分子生物學(xué)：第三章 DNA的復(fù)制

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1、第三章第三章 DNADNA復(fù)制復(fù)制DNA Replication DNADNA復(fù)制：復(fù)制：親代雙鏈親代雙鏈 DNA DNA 分子在分子在 DNA DNA 聚合酶作聚合酶作用下，分別以每條單鏈用下，分別以每條單鏈 DNADNA分子為模板，聚合與分子為模板，聚合與自身堿基互補配對的游離自身堿基互補配對的游離 dNTP, dNTP, 合成兩條與親代合成兩條與親代 DNA DNA 分子完全相同的子代分子完全相同的子代 DNADNA分子的過程分子的過程復(fù)制子（復(fù)制子（RepliconReplicon）：從復(fù)制起點到復(fù)制終點的：從復(fù)制起點到復(fù)制終點的DNADNA區(qū)段區(qū)段DNA replication at

2、 phase S of cell cycle DNA replication at phase S of cell cycle E.coli 37 0.5 h105 bp/min S MG2mammalian cell 22-25hrs500-5000 bp/min G1?復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)DNA Pol I, II and III5- DNA - OH 5- DNA - O - P -N - OH+ dNTPs (DNA) n -OH + dNTP (DNA)n+1 -OH + PPi 化學(xué)反應(yīng)式 復(fù)制機理的復(fù)雜性復(fù)制機理的復(fù)雜性 D.S. DNAS.S. DNA 能量的供求能量的

3、供求構(gòu)型的變化構(gòu)型的變化超螺旋超螺旋線狀，開環(huán)狀線狀，開環(huán)狀多種酶類的互作多種酶類的互作ReplisomeDNA復(fù)制起始控制機理知之甚少復(fù)制起始控制機理知之甚少復(fù)制的準確性復(fù)制的準確性 （修復(fù)，校正）（修復(fù)，校正）研究試材的特殊性研究試材的特殊性（溫度敏感型（溫度敏感型ts，突變抑制體系，突變抑制體系Su）DNA復(fù)制速度復(fù)制速度(E.coli 105 bp/min ，高速解旋，高速解旋 112 km/h ?)缺乏統(tǒng)一的模式缺乏統(tǒng)一的模式(D.S. DNA, S.S. DNA, Linear DNA.) 第三章 DNA復(fù)制第一節(jié)第一節(jié) DNADNA復(fù)制的基本特征復(fù)制的基本特征一 、DNA的半保留

4、復(fù)制二、DNA復(fù)制的方向5-3四、DNA復(fù)制的起點和方向三、DNA的半不連續(xù)復(fù)制五、DNA復(fù)制的引物六、DNA復(fù)制的模式第二節(jié)第二節(jié) 原核生物原核生物DNADNA的復(fù)制的復(fù)制第三節(jié)第三節(jié) 真核生物真核生物DNADNA的復(fù)制的復(fù)制Walton 和Crick推測的DNA復(fù)制半保留復(fù)制（半保留復(fù)制（semi-conservation replication） DNA 復(fù)制過程中，親代 DNA 的雙鏈分子彼此分離作為模板，按照堿基互補配對的原則，合成兩條新生子鏈一、一、DNA的半保留復(fù)制的半保留復(fù)制保留復(fù)制保留復(fù)制分散復(fù)制分散復(fù)制半保留復(fù)制半保留復(fù)制 1958 Meselson and Stahl美國

5、科學(xué)家美國科學(xué)家馬修馬修. .梅塞爾梅塞爾(Matthew Meselson)(Matthew Meselson)于于19301930年出生在科羅拉多州的丹佛。年出生在科羅拉多州的丹佛。他畢業(yè)于加州工學(xué)院物理化他畢業(yè)于加州工學(xué)院物理化學(xué)專業(yè)。畢業(yè)后留校，學(xué)專業(yè)。畢業(yè)后留校，19761976年到哈佛大學(xué)工作年到哈佛大學(xué)工作福蘭克林福蘭克林. .斯塔爾斯塔爾(Franklin (Franklin Stahl)Stahl)于于19291929年出生于馬薩諸塞年出生于馬薩諸塞州的波士頓。曾求學(xué)于哈佛大學(xué)州的波士頓。曾求學(xué)于哈佛大學(xué)及羅切斯特大學(xué)。及羅切斯特大學(xué)。19551955年至年至19581958

6、年在加州工學(xué)院工作，其后在密年在加州工學(xué)院工作，其后在密蘇里大學(xué)工作一年。蘇里大學(xué)工作一年。19701970年受聘年受聘于俄羅岡大學(xué)教授于俄羅岡大學(xué)教授 核苷含氮核苷含氮DNA含氮含氮 氮最常見的形式是氮最常見的形式是N14，有，有7個質(zhì)子和個質(zhì)子和7 中子中子 N15 被稱為被稱為“重氮重氮”，有，有8個質(zhì)子個質(zhì)子半保留復(fù)制半保留復(fù)制二、二、DNA新鏈新鏈 的延伸方向從的延伸方向從 5 到到 3DNA聚合酶只能將游離的核聚合酶只能將游離的核苷酸加到新鏈的苷酸加到新鏈的 3- OH端端DNA雙鏈解螺旋后雙鏈解螺旋后 ,每一條每一條鏈上的堿基各自與游離于核鏈上的堿基各自與游離于核中的三磷酸脫氧核

7、糖核苷酸中的三磷酸脫氧核糖核苷酸按堿基配對原則配對。按堿基配對原則配對。在在DNA聚合酶的催化下聚合酶的催化下 , dNTP分解分解 2個磷酸基團個磷酸基團 ,放放出能量用于核苷酸順序連接出能量用于核苷酸順序連接而成為新鏈。而成為新鏈。 OHT C A5PPP+ppp OH CT C A C OH 35PPP+ ppi 如果如果 DNA 的延伸方向是的延伸方向是 3 5，5端有端有PPP, 具負電性，具負電性，單個單個dNTP也具負電性，而難于配對也具負電性，而難于配對游離 dNTP具有 ppp因能量需要，DNA的 5 端必須帶有PPP在0.2M NaCl 生理環(huán)境中，磷酸基團間的強電負性，使

8、 dNTP難以聚合到 DNA 的 5端，雙鏈 DNA 的5端堿基配對困難 OHT C A5PPP+PPP OH C OHT C A5PPPPPP OH C5 3時，端是羥基（），不是個分子均具負電性了。 證明DNA復(fù)制的方向始終是 53的末端終止實驗 2, 3 雙脫氧核苷酸可終止由 53的延伸 Sanger 鏈終止核酸測序法原理三、三、 復(fù)制的起點、方向和速度復(fù)制的起點、方向和速度復(fù)制子：復(fù)制子：從復(fù)制起點到復(fù)制終點的 DNA 區(qū)段稱為一個復(fù)制子復(fù)制體：復(fù)制體：在復(fù)制叉處組裝而成的多蛋白復(fù)合體復(fù)制叉復(fù)制叉：復(fù)制時，雙鏈復(fù)制時，雙鏈DNA解鏈，復(fù)制起點呈叉狀解鏈，復(fù)制起點呈叉狀35351. 復(fù)制

9、起始位點 復(fù)制起點區(qū)富含復(fù)制起點區(qū)富含 AT 和回文序列，這種特殊的結(jié)構(gòu)與復(fù)制和回文序列，這種特殊的結(jié)構(gòu)與復(fù)制起點易于解鏈以發(fā)動起點易于解鏈以發(fā)動 DNA 復(fù)制，促進聚合酶與復(fù)制，促進聚合酶與 DNA 結(jié)合結(jié)合的功能高度統(tǒng)一的功能高度統(tǒng)一 回文序列（回文對稱）回文序列（回文對稱） 雙鏈雙鏈 DNA DNA 從不同方向閱讀不同單鏈時其序列相同從不同方向閱讀不同單鏈時其序列相同 “呼吸現(xiàn)象呼吸現(xiàn)象” DNA 復(fù)制原點處氫鍵迅速斷裂與再生，導(dǎo)致兩條復(fù)制原點處氫鍵迅速斷裂與再生，導(dǎo)致兩條 DNA 鏈鏈不斷解鏈與聚合，形成瞬間的單泡狀結(jié)構(gòu)的過程，在富含不斷解鏈與聚合，形成瞬間的單泡狀結(jié)構(gòu)的過程，在富含

10、AT 的區(qū)域內(nèi)尤為明顯的區(qū)域內(nèi)尤為明顯原核生物的單復(fù)制子原核生物的單復(fù)制子：E. coli 復(fù)制起始復(fù)制起始區(qū)（區(qū)（OriC）的結(jié)構(gòu)）的結(jié)構(gòu)E. coli4.6 Mbp真核生物真核生物DNA的多個復(fù)制叉結(jié)構(gòu)及多復(fù)制子的多個復(fù)制叉結(jié)構(gòu)及多復(fù)制子物種 細胞內(nèi)復(fù)制子數(shù)目/個 平均長度/kb 速度（bp/min） 大腸桿菌 1 4 200 50 000酵母 500 40 3 600果蠅 3 500 40 2 600蟾蜍 15 000 200 500蠶豆 35 000 300 300 部分生物復(fù)制子的比較部分生物復(fù)制子的比較50mDNA復(fù)制叉ab放射性標記實驗證明DNA的復(fù)制是從固定的起點雙向等速進行2

11、. 2. 復(fù)制叉移動的方向和速率復(fù)制叉移動的方向和速率雙向等速為主雙向等速為主, 復(fù)制叉移動速度和方向多樣復(fù)制叉移動速度和方向多樣單向復(fù)制雙向復(fù)制相向復(fù)制某些環(huán)狀DNA某些線性DNA病毒最普遍的復(fù)制方式M2.4.2E. coli DNA 為雙向復(fù)制為雙向復(fù)制僅一端重度標記僅一端重度標記兩端重度標記兩端重度標記四、半不連續(xù)復(fù)制四、半不連續(xù)復(fù)制雙鏈DNA分子復(fù)制, 分別以兩條極性相反的單鏈分子為模板，按 5 到 3 的延伸方向合成新生單鏈 DNA 分子M2.4.3？反向平行的雙鏈幾乎是同時復(fù)制的？岡崎（岡崎（ Okazaki）片段的發(fā)現(xiàn)）片段的發(fā)現(xiàn)Okazaki 的脈沖標記和脈沖追蹤的實驗分析的脈

12、沖標記和脈沖追蹤的實驗分析 DNA復(fù)制先合成小片復(fù)制先合成小片段，再連接成大片段段，再連接成大片段五、五、 DNA 復(fù)制的引物復(fù)制的引物 DNA 聚合酶特性研究表明，DNA 不能自主啟動 DNA 復(fù)制，只能利用已有的核苷酸的 3-OH 末端聚合dNTP，合成 DNA 鏈 5 5 Primase: 合成RNA引物的酶RNA primers5 3 5 3 : 在新鏈合成前，必需有一段小的來引發(fā)DNA合成RNA primers required后隨鏈后隨鏈DNA復(fù)制的引發(fā)由引發(fā)體（復(fù)制的引發(fā)由引發(fā)體（6種蛋白）完成種蛋白）完成DNA 復(fù)制的引發(fā)過程復(fù)制的引發(fā)過程 在 DNA 的復(fù)制過程中，前導(dǎo)鏈的

13、RNA 引物由 RNA 聚合酶（引發(fā)酶）合成，如同基因轉(zhuǎn)錄一樣，在合成1012個核苷酸后，再由 DNA 聚合酶完成前導(dǎo)鏈合成 origin RNA聚合酶DNA聚合酶聚合酶前導(dǎo)鏈合成的前導(dǎo)鏈合成的 RNA引物引物dnaG引發(fā)酶合成后隨鏈的引物1. 新起始方式（新起始方式（de novo initiation） 或或 復(fù)制叉式（復(fù)制叉式（replication fork） starting pointstarting point ( Cairns model , form, theda form) ( Cairns model , form, theda form) RNA primer RNA

14、primer transcription activation transcription activation leading strand leading strand fork fork lagging strand lagging strand multiple replicon multiple replicon Eukaryote(500-5000bp/min) Eukaryote(500-5000bp/min) 六、六、DNADNA復(fù)制的模式復(fù)制的模式環(huán)狀環(huán)狀DNA雙鏈的復(fù)制雙鏈的復(fù)制型型1968年Gilbert提出（1）不需RNA引物，在正鏈3OH上延伸（2）只有一個復(fù)制叉（3

15、）形成多聯(lián)體（oncatemer）2. 2. 滾環(huán)復(fù)制模型滾環(huán)復(fù)制模型 滾環(huán)復(fù)制的電鏡照片3. 置換式置換式 （Displacement formDisplacement form） D.S. DNA In mitochondrial DNA In mitochondrial DNA also in chloroplasm DNA also in chloroplasm DNA S.S. DNA as template New S.S. DNA Displacement D-Loop第三章第三章 DNADNA復(fù)制復(fù)制 第一節(jié)第一節(jié) DNADNA復(fù)制的基本特征復(fù)制的基本特征第二節(jié)第二節(jié) 原核生物

16、原核生物DNADNA的復(fù)制的復(fù)制一、原核生物一、原核生物DNADNA復(fù)制的酶類復(fù)制的酶類二、復(fù)制的延伸二、復(fù)制的延伸三、復(fù)制的終止三、復(fù)制的終止四、原核生物四、原核生物DNADNA復(fù)制的調(diào)控復(fù)制的調(diào)控第三節(jié)第三節(jié) 真核生物真核生物DNADNA的復(fù)制的復(fù)制Substrates（底物）：（底物）：dATP，dGTP，dCTP， dTTP. (dNTPs)DNA polymerase （聚合酶聚合酶）:Template （模板模板）：）：single-stranded DNAPrimers（引物引物）：）：a newly synthesized RNA其它酶和因子其它酶和因子 一、原核生物一、原核生

17、物DNADNA復(fù)制的酶類復(fù)制的酶類Top I , Top II Helicase (rep protein) Single Strand Binding protein (SSB)Helix destabilizing protein (HDP) Primase（dnaG）Ung-aseDNA Polymerase III DNA Polymerase I Ligase DnaB priteinDnaC protein for primosome進化中形成了靈活的多酶復(fù)合體進化中形成了靈活的多酶復(fù)合體-replisome 1918 1918年年3 3月出生在美國紐月出生在美國紐約。約。1941

18、1941年年,23,23歲獲得羅徹歲獲得羅徹斯特大學(xué)醫(yī)學(xué)博士學(xué)位，斯特大學(xué)醫(yī)學(xué)博士學(xué)位，19601960年和年和19621962年獲得法學(xué)年獲得法學(xué)和科學(xué)博士學(xué)位。和科學(xué)博士學(xué)位。 19551955年從年從E.ColiE.Coli 中發(fā)中發(fā)現(xiàn)了現(xiàn)了DNA DNA 聚合酶，為聚合酶，為DNADNA的的復(fù)制打下了基礎(chǔ)。復(fù)制打下了基礎(chǔ)。19591959年年獲得諾貝爾獎獲得諾貝爾獎 Arthur Kornberg 科恩伯格1、DNA聚合酶聚合酶: DNA 聚合酶的活性聚合酶的活性 53 聚合作用 35 外切酶 53 外切酶 (Pol I)5 ucgagcuag-OH 3 5 ucgagcuagDNA

19、poldNTP5 3 聚合活性聚合活性3 agctcgatcgtagcctagcgtagcagtgcacgatc 5 3 agctcgatcgtagcctagcgtagcagtgcacgatc 5 catcggatcgcatcgtcacgtgctag 3 53Exonuclease activity 外切酶外切酶5 3 外切酶活性外切酶活性切除切除RNA引物或突變堿基引物或突變堿基5335 外切酶活性 proofreadingpol I: (polA 基因編碼基因編碼) u 不是不是主要的聚合酶主要的聚合酶 u 具有具有35外切酶活性，與聚合酶活性緊緊結(jié)合在一起，外切酶活性，與聚合酶活性緊緊結(jié)

20、合在一起，既可合成又可降解既可合成又可降解DNA，保證，保證DNA復(fù)制的復(fù)制的準確性準確性u N端區(qū)域有端區(qū)域有53外切酶活性，外切酶活性，切除紫外線照射形成的嘧切除紫外線照射形成的嘧啶二聚體；切除岡崎片段啶二聚體；切除岡崎片段5RNA引物引物pol II: (polB 基因編碼基因編碼) u 聚合酶活性很低 u 35外切酶活性，主要起修復(fù)DNA的作用大腸桿菌中的五種大腸桿菌中的五種DNA 聚合酶聚合酶pol III: (polC/dnaE 基因編碼基因編碼): u含7個不同的亞單位和9個亞基u生物活性形式是二聚體u具有聚合酶活性和35外切酶活性u大腸桿菌DNA復(fù)制的主導(dǎo)聚合酶（15 polI

21、和300 polII）pol IV: (dinB 基因編碼基因編碼) SOS修復(fù)pol V: (umuD2C 基因編碼基因編碼) SOS修復(fù)原核生物原核生物 DNA 聚合酶聚合酶 （DNA polymerase）（大腸桿菌）（大腸桿菌） 性質(zhì) 聚合酶 聚合酶 聚合酶III3 5外切 + + +5 3外切 + - -新鏈合成 - - +相對分子質(zhì)量 /103 103 90 900 細胞內(nèi)的分子數(shù) 400 ？ 1020生物學(xué)活性 1 0.05 153-5外切酶活性的應(yīng)用：高保真外切酶活性的應(yīng)用：高保真 DNA 聚合酶聚合酶2. DNA2. DNA雙螺旋的解旋和相應(yīng)的拓撲變化雙螺旋的解旋和相應(yīng)的拓撲

22、變化 Helicase（解鏈酶） Topoisomerase I、II 、 （拓撲異構(gòu)酶） Single stranded DNA binding protein, SSB（單鏈DNA結(jié)合蛋白）（1）. DNA解鏈酶（解鏈酶（DNA helicase） 通過水解通過水解ATP獲得能量獲得能量 大部分大部分DNA解鏈酶沿后解鏈酶沿后隨連模板的隨連模板的53并隨并隨著復(fù)制叉的前進移動著復(fù)制叉的前進移動 只有只有Rep蛋白是沿前導(dǎo)蛋白是沿前導(dǎo)鏈模板的鏈模板的3 5移動移動ATPhelicasehelicase（2）. DNA拓撲異構(gòu)酶（拓撲異構(gòu)酶（topoisomerase）天然狀態(tài)下的天然狀態(tài)下的

23、DNA分子呈負超螺旋狀態(tài)，可以形成部分的分子呈負超螺旋狀態(tài)，可以形成部分的單鏈結(jié)構(gòu)，利于蛋白質(zhì)與單鏈結(jié)構(gòu)，利于蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合結(jié)合復(fù)制過程中，復(fù)制過程中，DNA解旋，雙螺旋的盤繞數(shù)減少解旋，雙螺旋的盤繞數(shù)減少正超螺旋增加正超螺旋增加拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶能消除解鏈造成的正超螺旋的堆積能消除解鏈造成的正超螺旋的堆積復(fù)制得以延伸復(fù)制得以延伸（3）. 單鏈結(jié)合蛋白單鏈結(jié)合蛋白（ Single stranded DNA binding protein ） 在遠低于解鏈溫度時使雙鏈在遠低于解鏈溫度時使雙鏈DNA分開，并牢牢地結(jié)合在分開，并牢牢地結(jié)合在單鏈單鏈DNA上上 原核生物中的原核生物中的SSB蛋白

24、與蛋白與DNA結(jié)合時有協(xié)同效應(yīng)結(jié)合時有協(xié)同效應(yīng) 真核生物中無協(xié)同效應(yīng)真核生物中無協(xié)同效應(yīng) 只保持單鏈的存在，不能起解鏈作用只保持單鏈的存在，不能起解鏈作用 以四聚體形式存在于復(fù)制叉處，復(fù)制后掉下來重復(fù)使用以四聚體形式存在于復(fù)制叉處，復(fù)制后掉下來重復(fù)使用阻止堿基配對拓撲異構(gòu)酶解旋酶 SSB引發(fā)酶DNA聚合酶DNA 連接酶DNA-pol DNA-pol防止防止 DNA缺口扭轉(zhuǎn)缺口扭轉(zhuǎn)分開雙鏈分開雙鏈 防止單鏈復(fù)性防止單鏈復(fù)性合成合成RNA 引物引物合成合成DNA新鏈新鏈縫合缺口縫合缺口DNA復(fù)制的核心酶復(fù)制的核心酶校讀校讀, 降解引物降解引物, 填補缺口，修復(fù)填補缺口，修復(fù)DNA3. 復(fù)制叉復(fù)制叉

25、處的核心蛋白處的核心蛋白E. coli DNA復(fù)制過程中復(fù)制體的形成DNA復(fù)制起始一共涉及到DnaA（復(fù)制起始因子，識別OriC序列）、DnaB（DNA解鏈酶）、DnaC（召喚DnaB到復(fù)制叉）、HU（結(jié)合DNA使之彎曲）、引物合成酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白、RNA聚合酶、DNA旋轉(zhuǎn)酶、Dam甲基化酶，一共是9種重要的酶或蛋白質(zhì)，其中DnaA、DnaB、引物合成酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白、Dam甲基化酶非常重要。二、復(fù)制的延伸二、復(fù)制的延伸 RNA RNA引物合成后，引物合成后，DNA pol DNA pol ( ( and and ) )催化催化引物引物3 3 OHOH和和dNTPdNTP -P-P

26、之間的磷酸二酯鍵形成，之間的磷酸二酯鍵形成，新鏈在模板指導(dǎo)下延伸新鏈在模板指導(dǎo)下延伸5 ucgagcuagucgagcuag3 agctcgatcgtagcctagcgtagcagtgcacgatc agctcgatcgtagcctagcgtagcagtgcacgatc 5 catcggatcgcatcgtcacgtgctag catcggatcgcatcgtcacgtgctag 3 前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈后隨鏈后隨鏈3535555335335SSB阻止阻止 DNA復(fù)性DNA 聚聚合酶合酶岡崎岡崎片段片段RNA 引物引物引發(fā)酶合引發(fā)酶合成成RNA引物引物535TOPO - 釋放扭力解旋酶松解旋酶松弛弛

27、DNA3553RNA引物岡崎片段DNAPol.III3553RNA引物RNA片段RNaseHNick3553RNA引物3553RNA引物DNAPol.Iligase填補缺口縫合缺口當兩個復(fù)制叉在環(huán)狀當兩個復(fù)制叉在環(huán)狀DNA的另一端相遇時，復(fù)制終止的另一端相遇時，復(fù)制終止RNA引物降解，空隙右引物降解，空隙右DNA pol I填補填補, 缺口由連接酶縫合缺口由連接酶縫合RNase HDNA pol Iligaseendstart三、三、DNA 復(fù)制的終止復(fù)制的終止大腸桿菌 DNA 復(fù)制的終止Ter終止序列TUS 蛋白OriC終止位點重復(fù)性終止子序列重復(fù)性終止子序列（Ter）: 22 bpE. c

28、oli chromosome阻止復(fù)制叉的繼續(xù)前移1. 大腸桿菌染色體大腸桿菌染色體DNA的復(fù)制調(diào)控的復(fù)制調(diào)控復(fù)制子起始物位點復(fù)制起點復(fù)制調(diào)節(jié)蛋白編碼相互作用控制染色體DNA的復(fù)制dnaA、dnaC、dnaT四、四、DNA 復(fù)制的調(diào)控復(fù)制的調(diào)控2. ColE1 質(zhì)粒質(zhì)粒 DNA 復(fù)制調(diào)控復(fù)制調(diào)控 6466 bp, 2030 copies/cell 從一個特定的復(fù)制起點（從一個特定的復(fù)制起點（ori）開始，并沿著環(huán)）開始，并沿著環(huán)DNA分分子單向性地進行子單向性地進行 復(fù)制依賴于宿主的復(fù)制依賴于宿主的DNA聚合酶聚合酶I 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA編碼兩個負調(diào)控因子編碼兩個負調(diào)控因子Rop蛋白和反義蛋白和反義

29、RNA（RNA1） 負調(diào)控負調(diào)控DNA復(fù)制所必須的引物（復(fù)制所必須的引物（RNA2）合成）合成ColE1 質(zhì)粒質(zhì)粒 DNA 的復(fù)制調(diào)控的復(fù)制調(diào)控0-555RNA2RNaseH0-555RNA2DNA / RNA primer for DNA replicationRNA20-555-445RNA1RNA2前體的轉(zhuǎn)錄起始于復(fù)制起始位點上游555個核苷酸處經(jīng)RNaseH加工產(chǎn)生555個核苷酸的引物RNA2（正調(diào)控）由DNA聚合酶在引物末端起始DNA合成RNA1的編碼區(qū)在引物RNA編碼區(qū)的5端，轉(zhuǎn)錄方向相反RNA1可以通過同RNA2前體相互作用，阻止RNA2引物活化（復(fù)制的負調(diào)控）Rop蛋白提高RN

30、A1與RNA2前體的作用（復(fù)制的負調(diào)控） RNA-2 Positive control RNA-2 Positive control 0-555 0 RNA-2 RnaseH3OH RNA-2DNA / RNA primer for DNA replication RNA1110 bp overlappingRNase H 不能識別不能識別RNA-2, 不能形成不能形成primer 的3-OH -555 -4450RNA2RNA1RNA2 110 bp D.S. RNA 反義反義 RNA 模型（模型（RNA-1）-負調(diào)控負調(diào)控改變了改變了RNA2的二級結(jié)構(gòu)的二級結(jié)構(gòu)RNA-1 0 RNA-2轉(zhuǎn)

31、錄轉(zhuǎn)錄200-360Nt Rom gene expressionRom gene expressionRNA-1 / RNA-2 D.S. repressionRNA-1 / RNA-2 D.S. repression RNA-1 / RNA-2 不能形成不能形成primer的的 3-OH 促進促進 限限制制 63 aa ROP63 aa ROP(Rom protein)(Rom protein) RNA-2 只能轉(zhuǎn)錄到只能轉(zhuǎn)錄到100-220 bp, 不能到達不能到達“0”原點原點 不能形成不能形成primer 的的3-OH0 RoP基因的負控制調(diào)節(jié)基因的負控制調(diào)節(jié)第三章第三章 DNADNA

32、復(fù)制復(fù)制第一節(jié)第一節(jié) DNADNA復(fù)制的基本特征復(fù)制的基本特征第二節(jié)第二節(jié) 原核生物原核生物DNADNA的復(fù)制的復(fù)制第三節(jié)第三節(jié) 真核生物真核生物DNADNA的復(fù)制的復(fù)制一、真核生物一、真核生物 DNA DNA 復(fù)制特點復(fù)制特點: :二、真核生物二、真核生物 DNA DNA 聚合酶特性聚合酶特性三、三、真核生物真核生物DNADNA的的延伸延伸四四、真核生物避免真核生物避免55端縮短的端縮短的機制機制五五、真核細胞、真核細胞 DNA DNA 的復(fù)制的復(fù)制調(diào)控調(diào)控 一個復(fù)制單元中含有多個復(fù)制子，即多復(fù)制起點復(fù)制子較?。?0-1000 kb/per replicon （復(fù)制子）復(fù)制叉的移動速率約50

33、bp/s，大腸桿菌的1/20真核生物染色體在全部完成復(fù)制之前，各起點上的DNA不能重新啟動復(fù)制，而原核生物的復(fù)制起點上可以連續(xù)開始新 DNA 的復(fù)制復(fù)制起點成為自主復(fù)制序列（ARS）需要起始點識別復(fù)合物（ORC）的參與一、真核生物一、真核生物 DNA 復(fù)制特點復(fù)制特點:二、真核生物二、真核生物 DNA 聚合酶特性聚合酶特性性質(zhì) DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 DNA 聚合酶亞基數(shù) 4 1 2 23 1功能主要DNA復(fù)制酶DNA復(fù)制（?）DNA引物合成損傷修復(fù) 線粒體DNA復(fù)制3 5外切 無 無 有 有 有5 3外 切 無 無 無 無 無核內(nèi) 核內(nèi) 線粒體 核內(nèi)

34、核內(nèi)（?）在細胞內(nèi)的分布引發(fā)酶高忠實性修復(fù)酶DNA binding proteins Pol Pol primaseDNA Pol在復(fù)制叉上存在一個在復(fù)制叉上存在一個DNA聚合酶聚合酶 /引發(fā)酶復(fù)引發(fā)酶復(fù)合體和合體和DNA聚合酶聚合酶三、真核生物的三、真核生物的DNADNA延伸延伸前導(dǎo)鏈的合成前導(dǎo)鏈的合成Pol RNaseHDNA binding proteinsPol ligasePol 后隨鏈的合成后隨鏈的合成四、真核生物避免四、真核生物避免55端縮短的機制端縮短的機制 模板鏈可連續(xù)復(fù)制直到模板鏈的末端模板鏈可連續(xù)復(fù)制直到模板鏈的末端 真核生物通過形成端粒結(jié)構(gòu)和具有反轉(zhuǎn)錄活性的真核生物通過

35、形成端粒結(jié)構(gòu)和具有反轉(zhuǎn)錄活性的端粒酶來防止端粒酶來防止DNA復(fù)制時后隨鏈縮短而產(chǎn)生的染復(fù)制時后隨鏈縮短而產(chǎn)生的染色體部分短缺色體部分短缺 端粒酶能以自身攜帶的端粒酶能以自身攜帶的RNA鏈為模板，以反轉(zhuǎn)錄鏈為模板，以反轉(zhuǎn)錄的形式催化合成后隨鏈的形式催化合成后隨鏈5端端DNA片段或外加重片段或外加重復(fù)單位復(fù)單位c) 真核生物染色體真核生物染色體 DNA末端補齊模式末端補齊模式 端粒的發(fā)現(xiàn)端粒的發(fā)現(xiàn) 1938 Muller X-ray Drosophila 末端極少發(fā)生缺失和倒位末端極少發(fā)生缺失和倒位推測染色體兩端存在特殊結(jié)推測染色體兩端存在特殊結(jié)構(gòu)，使染色體趨于穩(wěn)定構(gòu)，使染色體趨于穩(wěn)定.并定名為并

36、定名為Telomere 1938 B.McClintock 頂端缺失染色體易于融合，而正常染色體不易連接。頂端缺失染色體易于融合，而正常染色體不易連接。 推測染色體末端具有特殊端粒結(jié)構(gòu)。推測染色體末端具有特殊端粒結(jié)構(gòu)。 1984 Elizabeth B 發(fā)現(xiàn)四膜蟲大核中發(fā)現(xiàn)四膜蟲大核中rDNA小分子末端端麗結(jié)構(gòu)為小分子末端端麗結(jié)構(gòu)為370-520bp的（的（GGGGTT）n的重復(fù)片段的重復(fù)片段Telomeres (端粒) on chromosomes真核生物染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，真核生物染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，由端粒酶合成由端粒酶合成(GGGGTT)nn=20-200 pBR322PvuBg1A

37、RSTELTELBam H1Bam H1四膜蟲四膜蟲rDNABg1PvuBam H1轉(zhuǎn)化酵母轉(zhuǎn)化酵母Pvu傳代傳代酵母酵母TEL？??？！ Shampay J. & Blackburn 加尾實加尾實驗驗 轉(zhuǎn)化酵母轉(zhuǎn)化酵母 傳代傳代酵母酵母TELPvu 酶切連接Pvu酵母酵母 DNAPvu酵母酵母TEL酵母酵母TEL？??？！ 端粒的模板鏈在何處端粒的模板鏈在何處?端粒酶的發(fā)現(xiàn)為揭示端粒序端粒酶的發(fā)現(xiàn)為揭示端粒序列復(fù)制的模板及避免列復(fù)制的模板及避免5端短端短縮的機制奠定了重要的基礎(chǔ)縮的機制奠定了重要的基礎(chǔ) 端粒的模板鏈在何處端粒的模板鏈在何處?加尾實驗未能證明延伸端加尾實驗未能證明延伸端粒序列的模板

38、從何而來？粒序列的模板從何而來？ 1985. Carol Greider & Blackburn, 1986. Gottchling Gottchling 尖毛蟲尖毛蟲 telomere binding proteintelomere binding protein 1 55kd telomere binding protein telomere binding protein 2 26 kd四膜蟲四膜蟲 telomerasetelomerase游撲蟲游撲蟲 telomerasetelomerase+ 100 bp telomere 200500KDaRNA CAAAACCCC 鏈鏈 + 具有

39、具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的 末端結(jié)合蛋白末端結(jié)合蛋白(TBP） 端粒端粒DNA (Telomere)(Telomere) TTGGGG(T2G4)序列高度重復(fù)的末端序列高度重復(fù)的末端 5 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG 3 (rich G chain) 3 AACCCC AACCCC AACCCC 5 (rich C chain) (端粒酶端粒酶)端粒酶Telomerase 由蛋白質(zhì)（反轉(zhuǎn)錄酶）和一段RNA組成。模板RNA是用來延伸DNA鏈 modelmodel TBP is Reverse transcriptase-like RNA complement with 3 end o

40、f DNA & as template for cDNA Elongated T2G4 3-end as primer for 5-end DNA synthesis G鏈鏈 T2G4-TTGGGGT TGGG C鏈鏈-A2C4- telomerase 3 aaaAACCCCAACuuac- 5 TTGG鏈鏈 T2G4-GGT TGGG C鏈鏈-A2C4-TTG telomerase 3 aaaAACCCCAACuuac- 5 GGGTTGG鏈鏈 T2G4-GGT TGGG C鏈鏈-A2C4-TTGGGGTTG- telomerase 3 CCAACCCCAACCCC- 5 telomeras

41、e 3 CCAACCCCAACCCC- 5 When G-rich strand is longer enough telomerase 3 aaaAACCCCAACuuac- 5 G G hoogsteen bond Tetraplex helix G鏈鏈 T2G4-TTGGGG TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG C鏈鏈-A2C4- G鏈鏈 T2G4-TTGGGG t t g g g g t t gC鏈鏈-A2C4- AACCCCAA g g g g t tgggPrimaseAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCDNA polor人體發(fā)育完成，端粒酶被抑

42、制，人體發(fā)育完成，端粒酶被抑制， 細胞分裂次數(shù)與端粒長短呈正比細胞分裂次數(shù)與端粒長短呈正比細胞分裂細胞分裂端粒閾值端粒閾值端粒長短端粒長短端粒酶活端粒酶活 Harley (1989)端粒的重復(fù)片段為探針檢測端粒的重復(fù)片段為探針檢測 胎兒細胞株胎兒細胞株嬰兒細胞株嬰兒細胞株青年細胞株青年細胞株老年細胞株老年細胞株年齡年齡小 大端粒長度端粒長度 長 短早衰性侏儒癥的端粒明顯較正常人短早衰性侏儒癥的端粒明顯較正常人短“多莉多莉”的衰老的衰老研究端粒研究端粒（記時器）（記時器）丟失的速率丟失的速率/ 年，預(yù)測人類的壽命年，預(yù)測人類的壽命 XX XY why?XX XY why?生殖細胞、癌細胞的繁殖生

43、殖細胞、癌細胞的繁殖 ( (端粒酶的激活！細胞得以永生！端粒酶的激活！細胞得以永生！) )五、真核細胞五、真核細胞 DNA DNA 的復(fù)制調(diào)控的復(fù)制調(diào)控細胞生活周期水平調(diào)控（限制點調(diào)控）染色體水平調(diào)控復(fù)制子水平調(diào)控 細胞細胞生活周期水平的生活周期水平的調(diào)控調(diào)控: 限制點調(diào)控限制點調(diào)控 決定細胞停留在決定細胞停留在G1期期還是進入還是進入S期期 誘發(fā)誘發(fā)轉(zhuǎn)變：轉(zhuǎn)變： 促進細胞分裂劑促進細胞分裂劑 致癌劑致癌劑 外科切除等外科切除等 細胞質(zhì)因子細胞質(zhì)因子 染色體水平的調(diào)控染色體水平的調(diào)控: 不同不同染色體或同一染色體不同部位的復(fù)制子按一染色體或同一染色體不同部位的復(fù)制子按一定順序在定順序在S期起始

44、期起始復(fù)制復(fù)制 復(fù)制子水平的調(diào)控：復(fù)制子水平的調(diào)控： 即復(fù)制起始與否，與原核生物類似即復(fù)制起始與否，與原核生物類似轉(zhuǎn)錄活化轉(zhuǎn)錄活化復(fù)制起始復(fù)合物的合成復(fù)制起始復(fù)合物的合成引物合成等引物合成等本章思考題本章思考題 染色體具備哪些作為遺傳物質(zhì)的特征染色體具備哪些作為遺傳物質(zhì)的特征 真核細胞核小體的特點真核細胞核小體的特點 組蛋白的修飾作用有哪些？組蛋白的修飾作用有哪些？ 簡述簡述DNADNA的一、二、三級結(jié)構(gòu)的一、二、三級結(jié)構(gòu) 原核生物和真核生物原核生物和真核生物DNADNA的特征的特征 DNADNA以何種方式進行復(fù)制？如何保證以何種方式進行復(fù)制？如何保證DNADNA復(fù)制的準確性復(fù)制的準確性 原核生物和真核生物原核生物和真核生物DNADNA復(fù)制的特點復(fù)制的特點 DNADNA復(fù)制為什么稱為半不連續(xù)復(fù)制？以大腸桿菌為例闡述后復(fù)制為什么稱為半不連續(xù)復(fù)制？以大腸桿菌為例闡述后隨鏈復(fù)制的各個步驟隨鏈復(fù)制的各個步驟