《蛋白質(zhì)相互作用》PPT課件.ppt

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1、蛋白質(zhì)相互作用： 本身具有生物學(xué)意義：這樣的相互作用在生物體中是起什么作用的 發(fā)展技術(shù)：利用這樣的相互作用創(chuàng)造出一些人為的作用,研究蛋白質(zhì)相互作用的目的是發(fā)現(xiàn)并明確其相互作用的生物學(xué)意義 蛋白質(zhì)相互作用是一種表象，通過表象分析規(guī)律，是研究蛋白質(zhì)相互作用的核心 “種瓜得瓜，種豆得豆”是一種表象，反映了遺傳這樣一種本質(zhì) 現(xiàn)象 可研究對(duì)象 合適的研究方法,,,研究蛋白質(zhì)相互作用需要微觀和宏觀的結(jié)合,象與象的一部分,定量分析是研究蛋白質(zhì)相互作用的基礎(chǔ),Input：1020mg total proteins IP sample：Immunoprecipitated from 1000mg of tota

2、l proteins,定量分析是研究蛋白質(zhì)相互作用的基礎(chǔ),Relative exposure level,研究蛋白質(zhì)相互作用的意義 1、蛋白質(zhì)間的相互作用是細(xì)胞生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。 2、基因只是決定蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)才是發(fā)揮作用的主體。蛋白質(zhì)的相互作用是發(fā)揮其功能的主要活動(dòng)。,生物學(xué)效應(yīng),穩(wěn)定的相互作用與瞬間的相互作用共同構(gòu)成蛋白質(zhì)相互作用的內(nèi)涵。,研究蛋白質(zhì)相互作用是為了研究相應(yīng)的生物學(xué)功能,,,確定研究目標(biāo),,,,尋找相互作用,建立相互作用網(wǎng)絡(luò)和功能體系,,從蛋白質(zhì)相互作用到生物學(xué)功能。運(yùn)用蛋白質(zhì)直接相互作用，發(fā)現(xiàn)相互作用蛋白質(zhì)，再分析這些作用的生物學(xué)意義。 容易犯的錯(cuò)誤：研究一大堆的蛋白相互作

3、用，卻不知道這些相互作用有什么生物學(xué)意義。 從物學(xué)功能到蛋白質(zhì)相互作用。通過改變生物學(xué)現(xiàn)象，分析蛋白質(zhì)間的遺傳相互作用，進(jìn)一步研究相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用。 容易犯的錯(cuò)誤：找到了平行變化的不相關(guān)蛋白質(zhì)。,發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)相互作用 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用 遺傳功能分析 序列與結(jié)構(gòu)比較模擬 驗(yàn)證蛋白質(zhì)相互作用 不同方法的交叉驗(yàn)證 不同生物體系中驗(yàn)證,Protein interaction Affinity: A+B=AB,Kd=AB/AB, Kd: dissociation constant,Interaction Kd Streptavidin-biotin binding

4、 10-14M Antibody-antigen interaction (good) 10-8-10-10M Antibody-antigen interaction (weak) 10-6M Enzyme-substrate 10-6-10-10M,蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用,蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用,Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗體結(jié)合） Affinity interaction（親和作用） Yeast two-hybrid and phage display（酵

5、母雙雜交和噬菌體展示） Surface Plasmon Resonance FRET Proteomic analysis（蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)）,Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗體結(jié)合） Western blot：變性抗原，主要用于檢測(cè)蛋白質(zhì)的存在與否。 免疫共沉淀：非變性抗原，用于鑒定不同蛋白質(zhì)間的相互作用。 免疫共沉淀：AbPr1Pr2 非特異性結(jié)合：Pr1AbPr2 抗體篩庫：cDNA表達(dá)庫，抗體結(jié)合表達(dá)的蛋白質(zhì)，從而得到基因。已經(jīng)被質(zhì)譜和PCR所淘汰,Western blot,1、電轉(zhuǎn)移效率

6、2、PVDF膜的充分浸潤 3、轉(zhuǎn)移液中有太多的SDS 4、膜的損壞 5、轉(zhuǎn)移時(shí)膠和膜沒有完全接觸 6、抗體的問題 7、抗體的濃度太高或太低 8、還原性物質(zhì)的存在 9、封閉不充分,SDSPAGE acrylamide的濃度 蛋白質(zhì)上樣的量 相鄰泳道的蛋白質(zhì)量、離子強(qiáng)度和樣品體積 轉(zhuǎn)移膜：PVDF膜nitrocellulose膜 抗體,免疫共沉淀 免疫共沉淀：AbPr1Pr2 非特異性結(jié)合：Pr1AbPr2,免疫共沉淀,1,2,3,5,4,抗體很差， Western blot問題 Loading比例不對(duì) 樣品太多 正確,蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用,Co-immunoprecipitation

7、and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗體結(jié)合） Affinity interaction（親和作用） Yeast two-hybrid and phage display（酵母雙雜交和噬菌體展示） Surface Plasmon Resonance FRET Proteomic analysis（蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)）,Affinity interaction（親和作用） GST pull down：已知蛋白質(zhì)和GST融合，與細(xì)胞或組織的“蛋白質(zhì)湯”混合，用谷胱甘肽親和層析分離和已知蛋白質(zhì)結(jié)合的新蛋白質(zhì)。GST tag。 BiotinAvidin結(jié)合：B

8、iotin標(biāo)記已知蛋白質(zhì)，通過Avidin結(jié)合biotin標(biāo)記的蛋白質(zhì)，從而得到與biotin 標(biāo)記蛋白結(jié)合的新蛋白質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)是biotinavidin的結(jié)合是最牢靠的；缺點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)結(jié)合biotin的蛋白質(zhì)很多。 各種不同的tag。許多,GST pull down,GST Fusion Protein Purification,GST pull down,GST fusion protein 不夠純，用作bait會(huì)產(chǎn)生太多的非特異性蛋白質(zhì)污染。,,,,,,,,,,,,,,,,,,GST pull down,GST Pulldown,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,binding

9、,wash,elution,BiotinAvidin結(jié)合：生物界最穩(wěn)定的結(jié)合之一,蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用,Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗體結(jié)合） Affinity interaction（親和作用） Yeast two-hybrid and phage display（酵母雙雜交和噬菌體展示） Surface Plasmon Resonance FRET Proteomic analysis（蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)）,Yeast two-hybrid （酵母雙雜交）,發(fā)現(xiàn)新的相互作用蛋白質(zhì) 鑒定和分

10、析已有的蛋白質(zhì)間的相互作用 確定蛋白質(zhì)間相互作用的功能基團(tuán),發(fā)現(xiàn)新的相互作用蛋白質(zhì),確定蛋白質(zhì)間相互作用的功能基團(tuán),Protein A,,,,,AD,3,白 蘭 白 白,鑒定和分析已有的蛋白質(zhì)間的相互作用,蘭：相互作用 白：不相互作用,Two-Hybrid的優(yōu)點(diǎn)： 是酵母細(xì)胞內(nèi)的in vivo相互作用。 只需要cDNA，簡單。 弱的相互作用也能檢測(cè)到。,Two-Hybrid的缺點(diǎn)： 都是融合蛋白，萬一融合出新的相互作用。 酵母的翻譯后修飾不盡相同。尤其是蛋白質(zhì)的調(diào)控性修飾。 自身激活報(bào)告基因。 都基因庫的要求比較高，單向1/3是in frame 蛋白質(zhì)毒性。 第三者Z插足介導(dǎo)的相互

11、作用。 假陽性。,,lacZ,Auto activation,Phage display（噬菌體展示）,Phage display（噬菌體展示） Phage display的最大優(yōu)點(diǎn)是數(shù)量大 細(xì)胞：108109 細(xì)菌：1010 Phage：1012,尋找受體的配體 7肽：8x1016,蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用,Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗體結(jié)合） Affinity interaction（親和作用） Yeast two-hybrid and phage display（酵母雙雜交和噬菌體展示

12、） Surface Plasmon Resonance FRET Proteomic analysis（蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)）,SPR is used to monitor interactions occurring in a biospecific surface on a metal layer by measuring changes in the solute concentration at this surface as a result of the interactions.,Surface Plasmon Resonance,SPR 優(yōu)點(diǎn)：無標(biāo)記、實(shí)時(shí) Label-free de

13、tection SRP does not require any labels or reporter groups to detect biomolecular interactions. It follows every step in a multi-step analysis procedure, in contrast to label-based methods that often only report the final step. Real time measurement The progress of interactions is displayed directly

14、, as a plot of response (which is directly related to concentration changes at the surface) against time. Immediate feedback on the status of an interaction speeds up assay development and analysis. The results can be processed further after the run, for example to extract kinetic constants for the

15、interaction.,蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用,Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗體結(jié)合） Affinity interaction（親和作用） Yeast two-hybrid and phage display（酵母雙雜交和噬菌體展示） Surface Plasmon Resonance FRET Proteomic analysis（蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)）,Donor,Acceptor,(2-10nm),Excitation frequency,,Emission frequency = Ex

16、citation frequency,,,Emission frequency,,Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET),,Donor is excited at the maximum absorbance wavelength (380 nanometers) of the donor,Acceptor signal is increased at the acceptor emission maximum (510 nanometers),Wavelength of the Fluorescent Proteins,Measure in

17、teractions between two proteins in vivo Very sensitive Excellent resolution Helpful in characterizing major conformational changes in macromolecules Determine the interaction qualitatively and quantitatively,Advantages of FRET,Limitations of FRET,FRET only occurs when the two fluorophores are within

18、 2-10nm of each other, which means that the fluorophores must be brought together via very close protein-protein interactions. Require expensive equipment. Require labeling of proteins using fluorophore or GFP fusion,Proteomic analysis（蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)） 有專門的課題加以介紹,研究蛋白質(zhì)相互作用的單分子技術(shù)：原子力相互作用,遺傳功能分析 利用功能缺陷和互補(bǔ)來分析不

19、同蛋白質(zhì)間的相互關(guān)系。 不是蛋白質(zhì)直接相互作用的證據(jù)，但可以提供進(jìn)一步研究的目標(biāo)。,蛋白質(zhì)遺傳相互作用（genetic interaction） 是功能性相互作用,有A：小量表達(dá)； 有B：無表達(dá)；有C：無表達(dá),A,B,C,B,C,有A和B：表達(dá)增加；有A和C：小量表達(dá)； 有B和C：無表達(dá),A,B,C,C,有A、B和C：高表達(dá),在A、B和C的蛋白質(zhì)復(fù)合體中，A是和基因調(diào)控區(qū)結(jié)合并有小的轉(zhuǎn)錄活性；B可以和A結(jié)合促進(jìn)A的轉(zhuǎn)錄活性；C本身不能直接促進(jìn)A的活性，所以不大可能和A有直接相互作用，但能通過B的介導(dǎo)進(jìn)一步促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。,蛋白質(zhì)直接相互作用：從蛋白質(zhì)物理的相互作用到功能上的相互作用。 蛋白質(zhì)遺傳相互

20、作用：從功能上的相互作用到蛋白質(zhì)物理的相互作用。 蛋白質(zhì)相互作用是物理相互作用和功能相互作用的統(tǒng)一,蛋白質(zhì)直接相互作用：從蛋白質(zhì)物理的相互作用到功能上的相互作用。 蛋白質(zhì)遺傳相互作用：從功能上的相互作用到蛋白質(zhì)物理的相互作用。 蛋白質(zhì)相互作用是物理相互作用和功能相互作用的統(tǒng)一,生物學(xué)功能的研究： 相互作用的生物學(xué)功能研究基本上可以歸為兩類：獲得功能或失去功能。,生物學(xué)問題,技術(shù)手段,對(duì)問題的認(rèn)識(shí),,,相互作用與功能,獲得功能：轉(zhuǎn)基因表達(dá)，使得原本不表達(dá)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞表達(dá)了蛋白質(zhì)，從而和已有的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，細(xì)胞有了新的功能。 常用的方法有細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)基因過表達(dá)蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)基因老鼠。,失去功能：抑

21、制蛋白質(zhì)的表達(dá)或用dominant negative突變體，使原有的蛋白質(zhì)缺失或失活，細(xì)胞功能的喪失。 常用的方法有：RNA干擾使蛋白質(zhì)不表達(dá)、蛋白質(zhì)部分功能片斷的影響、基因敲除的細(xì)胞、基因敲除的老鼠。,從生物學(xué)功能的改變到相互作用蛋白質(zhì) 的發(fā)現(xiàn)。 功能性篩選：RNAi，基因敲除小鼠,一些常規(guī)生化技術(shù)方法：方法和原理 蛋白質(zhì)等電點(diǎn)計(jì)算：對(duì)于實(shí)驗(yàn)buffer體系pH值有重要作用。 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定：定量分析的基礎(chǔ)。 熒光：ECL和細(xì)胞免疫熒光。 層析：離子交換、分子篩、親和層析、反相層析、等。 離心：超速離心。 電泳：SDS-PAGE、非變性電泳、等點(diǎn)聚焦、等。 Kit方便了我們的實(shí)驗(yàn)，但不能方便我們對(duì)原理的認(rèn)識(shí)。,謝 謝,