (mismatch)(mismatch)缺失缺失 (deletion)(deletion)插入插入 (insertion)(insertion)重排重排 (rearrangement(rearrangement) )框移框移(frame-shift)(frame-shift) 1.DNA1.DNA分子上的分子上的堿基錯配堿基錯配稱稱點突變。點突變。 (point mutation)(poin

59、t mutation)發(fā)生在發(fā)生在同型堿基同型堿基之間，即嘌呤代替之間，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。 轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)換發(fā)生在發(fā)生在異型堿基異型堿基之間，即嘌呤變嘧之間，即嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤。啶或嘧啶變嘌呤。 顛換顛換錯配錯配鐮刀形紅細胞貧血病人鐮刀形紅細胞貧血病人Hb (HbS) 亞基亞基N-val his leu thr pro val glu C 肽鏈肽鏈CAC GTG基因基因正常成人正常成人Hb (HbA)亞基亞基N-val his leu thr pro glu glu C 肽鏈肽鏈CTC GAG基因基因生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry2

60、. 缺失、插入和框移缺失、插入和框移缺失：缺失：一個堿基或一段核苷酸鏈從一個堿基或一段核苷酸鏈從DNADNA大分子上大分子上消失。消失。插入：插入：原來沒有的一個堿基或一段核苷酸鏈插入原來沒有的一個堿基或一段核苷酸鏈插入到到DNADNA大分子中間。大分子中間。 框移突變框移突變是指是指三聯(lián)體密碼的閱讀方式改變?nèi)?lián)體密碼的閱讀方式改變，造，造成成蛋白質(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生改變蛋白質(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生改變。 缺失或插入都可能導(dǎo)致缺失或插入都可能導(dǎo)致框移突變框移突變。生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry谷谷 酪酪 蛋蛋 絲絲5 G C A G U A C A U G U C 丙丙 纈纈 組組 纈

61、纈正常正常5 G A G U A C A U G U C 缺失缺失C缺失引起框移突變?nèi)笔б鹂蛞仆蛔兩锘瘜W(xué)生物化學(xué) Biochemistry3.重排重排DNADNA分子內(nèi)較大片段的交換，稱為分子內(nèi)較大片段的交換，稱為重組或重排。重組或重排。 二、二、DNA損傷的修復(fù)損傷的修復(fù)修復(fù)修復(fù)(repairing) 是對已發(fā)生分子改變的補償措施，使其是對已發(fā)生分子改變的補償措施，使其回復(fù)為原有的天然狀態(tài)。回復(fù)為原有的天然狀態(tài)。 光修復(fù)光修復(fù)(light repairing)(light repairing) 切除修復(fù)切除修復(fù)(excision repairing)(excision repairing

62、) 重組修復(fù)重組修復(fù)(recombination repairing)(recombination repairing) SOS SOS修復(fù)修復(fù) 修復(fù)的主要類型修復(fù)的主要類型NNOOCH3RPNNOOCH3RNNOOCH3RPNNORUVOCH3胸嘧啶二聚體( T T )（一）光修復(fù)（一）光修復(fù) （二）切除修復(fù)（二）切除修復(fù)是細胞內(nèi)最重要和是細胞內(nèi)最重要和有效的修復(fù)機制，主要有效的修復(fù)機制，主要由由DNA-polDNA-pol和連接酶完和連接酶完成。成。UvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶聚合酶OHPDNA連接酶連接酶E.coli的切的切除修復(fù)機制除修復(fù)機制生物化學(xué)生物化學(xué) Bioche

63、mistry切除修復(fù)動畫切除修復(fù)動畫切除修復(fù)對多種切除修復(fù)對多種DNA損傷起修復(fù)作用：損傷起修復(fù)作用： 堿基脫落形成的無堿基位點堿基脫落形成的無堿基位點 嘧啶二聚體嘧啶二聚體 堿基烷基化堿基烷基化 單鏈斷裂單鏈斷裂 堿基錯配堿基錯配 龐大的化學(xué)附加物龐大的化學(xué)附加物 鏈間交聯(lián)鏈間交聯(lián)著色性干皮病著色性干皮病(xeroderma pigmentosis，XP) 是是切除修復(fù)缺陷性切除修復(fù)缺陷性的遺傳病。的遺傳病。 XPXP病人細胞對嘧啶二聚體和烷基化的病人細胞對嘧啶二聚體和烷基化的清除能力降低，不能修復(fù)紫外線照射引起清除能力降低，不能修復(fù)紫外線照射引起的的DNADNA損傷，因此易發(fā)生皮膚癌。損傷

64、，因此易發(fā)生皮膚癌。生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry（三）重組修復(fù)（三）重組修復(fù)生物化學(xué)生物化學(xué) Biochemistry重組修復(fù)動畫重組修復(fù)動畫（四）（四）SOS修復(fù)修復(fù) 當(dāng)當(dāng)DNADNA損傷廣泛難以繼續(xù)復(fù)制時，由此而誘發(fā)損傷廣泛難以繼續(xù)復(fù)制時，由此而誘發(fā)出一系列復(fù)雜的反應(yīng)。出一系列復(fù)雜的反應(yīng)。 在在E. coliE. coli，各種與修復(fù)有關(guān)的基因，組成一，各種與修復(fù)有關(guān)的基因，組成一個稱為個稱為調(diào)節(jié)子調(diào)節(jié)子(regulon(regulon) )的網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控系統(tǒng)。的網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控系統(tǒng)。 這種修復(fù)特異性低，對堿基的識別、選擇能這種修復(fù)特異性低，對堿基的識別、選擇能力差。通過力差。通過S

65、OSSOS修復(fù)，復(fù)制如能繼續(xù)，細胞是修復(fù)，復(fù)制如能繼續(xù)，細胞是可存活的。然而可存活的。然而DNADNA保留的錯誤較多，導(dǎo)致較保留的錯誤較多，導(dǎo)致較廣泛、長期的突變。廣泛、長期的突變。 復(fù)習(xí)題：復(fù)習(xí)題：1. 概念概念:（1）復(fù)制子復(fù)制子 （2）端粒端粒（3）端粒酶端粒酶 （4）DNA損傷損傷 （5）誘發(fā)突變誘發(fā)突變 （6）光修復(fù)光修復(fù) （7）切除修復(fù)切除修復(fù) （8）氨基酸代謝庫氨基酸代謝庫 2. 什么是什么是DNA的半保留復(fù)制和半不連續(xù)復(fù)制？的半保留復(fù)制和半不連續(xù)復(fù)制？3. 簡述簡述DNA復(fù)制時所需的主要酶類及其功能。復(fù)制時所需的主要酶類及其功能。4.真核生物染色體的端粒是怎樣復(fù)制的？真核生物染色體的端粒是怎樣復(fù)制的？ 5.簡述簡述RNA病毒的主要復(fù)制方式。病毒的主要復(fù)制方式。