生物化學(xué)：Chapter 4 核酸

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1、 Chapter 4 核核 酸酸 Nucleic Acids重點(diǎn)內(nèi)容：重點(diǎn)內(nèi)容：核酸的組成核酸的組成DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)及測(cè)序方法的一級(jí)結(jié)構(gòu)及測(cè)序方法三種三種RNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)核酸的性質(zhì)核酸的性質(zhì)常見的核酸研究技術(shù)常見的核酸研究技術(shù)二十一世紀(jì)是二十一世紀(jì)是生命科學(xué)的世紀(jì)生命科學(xué)的世紀(jì)生命生命 = 核酸核酸 + 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)二十一世紀(jì)是核酸、蛋白質(zhì)的世紀(jì)二十一世紀(jì)是核酸、蛋白質(zhì)的世紀(jì)生命是生命是 ？概述概述由儲(chǔ)藏遺傳信息的核酸和調(diào)節(jié)代謝的由儲(chǔ)藏遺傳信息的核酸和調(diào)節(jié)代謝的酶蛋白組成的系統(tǒng)。酶蛋白組成的系統(tǒng)。Friedrich Miescher DNA發(fā)現(xiàn)者發(fā)現(xiàn)者第一節(jié)第一節(jié) 核酸的種類、分布與

2、功能核酸的種類、分布與功能一、核酸的種類與分布一、核酸的種類與分布（一）核酸的種類（一）核酸的種類（ RNARNA、DNADNA） DNADNA：脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic aciddeoxyribonucleic acid）RNARNA：核糖核酸核糖核酸（ribonucleic ribonucleic acidacid）: :tRNAtRNA (transfer (transfer RNA) RNA) 、mRNAmRNA (messenger (messenger RNA)RNA)、rRNArRNA（ribosomalribosomal RNA RNA）特殊功

3、能的特殊功能的RNA:RNA:小分子細(xì)胞核小分子細(xì)胞核RNARNA（snRNAsnRNA）、）、細(xì)胞質(zhì)小細(xì)胞質(zhì)小RNARNA（scRNAscRNA）、）、反義反義RNARNA（antisenseantisense RNA RNA）、）、雙雙鏈鏈RNARNA（dsRNAdsRNA）、）、具有催化活性的具有催化活性的RNARNA（ribozymeribozyme） 真核生物真核生物原核生物原核生物 DNA細(xì)胞核（95%）線粒體、葉綠體（5%）核質(zhì)區(qū)（擬核） RNA細(xì)胞質(zhì)（75%）線粒體、葉綠體（15%）細(xì)胞核（10%）細(xì)胞質(zhì)（二）核酸的分布（二）核酸的分布二、核酸的生物學(xué)功能二、核酸的生物學(xué)功能

4、（一）一）DNADNA是主要的遺傳物質(zhì)是主要的遺傳物質(zhì)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)：經(jīng)典實(shí)驗(yàn)：1944 ， O.T. Avery 肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1952 ， A. Hershey 和和M. Chase 噬菌體感染實(shí)驗(yàn)噬菌體感染實(shí)驗(yàn)19441944年，年，O.T.AveryO.T.Avery（美）肺炎鏈球菌的美）肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn), ,首次證明首次證明DNADNA是細(xì)菌的遺傳物質(zhì)。是細(xì)菌的遺傳物質(zhì)。Hershey-ChaseHershey-Chase（1952）噬菌噬菌體侵染細(xì)菌的體侵染細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)。（二）（二）RNARNA生物學(xué)功能生物學(xué)功能RNARNA的功能：的功能：1.1.

5、參與蛋白質(zhì)的合成參與蛋白質(zhì)的合成 rRNA(75-80%)rRNA(75-80%) tRNA(10-15%) tRNA(10-15%) mRNA(2-5%) mRNA(2-5%)2.2.遺傳物質(zhì)遺傳物質(zhì)3.3.具有生物催化劑功具有生物催化劑功能能4.4.參與基因表達(dá)的調(diào)參與基因表達(dá)的調(diào)控控一、核酸的元素組成一、核酸的元素組成 基本元素：基本元素：C H O N C H O N P P 核酸的元素組成有兩個(gè)特點(diǎn)：核酸的元素組成有兩個(gè)特點(diǎn)： 1. 1. 一般不含一般不含S S。 2. P 2. P含量較多，并且恒定（含量較多，并且恒定（9%-10%9%-10%）。）。 因此，實(shí)驗(yàn)室中用因此，實(shí)驗(yàn)室

6、中用定磷法定磷法進(jìn)行核酸的進(jìn)行核酸的定量分析。（定量分析。（DNA9.9% DNA9.9% 、RNA9.5%RNA9.5%）二二 核酸的分子組成核酸的分子組成核核 酸（酸（nucleic acid)核苷酸核苷酸(nucleotide) 磷酸磷酸 (phosphoric acid)核苷核苷(nucleoside) 戊糖戊糖(pentose)堿 基堿 基(base)1核苷酸核苷酸（1）Base:n核酸中除了核酸中除了5 5類基本的堿基外，還有一些含量甚少的類基本的堿基外，還有一些含量甚少的稀稀有堿基，有堿基，多數(shù)是甲基化的產(chǎn)物多數(shù)是甲基化的產(chǎn)物。如：。如：稀有堿基稀有堿基12435DNA Suga

7、r : deoxy-ribosen核苷由戊糖和堿基縮合而成，嘌呤的核苷由戊糖和堿基縮合而成，嘌呤的N9N9或嘧啶的或嘧啶的N1N1與戊糖與戊糖C-1-OHC-1-OH以以C-NC-N糖苷鍵相連接糖苷鍵相連接。 dAdANNNNNH2OH HOHOCH2H HHH9 9NONOOHOCH2H HHHOH O HU1假尿苷假尿苷 胸腺嘧啶核糖核苷胸腺嘧啶核糖核苷稀有核苷（稀有核苷（tRNA）n核苷酸是核苷的磷酸酯核苷酸是核苷的磷酸酯。如：。如：DNADNA為為5-5-磷酸磷酸- -脫氧核糖脫氧核糖核苷、核苷、RNARNA的為的為5-5-磷酸磷酸- -核糖核苷。核糖核苷。OBOHOHOH2CPOHH

8、OOB=腺嘌呤，鳥嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶或胸腺密啶核糖核苷酸 OH2CPOHHOOOBOH脫氧核糖核苷酸2 2 核苷酸衍生物核苷酸衍生物nATP是生物體內(nèi)分布最廣和最重要的一種核苷酸衍生物，能量是生物體內(nèi)分布最廣和最重要的一種核苷酸衍生物，能量載體。它的結(jié)構(gòu)如下：載體。它的結(jié)構(gòu)如下：O-POO-NNNNNH2OHHOHHOHHOCH2O-POO-O-POO-三磷酸腺苷 (ATP) (2) (2) GTP (GTP (鳥嘌呤核糖核苷三磷酸鳥嘌呤核糖核苷三磷酸) )（3 3）環(huán)核苷酸）環(huán)核苷酸cAMPcAMP 和和 cGMPcGMPn激素的第二信使，激素的第二信使，cAMPcAMP調(diào)節(jié)糖代謝、脂代謝

9、調(diào)節(jié)糖代謝、脂代謝。ncAMPcAMP 和和 cGMPcGMP 的環(huán)狀的環(huán)狀磷酯鍵是一個(gè)高能鍵。磷酯鍵是一個(gè)高能鍵。比比 ATP ATP 水解能高得多。水解能高得多。（4 4）輔酶的組成成分）輔酶的組成成分HSCoA、 NAD+、NADP+、FAD等輔助因子。（1 1）參與）參與DNADNA、RNARNA的合成、蛋白質(zhì)的合成。的合成、蛋白質(zhì)的合成。（2 2）在能量轉(zhuǎn)化中起重要作用，）在能量轉(zhuǎn)化中起重要作用，ATPATP是生物體內(nèi)是生物體內(nèi)能量的通用貨幣。能量的通用貨幣。（3 3）是構(gòu)成多種輔酶的成分：）是構(gòu)成多種輔酶的成分：NADNAD、NADPNADP、FADFAD、FMNFMN和和CoAC

10、oA。（4 4）參與細(xì)胞中的代謝與調(diào)節(jié)（參與細(xì)胞中的代謝與調(diào)節(jié)（cAMPcAMP、cGMPcGMP、UDP-UDP-葡萄糖）。葡萄糖）。3 3核苷酸的生物學(xué)作用核苷酸的生物學(xué)作用小結(jié)小結(jié)UDP-葡萄糖葡萄糖4 4多聚核苷酸多聚核苷酸(DNA/RNA)(DNA/RNA)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)n多聚核苷酸多聚核苷酸是通過核苷酸的是通過核苷酸的5-5-P P與另一分子核苷酸與另一分子核苷酸的的C C3 3-OH-OH形成形成磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵相連而成的鏈狀聚合物。相連而成的鏈狀聚合物。nDNADNA或或RNARNA鏈的特點(diǎn)：鏈的特點(diǎn)：一端為一端為C C5 5帶有一個(gè)自由磷酸帶有一個(gè)自由磷酸基，稱為基，稱

11、為5-5-磷酸端（常用磷酸端（常用5 -5 -P P表示）；另一端表示）；另一端C C3 3帶有自由的羥基，稱為帶有自由的羥基，稱為3-3-羥基端（常用羥基端（常用3 -3 -OHOH表示）。表示）。當(dāng)表示當(dāng)表示DNADNA或或RNARNA鏈鏈時(shí)，必須注明它的方向是時(shí)，必須注明它的方向是5353或是或是3535（具有方向性）具有方向性）。一、一、DNADNA的分子結(jié)構(gòu)的分子結(jié)構(gòu)（一）（一）DNADNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)的一級(jí)結(jié)構(gòu) 1. 1.定義：指定義：指DNADNA分子中脫氧核苷酸的排列順序。即數(shù)量分子中脫氧核苷酸的排列順序。即數(shù)量龐大的四種堿基的排列順序。龐大的四種堿基的排列順序。 2. 2.DN

12、ADNA的堿基組成（的堿基組成（ChargaffChargaff定則）：定則）： （1 1）在所有的）在所有的DNADNA中，中，A=TA=T，G=C G=C 即即A+G=T+CA+G=T+C （2 2）DNADNA的堿基組成具有種的特異性，即不同生物物的堿基組成具有種的特異性，即不同生物物種的種的DNADNA具有自己獨(dú)特的堿基組成，但沒有組織具有自己獨(dú)特的堿基組成，但沒有組織和器官的特異性。和器官的特異性。 3.DNA3.DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的表示法一級(jí)結(jié)構(gòu)的表示法: :5 3 結(jié)構(gòu)式結(jié)構(gòu)式5 3 p p p pOH3 ACTG1 線條式線條式5 ACTGCATAGCTCGA 3 5 pACTGC

13、ATAGCTCGAOH 3 字母式字母式nDNADNA測(cè)序的生物學(xué)意義測(cè)序的生物學(xué)意義 DNADNA是遺傳信息的儲(chǔ)存者和傳遞者，遺傳信息是是遺傳信息的儲(chǔ)存者和傳遞者，遺傳信息是由堿基序列體現(xiàn)的，堿基序列略有改變，即可引由堿基序列體現(xiàn)的，堿基序列略有改變，即可引起遺傳信息的顯著改變。所以起遺傳信息的顯著改變。所以DNADNA測(cè)序是研究測(cè)序是研究DNADNA 功能的基礎(chǔ)。功能的基礎(chǔ)。 nDNADNA測(cè)序的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)序的實(shí)驗(yàn)方法雙脫氧終止法（雙脫氧終止法（SangerSanger法）和法）和化學(xué)法化學(xué)法（GilbertGilbert法）法）4.4.DNADNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的研究方法：一級(jí)結(jié)構(gòu)的研究方法：

14、DNA的雙脫氧終止法測(cè)序的雙脫氧終止法測(cè)序策略策略 體外合成一段與待測(cè)體外合成一段與待測(cè)DNA序列互補(bǔ)的序列互補(bǔ)的隨機(jī)隨機(jī)DNA片段群。片段群。Deoxynucleotide; DideoxynucleotideDideoxynucleotidech04DNASequencing.mov（二）（二）DNADNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)1.1.定義：定義： DNADNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)指的二級(jí)結(jié)構(gòu)指DNADNA的兩條多聚核苷酸的兩條多聚核苷酸鏈間通過氫鍵形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。鏈間通過氫鍵形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。2 2DNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)雙螺旋結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)1）DNA由兩條反平行的多由兩條反平行的多核苷酸鏈組成，

15、兩條鏈繞同核苷酸鏈組成，兩條鏈繞同一中心軸相纏繞，形成右手一中心軸相纏繞，形成右手雙股螺旋，一條雙股螺旋，一條53，另，另一條一條35。螺旋上有大溝。螺旋上有大溝和小溝。和小溝。 DNAdouble helix B Formmajorgrooveminor groove2）嘌呤與嘧啶堿基位于雙螺旋）嘌呤與嘧啶堿基位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)。的內(nèi)側(cè)。磷酸與脫氧核糖在雙磷酸與脫氧核糖在雙螺旋外側(cè)。磷酸與脫氧核糖彼螺旋外側(cè)。磷酸與脫氧核糖彼此通過此通過3、5-磷酸二酯鍵相連磷酸二酯鍵相連接，構(gòu)成接，構(gòu)成DNA分子的骨架。堿分子的骨架。堿基平面與縱軸垂直，糖環(huán)平面基平面與縱軸垂直，糖環(huán)平面與縱軸平行。與縱軸平行

16、。3 3）兩條核苷酸鏈，依靠堿基）兩條核苷酸鏈，依靠堿基間形成的氫鍵結(jié)合在一起。間形成的氫鍵結(jié)合在一起。堿基具有嚴(yán)格的配對(duì)規(guī)律，堿基具有嚴(yán)格的配對(duì)規(guī)律，即即A A與與T T結(jié)合，結(jié)合，G G與與C C結(jié)合，結(jié)合，這種配對(duì)關(guān)系，稱為這種配對(duì)關(guān)系，稱為堿基堿基互補(bǔ)?；パa(bǔ)。A A和和T T之間形成兩個(gè)之間形成兩個(gè)氫鍵，氫鍵，G G與與C C之間形成三個(gè)之間形成三個(gè)氫鍵。氫鍵。 雙螺旋的兩條鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)關(guān)雙螺旋的兩條鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)關(guān)系。系。4 4）螺旋橫截面的直徑約為）螺旋橫截面的直徑約為2 2 nmnm，每條鏈相鄰兩個(gè)堿基平每條鏈相鄰兩個(gè)堿基平面之間的距離為面之間的距離為0.34 0.34 nmnm，每每10

17、10個(gè)核苷酸形成一個(gè)螺旋，個(gè)核苷酸形成一個(gè)螺旋，其螺距（即螺旋旋轉(zhuǎn)一圈）其螺距（即螺旋旋轉(zhuǎn)一圈）高度為高度為3.4 3.4 nmnm。3 3DNADNA雙螺旋的穩(wěn)定因素雙螺旋的穩(wěn)定因素n維持維持DNADNA穩(wěn)定性的主要因素包括：兩條穩(wěn)定性的主要因素包括：兩條DNADNA鏈之間堿基配對(duì)形成的鏈之間堿基配對(duì)形成的氫鍵和堿基堆氫鍵和堿基堆積力積力；n另外，磷酸基團(tuán)上的負(fù)電荷與介質(zhì)中的另外，磷酸基團(tuán)上的負(fù)電荷與介質(zhì)中的陽(yáng)離子間形成的離子鍵及范德華力對(duì)維陽(yáng)離子間形成的離子鍵及范德華力對(duì)維持雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性上也起一定的作持雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性上也起一定的作用用 。B-DNA：典型的典型的Watson-Cr

18、ickWatson-Crick雙螺旋雙螺旋DNADNA。右手雙股螺旋。右手雙股螺旋。在相對(duì)濕度為在相對(duì)濕度為92%92%時(shí)的時(shí)的DNADNA鈉鹽。接近鈉鹽。接近DNADNA在細(xì)胞中的構(gòu)象。在細(xì)胞中的構(gòu)象。A-DNA：在相對(duì)濕度為在相對(duì)濕度為75%75%以下時(shí)的以下時(shí)的DNADNA纖維。右手雙螺旋，纖維。右手雙螺旋，外形粗短，外形粗短，RNA-RNARNA-RNA、RNA-DNARNA-DNA雜交分子具有這種結(jié)構(gòu)。雜交分子具有這種結(jié)構(gòu)。Z-DNAZ-DNA：左手雙螺旋左手雙螺旋DNADNA。天然。天然B-DNAB-DNA的局部區(qū)域可以形成的局部區(qū)域可以形成Z-DNAZ-DNA。4DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的

19、多型性二級(jí)結(jié)構(gòu)的多型性P489表表136列出了列出了 A、B、Z型型DNA的主要特征數(shù)據(jù)。的主要特征數(shù)據(jù)。DNADNA三鏈結(jié)構(gòu)常出現(xiàn)在三鏈結(jié)構(gòu)常出現(xiàn)在DNADNA復(fù)制、重組、轉(zhuǎn)錄的起復(fù)制、重組、轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)或調(diào)節(jié)位點(diǎn)。始位點(diǎn)或調(diào)節(jié)位點(diǎn)。 第三股鏈的存在可能使一些調(diào)控蛋白或第三股鏈的存在可能使一些調(diào)控蛋白或RNARNA聚聚合酶等難以與該區(qū)段結(jié)合，從而阻遏有關(guān)遺傳信合酶等難以與該區(qū)段結(jié)合，從而阻遏有關(guān)遺傳信息的表達(dá)。息的表達(dá)。TATTAT、C C+ +GCGC兩種堿基配對(duì)方式（兩種堿基配對(duì)方式（HoogsteenHoogsteen配對(duì)）。配對(duì)）。 DNA三股螺旋（三股螺旋（ H-DNA）：）：H

20、-DNA的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)（三）（三）DNADNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)的三級(jí)結(jié)構(gòu)一、定義一、定義： DNADNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)指在的三級(jí)結(jié)構(gòu)指在DNADNA雙螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)的基雙螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上通過扭曲和折疊所形成的特定構(gòu)象。礎(chǔ)上通過扭曲和折疊所形成的特定構(gòu)象。超螺旋是超螺旋是DNADNA三級(jí)結(jié)構(gòu)的一種類型。超螺旋即三級(jí)結(jié)構(gòu)的一種類型。超螺旋即DNADNA雙螺旋的螺旋。雙螺旋的螺旋。DNADNA超螺旋的意義：超螺旋的意義： 使使DNA形成高度致密狀態(tài)從而得以裝入核中形成高度致密狀態(tài)從而得以裝入核中Human genome DNA length= 3x109x0.34x10-9=1.02mCell size: 1

21、0-6 to 10-5 m 推動(dòng)推動(dòng)DNA結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化以滿足功能上的需要。如負(fù)超螺旋分結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化以滿足功能上的需要。如負(fù)超螺旋分子所受張力會(huì)引起互補(bǔ)鏈分開導(dǎo)致局部變性，利于復(fù)制和子所受張力會(huì)引起互補(bǔ)鏈分開導(dǎo)致局部變性，利于復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄。1.1.鏈環(huán)數(shù)鏈環(huán)數(shù)（linking numberlinking number）雙螺旋雙螺旋DNADNA中，一條鏈以右手螺旋繞另一條鏈纏繞的次數(shù)，中，一條鏈以右手螺旋繞另一條鏈纏繞的次數(shù)，以以L L表示。表示。2.2.扭轉(zhuǎn)數(shù)扭轉(zhuǎn)數(shù)（纏繞數(shù)：（纏繞數(shù)：twisting numbertwisting number）DNADNA分子中的分子中的Watson-Cric

22、kWatson-Crick螺旋數(shù)，以螺旋數(shù)，以T T表示。表示。3.3.超螺旋數(shù)超螺旋數(shù)（writhing numberwrithing number）以以W W表示。表示。 所以：所以：L=T+WL=T+W DNADNA分子具有相同的結(jié)構(gòu)，但分子具有相同的結(jié)構(gòu)，但L L值值不同，所以稱它們?yōu)橥夭煌?，所以稱它們?yōu)橥負(fù)洚悩?gòu)體。拓?fù)洚悩?gòu)體之間可通過撲異構(gòu)體。拓?fù)洚悩?gòu)體之間可通過I/III/II類酶催化相互轉(zhuǎn)類酶催化相互轉(zhuǎn)變。變。二、二、DNA的拓?fù)鋵W(xué)特征的拓?fù)鋵W(xué)特征L=25,T=25,W=0松弛環(huán)形松弛環(huán)形1152010523L=23,T=23,W=0解鏈環(huán)形解鏈環(huán)形151015202315101

23、52025L=23,T=25,W=2負(fù)超螺旋負(fù)超螺旋121482316131510152023右手旋轉(zhuǎn)擰松兩匝后的線形右手旋轉(zhuǎn)擰松兩匝后的線形DNADNA超螺旋的形成超螺旋的形成超螺旋的拓超螺旋的拓?fù)鋵W(xué)公式：撲學(xué)公式：L=T+W超螺旋超螺旋RNARNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)nRNARNA的的U U替代替代DNADNA中的中的T T，組成組成RNARNA的核苷酸也的核苷酸也是以是以3 -5 3 -5 磷酸二酯鍵連接。磷酸二酯鍵連接。nRNARNA是單鏈分子，因此，在是單鏈分子，因此，在RNARNA分子中，并不分子中，并不遵守遵守A AG GT TC C的比例關(guān)系。的比例關(guān)系。nRNARNA分子中，

24、部分區(qū)域也能形成雙螺旋結(jié)構(gòu)分子中，部分區(qū)域也能形成雙螺旋結(jié)構(gòu)（類似（類似A-DNAA-DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)），不能形成雙螺雙螺旋結(jié)構(gòu)），不能形成雙螺旋的部分，則形成突環(huán)。這種結(jié)構(gòu)可以形象旋的部分，則形成突環(huán)。這種結(jié)構(gòu)可以形象地稱為地稱為“發(fā)夾發(fā)夾”結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)或或莖環(huán)結(jié)構(gòu)。莖環(huán)結(jié)構(gòu)。二、二、RNARNA的分子結(jié)構(gòu)的分子結(jié)構(gòu)RNA的的主要類型：主要類型： tRNA、mRNA和和rRNAn在在RNARNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，堿基的配對(duì)情況的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，堿基的配對(duì)情況不象不象DNADNA中嚴(yán)格。中嚴(yán)格。G G 除了可以和除了可以和C C 配對(duì)外，配對(duì)外，也可以和也可以和U U 配對(duì)。配對(duì)。G-U G-U 配對(duì)

25、形成的氫鍵配對(duì)形成的氫鍵較弱。不同類型的較弱。不同類型的RNA, RNA, 其二級(jí)結(jié)構(gòu)有明其二級(jí)結(jié)構(gòu)有明顯的差異。顯的差異。ntRNAtRNA中除了常見的堿基外，還存在一些中除了常見的堿基外，還存在一些稀有堿基，這類堿基大部分位于突環(huán)部稀有堿基，這類堿基大部分位于突環(huán)部分分. .1.1.tRNAtRNA的一級(jí)的一級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：n分子量分子量2525k kDaDa左右，大左右，大約由約由70709090個(gè)核苷酸組個(gè)核苷酸組成，沉降系數(shù)為成，沉降系數(shù)為4 4S S左右。左右。n分子中含有較多的修飾分子中含有較多的修飾成分。成分。n3 3 - -末端都具有末端都具有CpCpAOHCpCpAO

26、H的結(jié)構(gòu)。的結(jié)構(gòu)。 5 5 端多為端多為pGpG, ,也有也有pCpC。（一）（一）tRNA2 2、tRNAtRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)特點(diǎn)tRNAtRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)大都的二級(jí)結(jié)構(gòu)大都呈呈“ “ 三葉草三葉草” ” 形狀，形狀，一般一般具有具有四四臂四環(huán)臂四環(huán)：包括氨基：包括氨基酸接受臂、反密碼酸接受臂、反密碼（環(huán)）臂、二氫尿（環(huán)）臂、二氫尿嘧啶（環(huán)）臂、嘧啶（環(huán)）臂、T T C C（環(huán)）（環(huán)）臂臂和可和可變環(huán)。變環(huán)。氨基酸接受臂氨基酸接受臂包含有包含有tRNAtRNA的的3-3-末端和末端和5-5-末端，末端， 3- 3-末端的最后末端的最后3 3個(gè)核個(gè)核苷酸殘基都是苷酸殘基都是CCAC

27、CAOHOH，氨基酸可氨基酸可與其成酯，該區(qū)在蛋白質(zhì)合成與其成酯，該區(qū)在蛋白質(zhì)合成中起攜帶氨基酸的作用。中起攜帶氨基酸的作用。反密碼反密碼環(huán)環(huán)與氨基酸接受區(qū)相對(duì)，一般環(huán)與氨基酸接受區(qū)相對(duì)，一般環(huán)中含有中含有7 7個(gè)核苷酸殘基，其中環(huán)個(gè)核苷酸殘基，其中環(huán)中正中的中正中的3 3個(gè)核苷酸殘基稱為個(gè)核苷酸殘基稱為反反密碼子密碼子，與，與mRNAmRNA上的密碼子反上的密碼子反向配對(duì)向配對(duì)。tRNAtRNA的功能的功能: :在蛋白質(zhì)生物合在蛋白質(zhì)生物合成中轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸和識(shí)別密碼子成中轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸和識(shí)別密碼子的作用。的作用。3 3、tRNAtRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)的三級(jí)結(jié)構(gòu)n在三葉草型二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，突環(huán)上在三葉

28、草型二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，突環(huán)上未配對(duì)的堿基由于整個(gè)分子的扭曲而配未配對(duì)的堿基由于整個(gè)分子的扭曲而配成對(duì)，目前已知的成對(duì)，目前已知的tRNAtRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)均為的三級(jí)結(jié)構(gòu)均為倒倒L L形形。（二）（二）mRNAmRNAn約占總約占總RNARNA的的5%5%。n不同細(xì)胞的不同細(xì)胞的mRNAmRNA的鏈長(zhǎng)和分子量差異很大。的鏈長(zhǎng)和分子量差異很大。n它的功能是將它的功能是將DNADNA的遺傳信息傳遞到蛋白質(zhì)，指的遺傳信息傳遞到蛋白質(zhì)，指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。1 1、m mRNARNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)一級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)真核：真核：?jiǎn)雾樂醋?、單順反子?5 -5 -末端有末端有“帽子帽子” 、 3 -

29、3 -末端有末端有polyApolyA片段片段 和非編碼區(qū)和非編碼區(qū) 和非編碼區(qū)和非編碼區(qū)原核：原核：多順反子多順反子 5 -5 -末端無(wú)末端無(wú)“帽子帽子” 、 3 -3 -末端末端 無(wú)無(wú)polyApolyA片段片段 （病毒除外）（病毒除外） 有非編碼區(qū)有非編碼區(qū) 有非編碼區(qū)有非編碼區(qū)順反子：順反子： mRNAmRNA上具有翻譯功能的核苷酸順序。上具有翻譯功能的核苷酸順序。n極大多數(shù)真核細(xì)胞極大多數(shù)真核細(xì)胞mRNAmRNA在在3-3-末端有一段長(zhǎng)約末端有一段長(zhǎng)約2020250250核苷酸的核苷酸的polyApolyA。polyApolyA是在轉(zhuǎn)錄后經(jīng)是在轉(zhuǎn)錄后經(jīng)polyApolyA聚合酶的作用

30、而添加上去的。聚合酶的作用而添加上去的。npolyApolyA可能的功能：可能的功能：與與mRNAmRNA從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移有關(guān)；與移有關(guān)；與mRNAmRNA的半壽期有關(guān)，新合成的的半壽期有關(guān)，新合成的RNARNA其其polyApolyA鏈較長(zhǎng)，而衰老的鏈較長(zhǎng)，而衰老的mRNAmRNA，polyApolyA鏈縮短。鏈縮短。2）真核）真核mRNA 3 -polyA“尾巴尾巴”3 3）真核）真核mRNAmRNA5 - “5 - “帽子帽子”結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu) “帽子帽子”結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)：甲基化的鳥苷酸通過焦磷酸與：甲基化的鳥苷酸通過焦磷酸與真核真核mRNA55- -末端的末端的核苷酸以核苷

31、酸以55、 5 5- -磷酸二酯鍵相連。磷酸二酯鍵相連。三種帽子結(jié)構(gòu)：三種帽子結(jié)構(gòu)： O型：m7G5ppp5 Np I型：m7G5ppp5NmpNp II型：m7G5ppp5NmpNmpNpn可能功能：可能功能： 抵抗抵抗55核酸外切酶降解核酸外切酶降解mRNAmRNA。 為核糖體提供識(shí)別位點(diǎn)，使為核糖體提供識(shí)別位點(diǎn)，使mRNAmRNA很快與核糖體結(jié)合，促很快與核糖體結(jié)合，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成起始復(fù)合物的形成。進(jìn)蛋白質(zhì)合成起始復(fù)合物的形成。 *4）原核）原核mRNA 無(wú)無(wú)5帽子和帽子和3polyA，但有，但有5端先導(dǎo)區(qū)。端先導(dǎo)區(qū)。 SD序列：序列：5端先導(dǎo)區(qū)中，有一段富含嘌呤的端先導(dǎo)區(qū)中，有一段富含

32、嘌呤的堿基序列，典型的為堿基序列，典型的為5-AGGAGGU-3，位于，位于起始密碼子起始密碼子AUG前約前約10核苷酸處，此序列由核苷酸處，此序列由Shine和和Dalgarno發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)，稱稱SD序列序列。通過通過SD序列和核糖體序列和核糖體16S的的rRNA的的3末端富末端富含嘧啶堿基的序列互補(bǔ)。含嘧啶堿基的序列互補(bǔ)。（三）（三）rRNArRNArRNA與核糖體結(jié)合蛋白一起構(gòu)成核糖體。與核糖體結(jié)合蛋白一起構(gòu)成核糖體。 大腸桿菌中有三類大腸桿菌中有三類rRNA（原核）：（原核）： 5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA 真核細(xì)胞有四類真核細(xì)胞有四類rRNA： 5S rRNA、5

33、.8S rRNA、18SrRNA、28S rRNA rRNA的功能：的功能：組成核糖體組成核糖體 23SrRNA具有催化肽鍵形成的肽基轉(zhuǎn)移酶活性具有催化肽鍵形成的肽基轉(zhuǎn)移酶活性參與參與tRNA與與mRNA的結(jié)合的結(jié)合蛋白質(zhì)的合成需要三種蛋白質(zhì)的合成需要三種RNA的參與的參與一、一、核酸的兩性解離核酸的兩性解離n由于核酸分子中的磷酸是一個(gè)中等強(qiáng)度的酸，而由于核酸分子中的磷酸是一個(gè)中等強(qiáng)度的酸，而堿基呈現(xiàn)弱堿性，所以核酸的等電點(diǎn)比較低。堿基呈現(xiàn)弱堿性，所以核酸的等電點(diǎn)比較低。DNADNA的等電點(diǎn)為的等電點(diǎn)為4 44.54.5，RNARNA的等電點(diǎn)為的等電點(diǎn)為2 22.52.5。核酸在其等電點(diǎn)時(shí)溶解

34、度最小。核酸在其等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小。nRNARNA的等電點(diǎn)比的等電點(diǎn)比DNADNA低的原因，是低的原因，是RNARNA分子中核糖分子中核糖基基2-2-OHOH通過氫鍵促進(jìn)了磷酸基上質(zhì)子的解離。通過氫鍵促進(jìn)了磷酸基上質(zhì)子的解離。DNADNA沒有這種作用。沒有這種作用。第四節(jié)第四節(jié) 核酸的性質(zhì)核酸的性質(zhì)二、核酸的水解二、核酸的水解1.1.堿水解堿水解 室溫室溫0.1mol/L 0.1mol/L NaOHNaOH條件下，條件下， DNADNA不水解。不水解。 在相同條件下，在相同條件下，RNARNA完全水解，得到完全水解，得到2-2-和和3-3-磷酸核苷的混合物。磷酸核苷的混合物。這是因?yàn)檫@是因?yàn)镽

35、NARNA中中C2-OHC2-OH的存在，促進(jìn)了磷酸酯鍵的存在，促進(jìn)了磷酸酯鍵的水解。的水解。 DNADNA穩(wěn)定，保留和傳遞遺傳信息。穩(wěn)定，保留和傳遞遺傳信息。 RNARNA是是DNADNA的信使，完成任務(wù)后迅速降解。的信使，完成任務(wù)后迅速降解。2 2、核酸的酶解、核酸的酶解nRNARNA水解酶水解酶 RNaseRNasen DNA DNA水解酶水解酶 DNaseDNasen 核酸外切酶核酸外切酶n 核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶 （限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶）n限制性核酸內(nèi)切酶是限制性核酸內(nèi)切酶是特異性的水解核酸中某些特特異性的水解核酸中某些特定堿基順序部位。定堿基順序部位。三、核酸的紫外吸收三

36、、核酸的紫外吸收n堿基、核苷、核苷酸和核酸在堿基、核苷、核苷酸和核酸在240-290nm有較有較強(qiáng)的光吸收，強(qiáng)的光吸收，max=260nm。1.鑒定純度鑒定純度純純DNA，A260/A280 1.8（1.65-1.85）。）。若大于若大于1.8，表示污染，表示污染了了RNA或或DNA降解。降解。純純RNA，A260/A280 2.0。若有雜蛋白或苯酚，則若有雜蛋白或苯酚，則A260/A280明顯降低明顯降低。2.增色效應(yīng)：增色效應(yīng)：變性后變性后DNA對(duì)對(duì)260nm紫外光的吸收率（紫外光的吸收率（A260）比變性）比變性前明顯增加，這種現(xiàn)象稱為前明顯增加，這種現(xiàn)象稱為增色增色效應(yīng)效應(yīng).天然狀態(tài)的

37、天然狀態(tài)的DNA在完全變性后，紫在完全變性后，紫外吸收外吸收(260 nm)值增加值增加2540%，而，而RNA變性后，約增加變性后，約增加1.1%。3.含量計(jì)算含量計(jì)算1.0 OD相當(dāng)于：相當(dāng)于：50ug/mL雙螺旋雙螺旋DNA或：或：40ug/mL單鏈單鏈DNA（或（或RNA）或：或：20ug/mL核苷酸核苷酸四、核酸的變性、復(fù)性四、核酸的變性、復(fù)性1. 1. 核酸的變性（核酸的變性（denaturationdenaturation）與變性因素與變性因素n核酸的變性是指核酸的變性是指核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過程。單鏈結(jié)構(gòu)的過程。n核酸的變性核酸的變

38、性并不涉及磷酸二酯鍵的斷裂并不涉及磷酸二酯鍵的斷裂，所以它，所以它的一級(jí)結(jié)構(gòu)保持不變。的一級(jí)結(jié)構(gòu)保持不變。n能夠引起核酸變性的因素很多。溫度升高、酸堿能夠引起核酸變性的因素很多。溫度升高、酸堿度改變、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的變度改變、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的變性。性。nA260值增加n粘度下降n浮力密度增大n分子量不變2.2.DNADNA變性后的表現(xiàn)變性后的表現(xiàn)3.3.DNADNA的熱的熱變性和解鏈溫度（變性和解鏈溫度（TmTm）DNADNA的熱變性過程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)的熱變性過程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。因此，間內(nèi)完成。因此，通常將通常將DNADNA的

39、變性達(dá)到的變性達(dá)到50%50%時(shí)時(shí)的溫度稱為的溫度稱為DNADNA的熔解溫度（的熔解溫度（melting melting temperature,Tm),Tmtemperature,Tm),Tm也稱解鏈溫度或也稱解鏈溫度或DNADNA的熔點(diǎn)。的熔點(diǎn)。 一般一般DNADNA的的T Tm m值在值在70-8570-85 C C之間之間影響影響DNADNA的的TmTm值的因素：值的因素： A.DNAA.DNA均一性均一性 均一性高，熔解過程發(fā)生在很小的溫度范圍內(nèi)。均一性高，熔解過程發(fā)生在很小的溫度范圍內(nèi)。 B.G-CB.G-C含量與含量與TmTm值成正比值成正比(G-C)%=(G-C)%=（Tm-6

40、9.3Tm-69.3）2.442.44 C. C.離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度: :離子強(qiáng)度越高離子強(qiáng)度越高，TmTm越高越高。4 4、核酸的復(fù)性、核酸的復(fù)性n變性變性DNADNA在適當(dāng)?shù)臈l件下在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開的單鏈，兩條彼此分開的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為復(fù)復(fù)性性。將熱變性的將熱變性的DNADNA緩慢冷卻時(shí)，可以復(fù)性（一般低于緩慢冷卻時(shí)，可以復(fù)性（一般低于Tm20Tm202525），這一過程也叫退火（），這一過程也叫退火（annealing)annealing)。分子量越大復(fù)性越難。濃度越大，復(fù)性越快。分子量越大復(fù)性越難。濃度越大，復(fù)

41、性越快。DNADNA復(fù)性復(fù)性1.DNA1.DNA分離純化分離純化 真核真核DNADNA以核蛋白以核蛋白（DNPDNP）形式存在形式存在，DNPDNP溶于溶于 水或鹽（水或鹽（1 mol/L 1 mol/L NaClNaCl），），不溶于不溶于0.14 mol/L0.14 mol/L 的的NaClNaCl中。利用此性質(zhì)，可將中。利用此性質(zhì)，可將DNPDNP與與RNARNA核蛋白核蛋白 分開，提取出分開，提取出DNPDNP。 DNADNA核蛋白可用水飽和酚抽提，去除蛋白質(zhì)。核蛋白可用水飽和酚抽提，去除蛋白質(zhì)。 還可用氯仿還可用氯仿- -異戊醇去除蛋白質(zhì)。異戊醇去除蛋白質(zhì)。第五節(jié)第五節(jié) 核酸的研究技

42、術(shù)核酸的研究技術(shù)一、核酸的分離純化一、核酸的分離純化2.RNA2.RNA的分離純化（的分離純化（mRNAmRNA的分離、純化）的分離、純化） 用用0.14mol/L 0.14mol/L NaClNaCl使使DNPDNP沉淀，沉淀， RNARNA核蛋白核蛋白（RNPRNP）在上清液中在上清液中。 去蛋白：鹽酸胍、苯酚等。去蛋白：鹽酸胍、苯酚等。 必須防止必須防止RNARNA酶對(duì)酶對(duì)RNARNA的破壞的破壞。二、限制性核酸內(nèi)切酶二、限制性核酸內(nèi)切酶 1. 1. 限制修飾作用：限制修飾作用：I I、IIII、IIIIII類限制性內(nèi)切酶類限制性內(nèi)切酶 I I和和IIIIII類類: :雙功能酶雙功能酶（

43、甲基化修飾切（甲基化修飾切割）割）IIII類類: :兩種酶組成雙兩種酶組成雙元系統(tǒng)元系統(tǒng) 識(shí)別長(zhǎng)度識(shí)別長(zhǎng)度4 48 8個(gè)核個(gè)核苷酸，且具有回文苷酸，且具有回文結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) 三、核酸的凝膠電泳三、核酸的凝膠電泳1.1.瓊脂糖電泳瓊脂糖電泳分離分離200bp-50kb200bp-50kb片段片段DNADNA2.PAGE2.PAGE電泳電泳分離分離5-500bp5-500bp小片段小片段DNADNA。 EB（溴化乙錠）（溴化乙錠）（1）它的基本步驟為：設(shè)計(jì)一對(duì)引物。優(yōu)化）它的基本步驟為：設(shè)計(jì)一對(duì)引物。優(yōu)化反應(yīng)體系。選擇熱循環(huán)溫度。鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。反應(yīng)體系。選擇熱循環(huán)溫度。鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。（2）工作原理：以擬

44、擴(kuò)增的）工作原理：以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以分子為模板，以一對(duì)分別與模板一對(duì)分別與模板3末端相互補(bǔ)的寡核苷酸片段為末端相互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在引物，在DNA聚合酶的作用下，沿模板鏈延伸直聚合酶的作用下，沿模板鏈延伸直至完成新的至完成新的DNA合成，重復(fù)這一過程，使目的合成，重復(fù)這一過程，使目的DNA片段得到大量擴(kuò)增。片段得到大量擴(kuò)增。（3）用途）用途 目的基因的克隆、基因的體外突變、目的基因的克隆、基因的體外突變、DNA定性定量分析等。定性定量分析等。 五、五、PCR（Polymerase Chain Reaction）四、四、DNADNA序列分析（前面已講）序列分析（前面已講） 反

45、應(yīng)體系：反應(yīng)體系：模板模板DNA引物引物DNA聚合酶聚合酶dNTP一定濃度的一定濃度的Mg2+合成方向：合成方向：5 3PCR.swf六、核酸的雜交（六、核酸的雜交（hybridization）n變性的變性的DNADNA單鏈，在復(fù)性時(shí)并不一定與同源單鏈，在復(fù)性時(shí)并不一定與同源DNADNA互補(bǔ)鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，它也可以與在某互補(bǔ)鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，它也可以與在某些區(qū)域有互補(bǔ)的異源些區(qū)域有互補(bǔ)的異源DNADNA單鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。單鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。這樣形成的新分子稱為這樣形成的新分子稱為雜交雜交DNADNA分子分子。DNADNA單鏈單鏈與互補(bǔ)的與互補(bǔ)的RNARNA鏈之間也可以發(fā)生雜交。鏈之間也可以

46、發(fā)生雜交。核酸雜交的原理：核酸雜交的原理：步驟：步驟：DNA樣品樣品 酶切酶切 電泳電泳 變性變性 轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜 固定固定 雜交雜交 洗滌洗滌 放射自顯影放射自顯影變性（變性（NaOH 0.5mol/L）轉(zhuǎn)膜（轉(zhuǎn)膜（NC膜）膜）固定（固定（80，4-6 hs）雜交（高鹽濃度，雜交（高鹽濃度，68，幾小時(shí)），幾小時(shí)）Southern Blotting可用于可用于DNA之間同源性分析，確定之間同源性分析，確定特異性特異性DNA序列的大小和位置。序列的大小和位置。1. Southern Blotting可用可用DNA或或RNA探針。探針。 SouthernHybridization.mov 2. Nor

47、thern Blotting 研究對(duì)象是研究對(duì)象是mRNA，探針一般探針一般是是DNA。 總總RNA或或mRNA在變性條件下電泳（乙二醛、在變性條件下電泳（乙二醛、甲醛）。甲醛）。（1 1）Southern blottingSouthern blotting： 將限制性內(nèi)切酶酶切電將限制性內(nèi)切酶酶切電泳后的泳后的DNADNA轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)移至NCNC膜上，再與核酸探針雜交的技術(shù)。膜上，再與核酸探針雜交的技術(shù)。研究對(duì)象是研究對(duì)象是DNADNA。 （2 2）Northern blottingNorthern blotting： 將電泳后的將電泳后的RNARNA轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)移至NCNC膜上，再與核酸探針雜交的技術(shù)。研究對(duì)象是膜上，再與核酸探針雜交的技術(shù)。研究對(duì)象是RNARNA。（3 3）Western blotting Western blotting 將聚丙烯酰胺凝膠電泳后將聚丙烯酰胺凝膠電泳后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至NCNC膜上，再與另一標(biāo)記蛋白質(zhì)分子膜上，再與另一標(biāo)記蛋白質(zhì)分子( (如如抗體抗體) )雜交的技術(shù)。研究對(duì)象是蛋白質(zhì)。雜交的技術(shù)。研究對(duì)象是蛋白質(zhì)。分子雜交的區(qū)別：分子雜交的區(qū)別：