專題五2多聚酶鏈式反應擴增DNA片段ppt課件

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多聚酶鏈式反應 擴增DNA片斷,溫故知新1:,組成DNA分子的基本單位是什么? 這些基本單位是如何連接成DNA分子的? DNA分子結構有什么特點？,2,A,G,C,T,1、DNA的基本單位－脫氧核苷酸,一、DNA分子的結構,C,G,A,3,4,5,脫氧核苷酸鏈結構簡圖,磷酸二酯鍵,6,5’,5’,3’,3’,7,DNA分子的復制過程是怎樣的？ DNA分子的復制需要哪些條件？,溫故知新2,8,2、時間：,細胞分裂間期（有絲分裂間期，減數(shù)第一次分裂的間期）,,,1、概念：以親代DNA為模板，根據(jù)堿基互補配對合成子代在DNA的過程。,3、場所：主要是細胞核 （其次是線粒體、葉綠體）,二．細胞內(nèi)DNA復制的過程,9,4、 條件：,① 模板： 親代DNA的兩條母鏈 ② 原料： 游離的四種脫氧核苷酸 ③ 能量： ATP ④ 酶： 解旋酶 、DNA聚合酶 ⑤ 引物：一小段RNA，能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對,5、過程,（1）解旋：解旋酶 、ATP,（2）以DNA的兩條母鏈為模板，根據(jù)堿基互補配對規(guī)則，合成子鏈。,（3）子鏈、母鏈螺旋構成子代DNA,,10,6、復制特點,半保留復制，邊解旋邊復制，多起點復制。,,,7、DNA復制的方向,DNA的合成方向總是從子鏈的5’端向3’端延伸,11,,12,1、 PCR（多聚酶鏈式反應）技術：是一種體外迅速擴增DNA片段的技術，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時內(nèi)復制出上百萬份的DNA拷貝。 2、原理：利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結合。,一、基礎知識 （一）PCR原理：,13,體內(nèi)DNA復制與PCR的技術區(qū)別：,14,DNA母鏈：提供復制的模板 解旋酶： 打開DNA雙鏈 4種脫氧核苷酸：合成子鏈的原料 DNA聚合酶： 催化合成DNA子鏈 ATP：為復制過程提供能量 引物：使DNA聚合酶從引物的3′端開始連 接脫氧核苷酸(一小段RNA),3、PCR反應的條件,80—100℃：,耐熱的DNA聚合酶：,緩沖溶液：維持反應的pH值不變,(一般是一小段單鏈DNA),15,(二)PCR反應的過程,1、變性：,溫度上升到90℃以上時,雙鏈DNA解聚成為單鏈。,2、復性（退火）：,溫度下降到50℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合。,3、延伸：,溫度上升到72℃左右,溶液中的4種脫氧核苷酸在Taq DNA聚合酶的作用下,根據(jù)堿基互補配對的原則合成新的DNA鏈。,16,PCR 循環(huán)第一步 ：加熱變性: 雙鏈DNA解聚成為單鏈,17,PCR 循環(huán)第二步 ：引物與模板序列復性（退火）: 引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合,18,PCR 循環(huán)第三步 ：引物延伸: 合成新的DNA鏈,,19,模板序列,模板序列,第1個 PCR 循環(huán)完成后 ：得到兩個拷貝的序列,20,30次循環(huán)后擴增的數(shù)量,21,4、PCR 循環(huán)的結果,② DNA聚合酶只能特異性地復制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴增。,①從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會與引物Ⅱ結合，進行DNA的延伸。,22,第一輪結果,1,2,3,4,1,2,3,4,第二輪結果,23,二、 實驗操作,1、PCR儀,（一）設備及用具,實質(zhì)上一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器。,2、微量離心管,一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml。,3、微量移液器,用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次。,24,PCR儀,25,26,1、準備,2、移液,（二）實驗操作步驟,按照PCR反應體系的配方將所需用的試劑擺放在實驗桌上,用微量移液器按照PCR反應體系配方往微量離心管里面加入各種試劑,27,①過程：蓋嚴微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁。,②注意：,3、混合,B、手指輕輕彈擊微量離心管的管壁，目的是使反應液混合均勻。,A、離心管口的蓋子一定蓋嚴，防止實驗中脫落或液體外溢。,28,將離心管放入PCR儀上，設置好PCR儀的循環(huán)程序。,①過程：將微量離心管放在離心機上,離心約10s。,4、離心,5、反應,②離心目的：使反應液體集中在離心管底部，提高反應效果。,29,30,PCR技術高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾實驗，PCR操作時要注意做到：,6、注意事項,①隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進行高壓滅菌；,②分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性槍頭,一次性吸液槍頭用一次更換一次。,31,（一）理論上DNA擴增數(shù)目的計算,三、課題成果評價,1 、一條DNA，復制n次， DNA為：2n,2 、 a條DNA，復制n次， DNA為：a2n,（二）實驗中DNA含量的測定,1 、原理,可以通過計算DNA含量來評價擴增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關。,32,2 、過程,①稀釋,2uLPCR反應液，加入98uL蒸餾水，即將樣品進行50倍稀釋。,②對照調(diào)零,以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零。,取DNA稀釋液100uL至比色杯中，測定260nm處的光吸收值。,③計算,33,④計算,DNA含量（ ?g ）＝ 50 x（260nm的讀數(shù)）x稀釋倍數(shù),公式中50的含義：50?g /ml的DNA在標準厚度為1cm比色杯中的吸光值為1。,34,比色杯,35,（三）DNA片段擴增失敗的原因,可能的原因有：漏加了PCR的反應成分，各反應成分的用量不當，PCR程序設置不當?shù)取?36,四、 課題延伸,例如：PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍，30輪循環(huán)擴增量達230個拷貝。,PCR技術是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。 它具有特異性強、敏感性高、產(chǎn)率高、 快速、 簡便、重復性好、易自動化等突出特點。,37,五、實驗小結,PCR儀加熱使（ ）變性, 復性使引物與模板DNA（ ）,延伸需將反應溫度升至中溫( ),在（ ）的作用下,以 （ ）為原料,以（ ）為復制的起點,合成新鏈。 如此重復改變反應溫度,經(jīng)（ ）三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍; 將擴增產(chǎn)物進行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴增特異區(qū)段的DNA帶。,模板,互補,Taq聚合酶,四種脫氧核苷酸,引物,變性、復性和延伸,72℃,38,課堂小結,,39,練習鞏固,1、關于PCR技術的應用，錯誤的一項是 A 古生物學、刑偵破案、DNA序列測定 B 診斷遺傳疾病、基因克隆、古生物學 C DNA序列測定、基因克隆、刑偵破案‘ D 診斷遺傳疾病、合成核苷酸、DNA序列測定,40,2、DNA的合成方向總是從子鏈的哪一端向哪一端延伸？,3、PCR技術最突出的優(yōu)點是 A 原理簡單 B 原料易找 C TaqDNA聚合酶有耐熱性 D 快速、高效、靈活、易于操作,從子鏈的5’端向3’端延伸,41,4、做PCR使用的微量離心管、槍頭、緩沖液及蒸餾水使用前必須進行的關鍵步驟是 A 反復洗滌 B 不怕外源DNA污染 C 高壓滅菌 D 在—20 ℃儲存,42,