A細胞工程第4節(jié)-植物花粉和花藥培養(yǎng).ppt

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第五章花藥和花粉培養(yǎng),植物組織培養(yǎng),第五章花藥和花粉培養(yǎng),本章主要內(nèi)容：花粉和花藥培養(yǎng)的概念和應(yīng)用花粉小孢子發(fā)育途徑花粉和花藥培養(yǎng)方法單倍體植株鑒定和染色體加倍,第5章花藥和花粉培養(yǎng),第一節(jié)花粉和花藥培養(yǎng)的概念和應(yīng)用,花粉和花藥培養(yǎng)的概念花藥和花粉培養(yǎng)的歷史花粉和花藥培養(yǎng)的應(yīng)用,花粉和花藥的培養(yǎng)(pollenandantherculture)是指在人工合成培養(yǎng)基上，改變花粉的發(fā)育途徑,使其不形成配子，而像體細胞一樣進行分裂\分化，由單個花粉粒發(fā)育成完整單倍體植株的技術(shù)。,第5章花藥和花粉培養(yǎng),單倍體植物(haplobiont)用離體培養(yǎng)花藥的方法使花粉發(fā)育成一個完整的植株?；ㄋ幣囵B(yǎng)、花粉培養(yǎng)；胚珠或子房培養(yǎng)（未受精）,一、概念,第5章花藥和花粉培養(yǎng),異同點：,相同點：二者培養(yǎng)的目的一樣，都是要誘導花粉細胞發(fā)育成單倍體細胞，最后發(fā)育成單倍體植株。不同點：花藥培養(yǎng)屬器官培養(yǎng)，花藥是植物花的雄性器官，包括體細胞性質(zhì)的藥壁和藥隔組織，以及雄性性細胞的花粉粒花粉培養(yǎng)屬細胞培養(yǎng):花粉培養(yǎng)沒有藥壁組織干擾；可計數(shù)小孢子產(chǎn)胚率；可觀察雄核發(fā)育的全過程；單倍體產(chǎn)量高。但技術(shù)更復雜，比花藥培養(yǎng)難度大。,二、植物花藥/花粉培養(yǎng)歷史,Guha和Maheshwari（1964）曼陀羅花藥培養(yǎng)Nitsch和Norreel(1973)煙草花粉培養(yǎng)（游離小孢子培養(yǎng)）Chu（1973）小麥花粉培養(yǎng)（早期花藥培養(yǎng)主要依靠小孢子的自然胚胎發(fā)生產(chǎn)生單倍體，能自發(fā)形成胚胎發(fā)生的基因頻率較低，效率極低）80年代后期到90年代期間，花培技術(shù)迅速發(fā)展。許多作物小孢子培養(yǎng)已經(jīng)成功。十字花科、麥類、水稻、玉米等。90年代，一些先前被認為是不易進行小孢子培養(yǎng)的基因型也相續(xù)成功Konzak(1999)。,通過花藥培養(yǎng)育成的甜椒新品種：海花三號,三、花藥和花粉培養(yǎng)的應(yīng)用,1)誘導形成單倍體，快速獲得純系，縮短育種周期；,第5章花藥和花粉培養(yǎng),,,,常規(guī)育種需4-6年獲得純系，而小孢子培養(yǎng)僅需一年。,1、作物育種,常規(guī)育種在雜交F5、F6代開始選擇；花藥培養(yǎng)在F1或F2代進行培養(yǎng)，再人工加倍處理．縮短育種周期3--5年克服后代分離，大大縮短育種周期,第二節(jié)花藥和花粉培養(yǎng)的應(yīng)用,花粉單倍體是純合配子體，從來源于配子體的植株中選擇某一種基因型的概率是(1/2)n，而從常規(guī)雜交F2代群體中，選擇某一基因型的概率為(1/2)2n，故單倍體育種的選擇效率為常規(guī)育種的2n倍。,2)提高目標基因型的選擇效率,例子：二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基因為AAbb的純合單株常規(guī)方法：AAbb出現(xiàn)的概率為1/16，并且不能將AAbb與Aabb、aAbb區(qū)分開。,ABaBAbabABAABBAaBBAABbAaBbaBaABBaaBBaABbaaBbAbAabBAabBAAbbAabbabaAbBaabBaAbbaabb,例子：二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基因為AAbb的純合單株單倍體方法：AAbb出現(xiàn)的概率為1/4。,,,從來源于配子體的植株中選擇某一種基因型的概率是(1/2)n，而從常規(guī)雜交F2代群體中，選擇某一基因型的概率為(1/2)2n，故單倍體育種的選擇效率為常規(guī)育種的2n倍。,,3)誘變育種中的作用,植株不受顯隱性的影響，在誘變育種中能在當代及時獲得突變個體，染色體加倍后成為穩(wěn)定的純系。,可探索親本染色體組的構(gòu)成。分析單倍體植物減數(shù)分裂時，形成二價體的數(shù)目和形狀，能確定染色體組內(nèi)是否存在同源染色體。,2、物種進化研究,單倍體植株中基因不受顯隱性的影響，每一個基因的作用均能表現(xiàn)出來。能用來研究基因的性質(zhì)及其作用。還可用于基因的劑量效應(yīng)分析。,3、遺傳分析,4、構(gòu)建連鎖圖譜,雙單倍體（DH）群體是永久性群體，能有效地用于遺傳圖譜的構(gòu)建。,能直接表達外源基因，不受顯隱性影響,5、用于遺傳轉(zhuǎn)化,第二節(jié)花粉孢子體發(fā)育途徑,概念：花粉孢子體發(fā)育途徑（雄核發(fā)育途徑）花粉是產(chǎn)生花粉植株的原始細胞，其第一次有絲分裂，在本質(zhì)上與合子的第一次孢子體分裂相似，把花粉形成植株的途徑稱為花粉孢子體發(fā)育途徑，也叫雄核發(fā)育途徑,一、花粉發(fā)育的階段,花粉離體培養(yǎng)時，雄核發(fā)育最適宜的時期一般是第一次有分裂或之前。,二、雄核發(fā)育途徑,1、A途徑小孢子第一次有絲分裂為非均等分裂，形成營養(yǎng)細胞和生殖細胞（1）A-V途徑由營養(yǎng)細胞重復分裂形成單倍體（2）A-G途徑由生殖細胞重復分裂形成單倍體（3）A-VG途徑（E途徑）由營養(yǎng)細胞和生殖細胞各自獨立分裂，共同形成單倍體（4）C途徑營養(yǎng)細胞和生殖細胞通過核融合，形成多倍體植株2、B途徑小孢子第一次有絲分裂為均等分裂，形成大小相近的兩個細胞。然后由這兩細胞邊續(xù)分裂形成單倍體植株，或者核融合形成多倍體植株,1、雄核發(fā)育與P花粉的形成P-花粉：具胚胎發(fā)生潛能的花粉。也稱小花粉（S-花粉）或不染色花粉（NS-花粉）2、雄核發(fā)育與饑餓處理饑餓處理改變了小孢子的配子體發(fā)育方向，啟動雄核發(fā)育。,三、雄核發(fā)育啟動機理,,1、胚狀體發(fā)育途徑小孢子經(jīng)歷胚發(fā)生的各個階段，最后子葉展開，形成花粉植株。2、愈傷組織發(fā)育途徑小孢子分裂數(shù)次形成愈傷，再分化形成花粉植株。此途徑產(chǎn)生的植株會出現(xiàn)變異且倍性復雜。,,四、花粉植株形態(tài)發(fā)生方式,胚狀體發(fā)育途徑,部分花藥通過胚狀體途徑形成小植株,煙草花藥培養(yǎng),通過胚狀體途徑再生形成小植株,煙草花藥培養(yǎng),胚狀體發(fā)育途徑,蕓苔屬小孢子培養(yǎng),,愈傷組織發(fā)育途徑,部分花藥產(chǎn)生愈傷組織,接種在平板上的水稻花藥,水稻花藥培養(yǎng),水稻花藥培養(yǎng),第三節(jié)花粉和花藥培養(yǎng)方法,一、花藥培養(yǎng)二、花粉培養(yǎng)三、白化苗現(xiàn)象四、影響雄核發(fā)育和花粉花藥培養(yǎng)的因素,一、花藥培養(yǎng),1、取材鏡檢，根據(jù)花粉的發(fā)育時期，選取大小適宜的花蕾。2、消毒70％酒精擦洗花蕾表面，或70％酒精浸泡30-60s后在1％次氯酸鈉溶液中浸泡10-20min或在0.1％的氯化汞溶液中消毒3-10min，無菌水沖洗3-5次。3、培養(yǎng)固體或液體培養(yǎng)基均可。先進行脫分化培養(yǎng)，至小孢子大量分裂形成胚或愈傷，并突破花藥壁表面，形成突出物（2-3周）；后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，形成小植株。,二、花粉培養(yǎng),(一)花粉的分離與純化1、自然散落法(漂浮培養(yǎng)散落小孢子收集法)將花藥接種在預處理液或液體培養(yǎng)基上，待花粉自動散落后，收集培養(yǎng)。2、擠壓法在燒杯或研缽中擠壓花藥，將花粉擠出后收集培養(yǎng)。,1）磁攪拌法用磁力攪拌器攪拌培養(yǎng)液中的花藥，使花粉游離出來；2）超速旋切法通過攪拌器中的高速旋轉(zhuǎn)刀具破碎花蕾、穗子、花藥，使小孢子游離出來（此法應(yīng)用最廣）。4、小孢子純化對上述方法獲得的小孢子混合物進行分級過篩、梯度離心處理純化小孢子,3、機械游離,梯度離心前（小孢子形態(tài)、活力不一致）,30%蔗糖梯度離心后（獲得均一的小孢子群體）,(二)花粉培養(yǎng)方式,1、平板培養(yǎng)花粉置瓊脂固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。2、液體培養(yǎng)花粉懸浮在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，需震蕩，以利通氣。3、雙層培養(yǎng)花粉置固體-液體雙層培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)基制作方法：先鋪一層瓊脂固體培養(yǎng)基，凝固后，在表面加入少量液體培養(yǎng)基。,,4、看護培養(yǎng)利用花藥或花藥愈傷組織釋放出的活性物質(zhì)促進花粉小孢子發(fā)育。用一塊活躍生長的愈傷組織來看護單個細胞，并使其生長和增殖。這個愈傷組織塊稱為看護愈傷組織,,1）在一個培養(yǎng)瓶中加入一定量厚的固體培養(yǎng)基，滅菌后備用。2）在無菌條件下，將一小塊（1cm3）活躍生長的愈傷組織接種到培養(yǎng)基上，再在愈傷組織塊上放一片（1cm）已滅菌的濾紙，放置過夜。3）將分離的花粉接種到已經(jīng)充分吸收愈傷組織滲透液的濾紙上。4）單細胞分裂形成肉眼可見的小細胞團后，即轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng)，恒溫培養(yǎng)，得到單細胞無性系。,具體方法,2.,看護培養(yǎng)圖解,,5、微室培養(yǎng)利用小的蓋玻片和凹穴載玻片形成微室進行花粉培養(yǎng)。6、條件培養(yǎng)基培養(yǎng)利用培養(yǎng)過花藥的液體培養(yǎng)基或含失活花藥提取物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)?；ㄋ帡l件培養(yǎng)基、子房條件培養(yǎng)等。,微室培養(yǎng)圖示：,,,,,,,,,,平視圖,花粉培養(yǎng)過程,取花蕾（鏡檢）,取花藥,第一節(jié)花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù),三、白化苗現(xiàn)象,,（一）白化苗產(chǎn)生的影響因素及機理1、內(nèi)因供體植株基因型（如秈稻比粳稻白苗率高）、花粉發(fā)育時期。2、外因預處理、培養(yǎng)基成分、激素水平與種類、培養(yǎng)條件和方法、愈傷組織轉(zhuǎn)分化時間等。3、機理核基因起關(guān)鍵作用，導致質(zhì)體DNA缺失，產(chǎn)生白苗。另外地、無性系變異也可能是原因之一。,（二）白化苗的控制,通過對花粉發(fā)育時期、預處理、培養(yǎng)基成分等因素進行調(diào)控。,四、影響雄核發(fā)育和花粉花藥培養(yǎng)的因素,（一）基因型植物基因型是影響雄核發(fā)育的最重要的因素之一。同一物種中的不同基因型對小孢子離體誘導反應(yīng)差異較大。如在水稻中，秈稻花粉培養(yǎng)力遠低于糯稻。,小孢子發(fā)育時期對誘導雄核發(fā)育非常重要。,（三）花粉發(fā)育時期,適宜時期：單核期,尤其是單核中、晚期(單核靠邊期),蕓苔屬植物Brassicanapus不同基因型的小孢子產(chǎn)胚率比較,Topas10,000-200,0001-20Westar1000-10,0000.1-1Delta100-10,0000.01-1Bounty10-1000.001-0.01,基因型胚狀體數(shù)量/106小孢子成苗率（%）,,1、植株生長條件光溫等因素均能影響花藥培養(yǎng)力。一般處于適宜生長條件（如溫室中）較好。但物種間存在差異。2、植株生長時期一般是開花始期優(yōu)于開花末期。3、P花粉的頻率不同溫度、日照時數(shù)、氮饑餓及生長物質(zhì)處理提高P花粉的數(shù)量,（二）供體植株生長條件和生理狀態(tài),,隨著細胞體積迅速增大，細胞核由中央位置推向一邊，即單核靠邊期。。,四分體:醋酸洋紅染色,四分體:Alexander’s染色,單核期,雙核期,成熟花粉粒,處于不同發(fā)育時期的煙草小孢子,一般而言，單核期（第一次有絲分裂前）對誘導反應(yīng)最敏感，為最佳培養(yǎng)期。,形成雙核后，在合適的條件，主要由營養(yǎng)細胞分裂產(chǎn)生胚狀體。,?,不同物種誘導胚胎發(fā)生的最佳小孢子發(fā)育時期,對不同發(fā)育階段的花藥進行培養(yǎng)測試確定最佳小孢子發(fā)育時期的形態(tài)特征注意形態(tài)特征會因品種、發(fā)育狀態(tài)、環(huán)境條件的變化而發(fā)生變化,處于不同發(fā)育階段的煙草花芽,花粉發(fā)育時期的確定,單核期的確定：,根據(jù)細胞觀察推測，雙核期的花粉中開始積累淀粉，不能使花粉發(fā)育成植株。通常采用醋酸洋紅或碘化鉀染色，再壓片鏡檢，以確定花粉的發(fā)育時期。但是接種前不可能把所有的花粉都進行一次發(fā)育時期的鏡檢，通常是按照花蕾長度大小與花粉發(fā)育年齡的相關(guān)性，實際操作中取一定大小的花蕾進行的。,A.通過顯微鏡下觀察確定小孢子發(fā)育時期,醋酸洋紅染色,,DAPI染色,B.通過花蕾外部特征確定小孢子發(fā)育時期,花蕾的外部形態(tài)特征與小孢子的發(fā)育時期有一定的相關(guān)性，花蕾萼裂基部與花冠頂部之差可以作為判斷小孢子發(fā)育時期的基本指標。,預處理是小孢子培養(yǎng)成功的前提條件預處理目的：是改變小孢子的發(fā)育方向，使盡可能多的小孢子從配子體發(fā)育途徑轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育途徑（即成為具胚胎發(fā)生潛力的小孢子）。適當?shù)念A處理能使綠苗產(chǎn)量大量增加。預處理方法：主要是對花藥進行適度的逆境處理，包括低溫、高溫、化學物質(zhì)、離心、射線等。,（四）預處理,1、高低溫處理低溫冷藏是最常用的方法從健壯無病植株采集花蕾，將花蕾用濕紗布包裹放入塑料袋中，置冰箱冷藏。低溫處理可阻止小孢子正常分化，使停留于單核狀態(tài)的花粉顯著增多，有利于誘導分化愈傷組織和胚狀體。例子:十字花科未經(jīng)低溫預處理的花蕾，每花藥產(chǎn)胚數(shù)為4.39個，6-9℃處理1天，產(chǎn)胚數(shù)提高到61.4個，預處理4天后，胚狀體產(chǎn)量降為10.47個。,預處理方法：,高溫處理（熱擊處理）：指花藥接種后，先在較高溫度下（30-35℃）培養(yǎng)數(shù)天，然后再移至正常溫度下繼續(xù)培養(yǎng)。例子:如煙草，32℃高溫；小麥，33℃高溫預處理顯著地提高了小孢子胚胎發(fā)生能力（Touraev，1996）,2、化學物質(zhì)處理,包括高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等進行處理。甘露醇僅能維持滲透壓，不能提供碳源，其主要原理是造成小孢子營養(yǎng)饑餓，從而使小孢子去分化。,3、其它,包括γ射線、離心、磁場等。,（五）培養(yǎng)基,1.基本培養(yǎng)基主要為N6和MS培養(yǎng)基。MS和H培養(yǎng)基：適合雙子葉植物花藥培養(yǎng)；B5培養(yǎng)基：適合豆科和十字花科花藥培養(yǎng)；N6培養(yǎng)基：適合禾谷類作物的花藥培養(yǎng)。Nitsch培養(yǎng)基:適合蕓薹屬和曼陀羅屬。高濃度的NH4+顯著抑制花粉愈傷組織形成。鐵鹽對花粉胚狀體發(fā)育很重要?；钚蕴看龠M胚狀體發(fā)育。,包括蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。不同作物所需最適的碳源種類及濃度的所差異。在辣椒花藥培養(yǎng)中以6%的蔗糖濃度對胚狀體的誘導率為最高。在番茄花藥培養(yǎng)中需要量高達14％。其原因是花粉母細胞的滲透壓比花絲等體細胞高的緣故，即高濃度的蔗糖不利于藥壁、花絲等體細胞的生長，而利于花粉的生長。一般認為單子葉植物比雙子葉植物需糖的濃度要高。玉米中蔗糖效果最好；而麥類作物中，麥芽糖似乎為最好的碳源。較高濃度蔗糖可誘導花粉形成愈傷組織；較低濃度蔗糖可使愈傷組織分化成苗。,2.碳源,3、激素細胞分裂素可促進胚狀體形成；生長素可誘導愈傷組織形成。細胞分裂素與生長素比值高時可誘導愈傷組織分化苗4、氨基酸5、活性碳6、pH,（六）培養(yǎng)條件,1、溫度物種間有差異，培養(yǎng)溫度在25～28℃左右2、光照光暗交替培養(yǎng)，每天12～18h的光照，光照強度2000～10000lx。3、植板密度植板密度與花培效率有很大的相關(guān)性。5103到2104／ml密度均能有效培養(yǎng)。一般來說，足夠數(shù)量的、但相對低密度的小孢子濃度有利于小孢子競爭營養(yǎng)、氧氣、細胞分裂的空間，從則有利于胚狀體發(fā)生。,花藥組織的存在對小孢子的胚性分裂具有明顯的促進作用。但花藥壁損傷會釋放有毒物質(zhì)影響小雄核的發(fā)育。,（七）花藥壁因素,第四節(jié)單倍體植株鑒定和染色體加倍,一、倍性鑒定,二、染色體加倍,一、倍性鑒定（為什么要進行倍性鑒定？）,1、染色體直接計數(shù)法通常取根尖、莖尖等分生組織區(qū)進行制片，直接計數(shù)染色體數(shù)目。2、間接鑒定（1）掃描細胞光度儀鑒定（流式細胞儀）主要測定葉片單個細胞中DNA的含量確定細胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。（2）細胞形態(tài)學鑒定法葉片保衛(wèi)細胞大小、單位面積上的氣孔數(shù)及保衛(wèi)細胞中葉綠體的大小和數(shù)目與倍性具有高度的相關(guān)性。（3）植株形態(tài)學鑒定法單倍體植株瘦弱，葉片窄小，花小柱頭長，花粉粒小，不結(jié)實。,（4）雜交鑒定法自交或測交鑒定，看后代分離情況確定二倍體植株是來自小孢子還是體細胞。（5）分子標記鑒定包括生化標記（如同工酶標記）和分子標記（如RFLP、RAPD、AFLP等）,二、染色體加倍（為什么要進行加倍？）,1.自然加倍:花粉細胞核有絲分裂或核融合可自然加倍，其優(yōu)點是不會出現(xiàn)畸形，缺點是隨機性強，難以掌握和利用。2.人工加倍：用秋水仙素溶液浸苗、處理愈傷組織和用含0.4%秋水仙素的羊毛脂涂抹單倍體植株的頂芽、腋芽，可得到能結(jié)實的二倍體植株。3.愈傷組織反復繼代培養(yǎng)，可得到二倍體植株。將單倍體植株（孢子體）的莖段、葉柄、根莖切下，置適宜的培養(yǎng)基上使之發(fā)生愈傷組織，反復繼代后再將愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，即可獲得較多二倍體植株。由于單倍體愈傷組織在培養(yǎng)過程中會有一定高頻率的核內(nèi)有絲分裂，從而形成二倍體細胞，分化出純合的二倍體植株。,第一節(jié)花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù),單倍體植物天然發(fā)生的途徑：,孤雌生殖,孤雄生殖,無配子生殖,也稱單性生殖，即卵不經(jīng)過受精也能發(fā)育成正常的新個體,配子體可以不經(jīng)過配子的結(jié)合，而直接產(chǎn)生孢子體的，這種現(xiàn)象叫做無配子生殖,,花藥和花粉培養(yǎng)基本流程：,,花藥培養(yǎng)脫毒,1974年日本：花藥培養(yǎng)可以脫除草莓病毒；花藥采取時期單核期：花蕾4-6mm，花藥1mm花藥誘導愈傷組織培養(yǎng)基MS+IAA4mg/L+BA2mg/L+KT2mg/L+蔗糖30g+瓊脂7g/L增殖分化培養(yǎng)基MS+GA1mg/L+IBA0.2mg/L+BA1mg/L+蔗糖30g+瓊脂7g/L生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA0.2mg/L+活性炭3g/L+蔗糖20g+瓊脂7g/L,第一節(jié)花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù),草莓花藥愈傷組織,再生植株,花藥植株,第一節(jié)花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù),孢子有大小兩型,其大形者稱為大孢子胚囊細胞embryo－saccell是種子植物的大孢子，是由胚囊母細胞減數(shù)分裂形成的單倍的細胞，相當于苔蘚植物和蕨類植物的大孢子,被子植物和裸子植物花藥內(nèi)的花粉四分體也稱為小孢子.,孢子是生物所產(chǎn)生的一種有繁殖或休眠作用的細胞，能直接發(fā)育成新個體。孢子一般微小，單細胞。由于它的性狀不同，發(fā)生過程和結(jié)構(gòu)的差異而有種種名稱。生物通過無性生殖產(chǎn)生的孢子叫“無性孢子”，如分生孢子、孢囊孢子、游動孢子等；通過有性生殖產(chǎn)生的孢子叫“有性孢子”，如接合孢子、卵孢子、子囊孢子、擔孢子等；直接由營養(yǎng)細胞通過細胞壁加厚和積貯養(yǎng)料而能抵抗不良環(huán)境條件的孢子叫“厚垣孢子”、“休眠孢子”等。,(1)花藥培養(yǎng)是器官培養(yǎng)，花粉培養(yǎng)屬細胞培養(yǎng)。(2)花藥培養(yǎng)一般選擇花粉的單核期進行接種。(3)花藥培養(yǎng)包括：選擇材料-消毒-接種培養(yǎng)-愈合組織生成-分化出單倍體植株。(4)花粉的發(fā)育途徑包括：營養(yǎng)細胞發(fā)育、生殖細胞發(fā)育、營養(yǎng)和生殖細胞同時發(fā)育及花粉均等分裂發(fā)育。(5)花粉培養(yǎng)包括花粉的分離-預處理-培養(yǎng)過程。,第5章花藥和花粉培養(yǎng),本章小結(jié)：,思考題,１、花藥培養(yǎng)的意義。２、花藥培養(yǎng)方法。３、花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)有何區(qū)別？４、花藥培養(yǎng)時選擇什么發(fā)育時期的花藥？為什么？５、花藥培養(yǎng)時培養(yǎng)基配制有什么特點？,,謝謝!,第5章花藥和花粉培養(yǎng),