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1、第三章第三章 蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)相互作用n蛋白質(zhì)相互作用（蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）是指兩個或兩個以）是指兩個或兩個以上的蛋白質(zhì)分子通過上的蛋白質(zhì)分子通過非共價鍵非共價鍵形成蛋白形成蛋白質(zhì)復合體（質(zhì)復合體（protein complex）的過程）的過程n分子機器分子機器n蛋白質(zhì)復合體是生命分子機器的核心結構蛋白質(zhì)復合體是生命分子機器的核心結構n蛋白質(zhì)復合體的形式蛋白質(zhì)復合體的形式 二聚體dimer 三聚體trimer 寡聚體oligomer 多聚體polymer 同聚體homopolymer 異聚體heteropolymern復合體的形狀
2、復合體的形狀n復合體的穩(wěn)定性復合體的穩(wěn)定性 n細胞內(nèi)環(huán)境有利用蛋白質(zhì)復合體的形成n體外PPI研究難以模擬細胞內(nèi)環(huán)境蛋白質(zhì)網(wǎng)絡（interactome）PPI的結構基礎PPI 界面依靠非共價鍵維系n氫鍵氫鍵n范德華力范德華力n疏水力疏水力n離子鍵離子鍵n共價鍵共價鍵nPPI 界面大小影響穩(wěn)定性蛋白質(zhì)相互作用結構域n結構域是蛋白質(zhì)中折疊較為緊密且具有是蛋白質(zhì)中折疊較為緊密且具有一定功能的球狀和纖維狀的結構，以模一定功能的球狀和纖維狀的結構，以模塊方式具有多種不同功能的分子。塊方式具有多種不同功能的分子。n蛋白質(zhì)相互作用結構域專指那些可以識專指那些可以識別其他蛋白質(zhì)的特殊結構，從而介導兩別其他蛋白質(zhì)
3、的特殊結構，從而介導兩個蛋白之間發(fā)生相互作用的結構域，一個蛋白之間發(fā)生相互作用的結構域，一般由般由50-100個氨基酸組成。個氨基酸組成。n結構域結構域相互作用結構域結構域相互作用n結構域結構域-肽段模體相互作用肽段模體相互作用SH2結構域n約100個氨基酸序列，識別磷酸化的酪氨酸及相鄰的3-6個氨基酸殘基。SH3結構域n由50個氨基酸殘基組成，存在于各種蛋白激酶和銜接蛋白中，識別富含脯氨酸的序列R/KXXPXXP或PXXPXR/K，其親和力與脯氨酸殘基及相鄰氨基酸殘基組成相關。PH結構域n100-120個氨基酸殘基組成，存在于多種細胞骨架蛋白，蛋白激酶、PLC超家族中。n兼具結合脂類和蛋白質(zhì)
4、的能力，參與細胞信號轉導。WW結構域n30-40個氨基酸殘基組成的三股反平行片層結構域，含兩個高度保守的色氨酸WW而得名，識別富含脯氨酸的序列XPPXY，參與非受體信號轉導、轉錄調(diào)節(jié)和蛋白質(zhì)降解等過程。PDZ結構域n由80-100個氨基酸殘基組成，包含2個-螺旋和6個-折疊，常以串聯(lián)重復拷貝存在，是構成支架蛋白的重要結構，在細胞膜蛋白質(zhì)的聚集中發(fā)揮重要作用。蛋白質(zhì)相互作用結構域識別蛋白質(zhì)的翻譯后修飾nSH2結構域識別含磷酸化酪氨酸模體結構域識別含磷酸化酪氨酸模體nFHA結構域和結構域和MH2結構域識別含磷酸化結構域識別含磷酸化絲氨酸絲氨酸/蘇氨酸模體蘇氨酸模體nBromo結構域識別組蛋白中的乙
5、酰化賴結構域識別組蛋白中的乙?；嚢彼岚彼醤Chromo結構域識別組蛋白中的甲基化結構域識別組蛋白中的甲基化賴氨酸賴氨酸銜接蛋白和支架蛋白是蛋白質(zhì)復合體銜接蛋白和支架蛋白是蛋白質(zhì)復合體的接頭和骨架的接頭和骨架nAdaptor proteinnGRB2(growth factor receptor-binding protein2)SH3-SH2-SH3nNCK(noncatalytic region of tyrosine kinase)SH3-SH3-SH3-SH2nScaffold proteinnJIP-1(JNK-interacting protein1)PPI 研究的醫(yī)學意義nPPI
6、PPI異?？蓪е录毎顒邮Э禺惓？蓪е录毎顒邮Э豱相互作用能力的喪失可喪失原有的正常調(diào)節(jié)。相互作用能力的喪失可喪失原有的正常調(diào)節(jié)。n突變也可產(chǎn)生新的相互作用。突變也可產(chǎn)生新的相互作用。n抑制抑制PPIPPIn設計小分子和多肽抑制劑，特異性結合于設計小分子和多肽抑制劑，特異性結合于PPIPPI的界面，的界面，阻斷阻斷PPIPPI。馬拉維諾馬拉維諾 赫賽汀赫賽汀n增強增強PPI PPI P53 MDM2P53 MDM2PPI 研究策略n蛋白質(zhì)復合物空間結構的精細解析蛋白質(zhì)復合物空間結構的精細解析n X射線晶體衍射射線晶體衍射n核磁共振波譜核磁共振波譜n三維電鏡重構技術三維電鏡重構技術nPPI的高
7、通量研究的高通量研究n酵母雙雜交酵母雙雜交n親和純化聯(lián)合質(zhì)譜技術親和純化聯(lián)合質(zhì)譜技術蛋白質(zhì)相互作用的類型蛋白質(zhì)相互作用的類型n蛋白質(zhì)相互作用的類型：蛋白質(zhì)相互作用的類型：牢固型牢固型互作和互作和暫時型暫時型互作兩互作兩種?；プ髁瓤梢詮姡部梢匀?。種?；プ髁瓤梢詮?，也可以弱。n牢固型互作：以多亞基蛋白復合體常見，可以通過牢固型互作：以多亞基蛋白復合體常見，可以通過免免疫共沉淀、疫共沉淀、Pull-down法法研究。研究。n暫時型互作：涉及到胞內(nèi)大部分生物過程，包括蛋白暫時型互作：涉及到胞內(nèi)大部分生物過程，包括蛋白折疊、修飾、轉運、信號轉導和細胞周期等。折疊、修飾、轉運、信號轉導和細胞周期等。
8、研究技術研究技術n酵母雙雜交篩選系統(tǒng)酵母雙雜交篩選系統(tǒng)n蛋白質(zhì)親和色譜蛋白質(zhì)親和色譜 nPull-down Pull-down 技術技術n免疫共沉淀免疫共沉淀n細胞免疫熒光染色細胞免疫熒光染色n熒光共振能量轉移（熒光共振能量轉移（FRETFRET）n表面等離子共振表面等離子共振(一一)酵母雙雜交技術酵母雙雜交技術n一種基因篩選策略：蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的一種基因篩選策略：蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能夠通過報告基因的表達產(chǎn)物敏感地檢測作用也能夠通過報告基因的表達產(chǎn)物敏感地檢測得到得到。n酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報告基因報告基因的表達探測蛋白蛋白的
9、相互作用。的表達探測蛋白蛋白的相互作用。n用于活細胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)之間的相互作用研究。用于活細胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)之間的相互作用研究。n簡便、快速地分離到新的互作蛋白。簡便、快速地分離到新的互作蛋白。原原 理理n原理基于真核細胞轉錄因子的結構特殊性，這些轉原理基于真核細胞轉錄因子的結構特殊性，這些轉錄因子通常需要兩個或以上相互獨立的結構域組成。錄因子通常需要兩個或以上相互獨立的結構域組成。分別使結合域和激活域同分別使結合域和激活域同誘餌蛋白誘餌蛋白和和獵物蛋白獵物蛋白形成形成融合蛋白，在酵母細胞中表達，如果兩種蛋白可以融合蛋白，在酵母細胞中表達，如果兩種蛋白可以發(fā)生相互作用，則可使結合域和激活域在空間
10、上充發(fā)生相互作用，則可使結合域和激活域在空間上充分接近，從而激活報告基因。分接近，從而激活報告基因。n酵母的轉錄因子酵母的轉錄因子GAL4 GAL4由功能上由功能上相互獨立的結相互獨立的結構域構域構成，構成，DNA結合結合功能域功能域(DNA binding domain，DBD)和和轉錄激活結構域轉錄激活結構域（activation domain，AD）。只有當被分開的兩者通過適當?shù)耐緩皆诳臻g）。只有當被分開的兩者通過適當?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時，才能重新呈現(xiàn)完整的上較為接近時，才能重新呈現(xiàn)完整的GAL4轉錄因子轉錄因子活性，使啟動子下游基因得到轉錄?；钚?，使啟動子下游基因得到轉錄。酵母雙雜
11、交酵母雙雜交 優(yōu)優(yōu) 點點1.作用信號是在融合基因表達后，作用信號是在融合基因表達后，在細胞內(nèi)重建轉錄因在細胞內(nèi)重建轉錄因 子的作用而給出的，子的作用而給出的，省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。2.檢測在活細胞內(nèi)進行，檢測在活細胞內(nèi)進行，可以在一定程度上代表細胞內(nèi)可以在一定程度上代表細胞內(nèi) 的真實情況。的真實情況。3.檢測的結果可以是基因表達產(chǎn)物的積累效應，檢測的結果可以是基因表達產(chǎn)物的積累效應，因而可因而可 檢測存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時的相互作用。檢測存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時的相互作用。4.酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織、器官、細胞類型和酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同
12、組織、器官、細胞類型和 分化時期材料構建分化時期材料構建cDNA文庫，文庫，能分析細胞漿、細胞能分析細胞漿、細胞 核及膜結合蛋白等多種不同亞細胞部位及功能的蛋白。核及膜結合蛋白等多種不同亞細胞部位及功能的蛋白。缺點缺點n 自身有轉錄功能的蛋白會造成假陽性。融合自身有轉錄功能的蛋白會造成假陽性。融合蛋白會影響蛋白的真實結構和功能。不利于核蛋白會影響蛋白的真實結構和功能。不利于核外蛋白研究，會導致假陰性外蛋白研究，會導致假陰性。n利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能n在細胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用在細胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用n利用酵母雙
13、雜交篩選藥物的作用位點以及藥物對蛋利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點以及藥物對蛋白質(zhì)之間相互作用的影響白質(zhì)之間相互作用的影響n利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖 （Genome Protein Linkage Map）應應 用用n2005年年9月月1日出版的電子版日出版的電子版Cell上，德國上，德國科學家采用了科學家采用了4456個誘餌蛋白和個誘餌蛋白和5632個個獵物蛋白，采用獵物蛋白，采用 酵母酵母雙雜交方法進行研究。雙雜交方法進行研究。結果，在結果，在1705種蛋白質(zhì)間之間確定了種蛋白質(zhì)間之間確定了3186種新的相互作用關系。同時采用免疫種新的相互作用關
14、系。同時采用免疫共沉淀和共沉淀和Pull-down驗證了這一結果。再驗證了這一結果。再通過拓撲學等評價，至少在通過拓撲學等評價，至少在401種蛋白質(zhì)種蛋白質(zhì)間有間有911種相互作用聯(lián)系。種相互作用聯(lián)系。蛋白質(zhì)親和色譜蛋白質(zhì)親和色譜 n 基本原理是將一種蛋白質(zhì)固定于某種基質(zhì)上（如Sepharose），當細胞抽提液經(jīng)過改基質(zhì)時，可與該固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒有吸附的非目標蛋白則隨洗脫液流出。被吸附的蛋白可以通過改變洗脫液或者洗脫條件而回收下來。應用應用n被用于蛋白質(zhì)復合體的大規(guī)模篩選被用于蛋白質(zhì)復合體的大規(guī)模篩選n與化學交聯(lián)法聯(lián)合可以提高篩選效率與化學交聯(lián)法聯(lián)合可以提高篩選效率n與酵
15、母雙雜交聯(lián)合為探討與酵母雙雜交聯(lián)合為探討PPI的動態(tài)特性提供的動態(tài)特性提供有意義的信息有意義的信息Pull-Down技術技術n 目的：目的：1.用固相化的、已標記的餌蛋白或標簽蛋白（生物素用固相化的、已標記的餌蛋白或標簽蛋白（生物素-、PolyHis-或或GST-），從細胞裂解液中釣出與之互作的），從細胞裂解液中釣出與之互作的 蛋白。蛋白。2.確定已知的餌蛋白與釣出蛋白或已純化的相關蛋白間確定已知的餌蛋白與釣出蛋白或已純化的相關蛋白間 的相互作用關系。的相互作用關系。3.從體外轉錄或翻譯體系中檢測出蛋白相互作用。從體外轉錄或翻譯體系中檢測出蛋白相互作用。優(yōu)優(yōu) 點點 1.用普通的試驗儀器和試劑（
16、如離心機、用普通的試驗儀器和試劑（如離心機、Mini-Gel、蛋白染色）、蛋白染色）2.靈活的靈活的Pull-Down模式，鹽離子、變性劑濃模式，鹽離子、變性劑濃 度可調(diào)，對于弱蛋白相互作用也適用。度可調(diào)，對于弱蛋白相互作用也適用。3.一天之內(nèi)一天之內(nèi)“Pull Down”和檢測可能與餌蛋白和檢測可能與餌蛋白 相結合的蛋白。相結合的蛋白。4.高效回收互作蛋白復合物。高效回收互作蛋白復合物。缺點缺點n表位附加標記可能會使融合蛋白不穩(wěn)定，改變表位附加標記可能會使融合蛋白不穩(wěn)定，改變或或使融合蛋白功能喪失使融合蛋白功能喪失。n 出現(xiàn)假陽性出現(xiàn)假陽性。實驗所檢測到的相互作用可能。實驗所檢測到的相互作用
17、可能時由蛋白質(zhì)所帶電荷引起的，并不是生理性的時由蛋白質(zhì)所帶電荷引起的，并不是生理性的相互作用；蛋白的相互作用可能并不是直接的，相互作用；蛋白的相互作用可能并不是直接的，可是由第三者作為中介的；有時會檢測到兩種可是由第三者作為中介的；有時會檢測到兩種在細胞中不可能相遇卻有極強親和力的蛋白。在細胞中不可能相遇卻有極強親和力的蛋白。因此實驗結果還應經(jīng)其他方法驗證因此實驗結果還應經(jīng)其他方法驗證。免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）n免疫共沉淀（免疫共沉淀（co-IP）是以抗體和抗原之間的是以抗體和抗原之間的特異性結合為基礎，確定兩種蛋白質(zhì)在完整的特異性結合為基礎，確定兩種蛋白質(zhì)在
18、完整的細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。n優(yōu)點優(yōu)點是蛋白處于天然狀態(tài)，蛋白的相互作用可是蛋白處于天然狀態(tài)，蛋白的相互作用可以在天然狀態(tài)下進行，可以避免認為影響；可以在天然狀態(tài)下進行，可以避免認為影響；可以分離得到天然狀態(tài)下相互作用的蛋白復合以分離得到天然狀態(tài)下相互作用的蛋白復合體。體。n缺點：缺點：免疫共沉淀同樣不能保證沉淀的蛋白復免疫共沉淀同樣不能保證沉淀的蛋白復合物時候為直接相互作用的兩種蛋白。另外靈合物時候為直接相互作用的兩種蛋白。另外靈敏度不如親和色譜高。敏度不如親和色譜高。Co-Immunoprecipitation(Western Blot or MS
19、)HBc-YFPpEYFPFLAG-MxA WTFLAG-MxA L612KFLAG-MxA K83A Anti-GFP-IPIPIP4%input4%input FLAG-MxAFLAG-MxAHBc-YFPHBc-YFPYFP細胞免疫熒光染色細胞免疫熒光染色n利用不同熒光基團標記的抗體與細胞內(nèi)相應蛋利用不同熒光基團標記的抗體與細胞內(nèi)相應蛋白的結合，借助激光共聚焦顯微鏡獲取熒光圖白的結合，借助激光共聚焦顯微鏡獲取熒光圖像，若不同的蛋白的熒光圖像有像，若不同的蛋白的熒光圖像有共定位共定位（co-co-localizationlocalization），則可提供這些蛋白有相互作），則可提供這些蛋
20、白有相互作用的可能性。用的可能性。n共定位不一定有相互作用，可能是間接相互作共定位不一定有相互作用，可能是間接相互作用用。MxA colocalizes with HBcAg ACFP-MxAHBcAgMergedHBcAgCFP-K83AHBcAgCFP-L612KMergedMergedLi N et al.Hepatology.2012 BYFP-HBcAgMergedCFP-MxAYFP-HBcAgMergedCFP-K83ACFP-L612KYFP-HBcAgMerged熒光共振能量轉移技術熒光共振能量轉移技術(Fluorescence resonance energy transf
21、er)FRET 原理：原理：兩種熒光蛋白兩種熒光蛋白CFP和和 YFP，CFP的的發(fā)射光譜發(fā)射光譜與與YFP的的吸收光譜吸收光譜有相當?shù)闹丿B有相當?shù)闹丿B,當它們足夠接近當它們足夠接近時時,用用CFP的吸收波長激發(fā)的吸收波長激發(fā),CFP的發(fā)色基團將會的發(fā)色基團將會把能量高效率地共振轉移至把能量高效率地共振轉移至YFP的發(fā)色基團上的發(fā)色基團上,所以所以CFP的發(fā)射熒光將減弱或消失的發(fā)射熒光將減弱或消失,主要發(fā)射將主要發(fā)射將是是YFP的熒光。兩個發(fā)色基團之間的能量的熒光。兩個發(fā)色基團之間的能量轉換效轉換效率率與它們之間的與它們之間的空間距離的空間距離的6次方成反比次方成反比,對空間對空間位置的改變非
22、常靈敏。位置的改變非常靈敏。The donor emission spectrum must significantly overlap the excitation spectrum of the acceptor 供體發(fā)射波與受體供體發(fā)射波與受體激發(fā)波有重疊激發(fā)波有重疊 The donor and acceptor fluorophores must be in favorable mutual orientation 合適的空間取向合適的空間取向 The distance between the donor and acceptor fluorophores must be less t
23、han 100 距離距離100 FRET:basic requirementsDetecting methods Monitor changes in donor fluorescence 檢測供體檢測供體熒光熒光 Monitor changes in acceptor fluorescence 檢測受檢測受體熒光體熒光 Simultaneously measure changes in both donor and acceptor fluorescence using spectral imaging 同時檢測受體和供體熒光同時檢測受體和供體熒光100 Ex=452 nm Em=527 n
24、m Em=475 nm熒光共振能量轉移熒光共振能量轉移(FRET)技術驗證蛋技術驗證蛋白質(zhì)之間的相互作用白質(zhì)之間的相互作用TransferExcitationEmission 要研究兩種蛋白質(zhì)要研究兩種蛋白質(zhì)a和和b間的相互作用間的相互作用,可以根據(jù)可以根據(jù)FRET 原理構建一融合蛋白，這種融合蛋白由三部分組成原理構建一融合蛋白，這種融合蛋白由三部分組成:CFP,蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)b，YFP。用用CFP吸收波長吸收波長452 nm作為激發(fā)波長作為激發(fā)波長,當?shù)鞍踪|(zhì)當?shù)鞍踪|(zhì)a與與b沒有發(fā)生相互作用時沒有發(fā)生相互作用時,CFP與與YFP相距很遠相距很遠 不能發(fā)生熒光共振能量轉移不能發(fā)生熒光共振能量轉移,
25、因而檢測到的是發(fā)射波長因而檢測到的是發(fā)射波長 476 nm的的CFP熒光熒光;但當?shù)鞍踪|(zhì)但當?shù)鞍踪|(zhì)a與與b發(fā)生相互作用時發(fā)生相互作用時,由由 于蛋白質(zhì)于蛋白質(zhì)b受蛋白質(zhì)受蛋白質(zhì)a作用而發(fā)生構象變化作用而發(fā)生構象變化,使使CFP與與YFP 充分靠近發(fā)生熒光共振能量轉移，此時檢測到的就是發(fā)充分靠近發(fā)生熒光共振能量轉移，此時檢測到的就是發(fā) 射波長為射波長為527 nm的的YFP熒光。將編碼這種融合蛋白的基熒光。將編碼這種融合蛋白的基 因通過轉基因技術使其在細胞內(nèi)表達，這樣就可以在活細因通過轉基因技術使其在細胞內(nèi)表達，這樣就可以在活細 胞生理條件下研究蛋白質(zhì)胞生理條件下研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用。
26、蛋白質(zhì)間的相互作用。PhotobleachingPhotobleaching:an example應用實例應用實例1、關于細胞凋亡的研究、關于細胞凋亡的研究Reiko等利用等利用FRET技術研究了技術研究了Caspase8與與Bid蛋白之間的相互作用蛋白之間的相互作用,研究者將研究者將Bid蛋白兩端分別與蛋白兩端分別與CFP與與YFP融合，精心設計使其在沒有被融合，精心設計使其在沒有被裂解前剛好可以發(fā)生裂解前剛好可以發(fā)生FRET，當，當Bid蛋白被裂解后蛋白被裂解后FRET效應自然消效應自然消失，這是一種很好的檢測失，這是一種很好的檢測Caspase8 酶活性方法，而且當酶活性方法，而且當Bi
27、d蛋白與蛋白與CFP與與YFP融合之后仍能行使正常的功能，當融合物在細胞內(nèi)被裂解融合之后仍能行使正常的功能，當融合物在細胞內(nèi)被裂解后，連接后，連接CFP的片段轉移到線粒體，通過的片段轉移到線粒體，通過CFP熒光可以很清楚地觀測熒光可以很清楚地觀測到其在細胞內(nèi)的定位。到其在細胞內(nèi)的定位。2.關于膜蛋白的研究關于膜蛋白的研究 細胞膜受體之間相互作用細胞膜受體之間相互作用:外界外界刺激因素向細胞內(nèi)的信號傳遞一般認為通過其在胞膜上的刺激因素向細胞內(nèi)的信號傳遞一般認為通過其在胞膜上的受體受體,當配體與受體結合后當配體與受體結合后,引起受體構象變化或化學修飾，引起受體構象變化或化學修飾，介導信號傳遞。但是
28、關于介導信號傳遞。但是關于Fas及其同源物及其同源物TNFR(均為胞膜均為胞膜上的三聚體受體上的三聚體受體)的研究發(fā)現(xiàn)的研究發(fā)現(xiàn),它們都可以在無配體存在的情它們都可以在無配體存在的情況下自發(fā)組裝況下自發(fā)組裝,并介導信號傳遞并介導信號傳遞,引發(fā)細胞凋亡。其中在鑒定引發(fā)細胞凋亡。其中在鑒定Fas發(fā)生三聚體化的實驗中使用了發(fā)生三聚體化的實驗中使用了FRET技術技術,將將Fas分別與分別與CFP和和YFP融合融合,利用此項技術可以很方便地觀測到利用此項技術可以很方便地觀測到Fas單體單體是否發(fā)生聚合。是否發(fā)生聚合。n優(yōu)點：優(yōu)點：免疫共沉淀、免疫共沉淀、pull-down等技術需要破等技術需要破碎細胞，
29、只能反映細胞群體的靜態(tài)事件，碎細胞，只能反映細胞群體的靜態(tài)事件，F(xiàn)RET實現(xiàn)了單個活細胞實現(xiàn)了單個活細胞PPI在體內(nèi)實時動態(tài)在體內(nèi)實時動態(tài)的連續(xù)觀測。的連續(xù)觀測。n缺點：缺點：要求發(fā)色基團的距離小于要求發(fā)色基團的距離小于100埃。另外埃。另外設備昂貴，還需要融合蛋白標記設備昂貴，還需要融合蛋白標記。表面等離子共振技術表面等離子共振技術surfaceplasmonresonancetechnology(SPR)n 該技術是將誘餌蛋白結合于葡聚糖表面，葡聚糖層固該技術是將誘餌蛋白結合于葡聚糖表面，葡聚糖層固定于幾十納米厚的技術膜表面。當有蛋白質(zhì)混合物經(jīng)定于幾十納米厚的技術膜表面。當有蛋白質(zhì)混合物經(jīng)
30、過時，如果有蛋白質(zhì)同過時，如果有蛋白質(zhì)同“誘餌誘餌”蛋白蛋白發(fā)生相互作用，發(fā)生相互作用，那么兩者的結合將使金屬膜表面的折射率上升，從而那么兩者的結合將使金屬膜表面的折射率上升，從而導致共振角度的改變。而共振角度的改變與該處的蛋導致共振角度的改變。而共振角度的改變與該處的蛋白質(zhì)濃度成線性關系，由此可以檢測蛋白質(zhì)之間的相白質(zhì)濃度成線性關系，由此可以檢測蛋白質(zhì)之間的相互作用?；プ饔?。n優(yōu)點優(yōu)點：該技術不需要標記物和染料，安全靈敏快速，：該技術不需要標記物和染料，安全靈敏快速，還可定量分析。還可定量分析。n缺點缺點：需要專門的等離子表面共振檢測儀器。：需要專門的等離子表面共振檢測儀器。其他技術其他技術
31、n交聯(lián)技術（交聯(lián)技術（crosscrosslinKinglinKing）n蛋白質(zhì)探針技術蛋白質(zhì)探針技術n噬菌體展示技術（噬菌體展示技術（Phage displayPhage display）n生物信息學的方法（生物信息學的方法（Docking 嵌合計算）嵌合計算）預測預測PPIPPInPPIPPI的預測主要基于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中已知的相的預測主要基于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中已知的相互作用數(shù)據(jù)庫，對互作用數(shù)據(jù)庫，對PPIPPI結構域的結構和識別序結構域的結構和識別序列等信息，通過相應算法，預測蛋白質(zhì)間是否列等信息，通過相應算法，預測蛋白質(zhì)間是否存在相互作用。存在相互作用。nPDB(protein databank)nPQS(protein quaternary structure)
分子生物學課件：第三章 蛋白質(zhì)相互作用
