《DNA的生物合成》PPT課件

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1、10 DNA的 生 物 合 成n 10.1 半 保 留 復(fù) 制n 10.2 參 與 DNA生 物 合 成 的 酶n 10.3 以 DNA為 模 板 合 成 DNA的 過 程n 10.4 DNA損 傷 與 修 復(fù)n 10.5 以 RNA為 模 板 合 成 DNA的 過 程 10.1 半 保 留 復(fù) 制n 10.1.1 半 保 留 復(fù) 制 的 實(shí) 驗(yàn) 證 據(jù)n 10.1.2 半 保 留 復(fù) 制 的 意 義 DNA 復(fù) 制是 半保 留復(fù) 制 10.1.1 半 保 留 復(fù) 制 的 實(shí) 驗(yàn) 證 據(jù) 細(xì)菌的DNA雙鏈 15N N41 N41 15N 含 N-DNA 的細(xì)菌 15 第一代第二代培養(yǎng)液中培養(yǎng)N

2、41 培養(yǎng)液中培養(yǎng)N41 /15N15NN41 / N41 N41 /15N N41 /15N 密度梯度離心結(jié)果 10.1.2 半 保 留 復(fù) 制 的 意 義n 按 半 保 留 復(fù) 制 的 方 式 ， 子 代 保 留 了 親代 DNA 的 全 部 遺 傳 信 息 ， 保 證 了 遺傳 信 息 的 相 對 穩(wěn) 定 ， 是 物 種 穩(wěn) 定 性 的分 子 基 礎(chǔ) 。 10.2 參 與 DNA生 物 合 成 的 酶n 10.2.1 DNA聚 合 酶n 10.2.2 DNA分 子 的 拓 撲 學(xué) 變 化 和 相 關(guān) 酶n 10.2.3 引 物 酶n 10.2.4 DNA連 接 酶 10.2.1 DNA聚

3、 合 酶n 以 DNA 聚 合 酶 I 為 代 表 說 明 三 個(gè) 酶的 共 性 : （ 1） 是 一 個(gè) 模 板 指 導(dǎo) 酶 。 （ 2） 聚 合 需 要 引 物 。 （ 3） 具 有 水 解 作 用 。 （ 1） 模 板 指 導(dǎo) 酶 即 需 要 打 開 的 DNA 單 鏈 作 為 模 板 才 能合 成 子 鏈 。 此 酶 催 化 的 底 物 ： 必 須 是 脫 氧 的核 苷 5 -三 磷 酸 （ dATP、 dG TP、 dTTP和dCTP） ； 只 有 當(dāng) 所 有 4 種 脫 氧 核 苷 三 磷 酸 以 及 DNA 模 板 存 在 時(shí) ， 才 能 實(shí) 現(xiàn) DNA 的 合 成 。 （ 2）

4、 需 要 引 物 DNA 聚 合 酶 只 能 將 脫 氧 核 苷 酸加 于 已 存 在 的 DNA 或 RNA 鏈 的 3 -羥基 上 ， 否 則 不 能 合 成 。 這 是 一 個(gè) 耗 能 反 應(yīng) ， 每 合 成 一 個(gè) 核苷 酸 消 耗 2 分 子 ATP。 聚 合 反 應(yīng) 是 延 著 5 3 的 方 向 進(jìn) 行 。 （ 3） 具 有 水 解 作 用n 3 5 外 切 活 力 的 作 用 ： 復(fù) 制 “ 校對 ” 作 用 。 從 DNA 鏈 3 - 羥 基 端 逐 個(gè) 水 解 成 單 核 苷 酸 的 作 用 。 n 5 3 外 切 活 力 的 作 用 ： 從 5 端切 去 引 物 RNA

5、的 功 能 。 從 5 端 對 DNA 進(jìn) 行 水解 的 作 用 。 這 兩 種 酶 活 性 稱 為 DNA 聚 合 酶 的 外 切 活 力 ， 對 DNA 的 復(fù) 制 都是 十 分 重 要 的 。 大 腸 桿 菌 體 內(nèi) 各 聚 合 酶 作 用 ：n 聚 合 酶 是 復(fù) 制 時(shí) 的 主 要 聚 合 酶 ；n 聚 合 酶 I 主 要 負(fù) 責(zé) 消 除 引 物 并 用 脫 氧 核苷 酸 填 滿 內(nèi) 隙 ；n 聚 合 酶 的 作 用 尚 不 清 楚 。n DNA聚 合 酶 和 它 們 涉 及 DNA的 錯(cuò)誤 傾 向 修 復(fù) 。 當(dāng) DNA受 到 嚴(yán) 重 損 傷 時(shí) ， 既 可 誘 導(dǎo)產(chǎn) 生 這 兩

6、個(gè) 酶 ， 使 修 復(fù) 缺 乏 準(zhǔn) 確 性 ， 因 而 出 現(xiàn) 高 突 變率 。 它 能 在 DNA 許 多 損 傷 部 位 繼 續(xù) 復(fù) 制 ， 在 跨 越 損傷 部 位 時(shí) 就 造 成 了 錯(cuò) 誤 傾 向 的 復(fù) 制 。 高 突 變 率 雖 會 殺死 許 多 細(xì) 胞 ， 但 至 少 可 以 克 服 復(fù) 制 障 礙 ， 使 少 數(shù) 突 變的 細(xì) 胞 得 以 存 活 。 DNA 聚 合 酶 ： 它 至 少 由 8 種 亞 基 組 成 。 這 種 組 裝 體 使 酶 的 催 化能 力 、 準(zhǔn) 確 性 大 為 提 高 。 它 緊 緊 地 結(jié) 合 于 模 板 ， 每秒 鐘 聚 合 1000 多 個(gè) 核

7、 苷 酸 。 許 多 亞 基 的 功 能 目 前 還 不 清 楚 ， 已 知 催 化 活 性位 于 亞 基 ， 亞 基 大 約 把 酶 的 核 心 夾 于 模 板 上 ，從 而 提 高 全 酶 的 工 作 能 力 ， 3 5 核 酸 外 切 酶 活性 位 于 亞 基 。 聚 合 酶 全 酶 形 成 一 個(gè) 對 稱 的 二 聚體 。 這 種 結(jié) 構(gòu) 使 復(fù) 制 的 先 導(dǎo) 鏈 及 后 隨 鏈 在 全 酶 上 同時(shí) 、 同 方 向 合 成 。 真 核 生 物 的 DNA聚 合 酶n 真 核 生 物 DNA聚 合 酶 現(xiàn) 已 發(fā) 現(xiàn) 至 少 有 5種 ， 分 別 稱 為 DNA-pol 、 、 、

8、、 。n DNA-pol 和 都 是 在 復(fù) 制 延 長 中 起 催 化作 用 。 DNA-pol 則 與 原 核 生 物 的 DNA-pol I相 似 ， 在 復(fù) 制 過 程 中 起 校 讀 、 修 復(fù)和 填 補(bǔ) 缺 口 的 作 用 。n DNA-pol 也 只 是 在 沒 有 其 他 DNA-pol時(shí)才 發(fā) 揮 催 化 功 能 。 10.2.2 DNA分 子 的 拓 撲 學(xué) 變 化 和 相 關(guān) 酶n 10.2.2.1 解 螺 旋 酶n 10.2.2.2 DNA拓 撲 異 構(gòu) 酶n 10.2.2.3 單 鏈 DNA結(jié) 合 蛋 白 10.2.2.1 解 螺 旋 酶n 一 種 稱 為 解 螺 旋

9、 酶 或 解 螺 旋 酶 ， 與隨 后 鏈 的 模 板 DNA結(jié) 合 ， 沿 53方 向運(yùn) 動(dòng) ； 一 種 稱 為 Rep蛋 白 ， 和 前 導(dǎo) 鏈 的模 板 DNA結(jié) 合 ， 沿 35方 向 運(yùn) 動(dòng) 。 10.2.2.2 DNA拓 撲 異 構(gòu) 酶n 原 核 生 物 中 與 復(fù) 制 有 關(guān) 的 主 要 是 DNA拓 撲 異構(gòu) 酶 ， 又 稱 DNA解 旋 酶 （ DNA gyrase） ，發(fā) 揮 作 用 需 ATP水 解 供 能 。n 真 核 生 物 中 Topo 和 均 與 復(fù) 制 有 關(guān) 。Topo 不 需 消 耗 ATP， 其 酪 氨 酸 殘 基 能 與DNA3-磷 酸 基 團(tuán) 形 成

10、共 價(jià) 結(jié) 合 的 中 間 產(chǎn) 物 ，它 能 使 負(fù) 或 正 超 螺 旋 變 為 松 馳 態(tài) 。 Topo 的 存 在 需 要 ATP供 能 ， 它 不 僅 參 與DNA復(fù) 制 ， 還 促 進(jìn) 兩 個(gè) 子 代 分 子 的 分 離 。 10.2.2.3 單 鏈 DNA結(jié) 合 蛋 白n 解 螺 旋 酶 沿 復(fù) 制 叉 方 向 向 前 推 進(jìn) 產(chǎn) 生 了一 段 單 鏈 區(qū) ， 但 是 這 種 單 鏈 DNA不 會 長久 存 在 ， 會 很 快 重 新 配 對 形 成 雙 鏈 DNA或 被 核 酸 酶 降 解 。n SSBP能 很 快 地 和 單 鏈 DNA結(jié) 合 ， 防 止其 重 新 配 對 形 成

11、 雙 鏈 DNA或 被 核 酸 酶 降解 。 10.2.3 引 物 酶 （ Primerase） 所 有 的 DNA 聚 合 酶 都 要 求 一 個(gè) 有 自 由 3 -OH 的 引 物 來 起 始 DNA 的 合 成 。 這 段 RNA 長 5-10 個(gè) 核 苷 酸 ， 由 一 種 特 異 的 RNA 聚 合 酶 合 成 ， 此 酶 稱 為 引 物 酶 。 引 物 及 引 物 酶 的 作 用 ： 這 與 DNA聚 合 酶 的 高 度 忠 實(shí) 性 復(fù) 制 分 不 開 。 已 知 DNA聚 合 酶 具 有 3 5 的 外 切 作 用 以 校對 復(fù) 制 中 的 錯(cuò) 誤 核 苷 酸 。 也 就 是 說

12、 聚 合 酶 在 開 始 形成 一 個(gè) 新 的 磷 酸 二 酯 鍵 前 ， 總 先 要 檢 查 前 一 個(gè) 堿 基是 否 正 確 ， 這 就 決 定 了 它 不 能 從 頭 開 始 合 成 。 因 此 先 合 成 一 段 低 忠 實(shí) 性 的 多 核 苷 酸 來 開 始 DNA 的 合成 ， 并 以 核 糖 核 苷 酸 來 標(biāo) 記 是 “ 暫 時(shí) ” 的 。 這 種 高 度 精 確 的安 排 增 加 了 DNA 復(fù) 制 的 復(fù) 雜 性 ， 卻 保 證 了 復(fù) 制 的 忠 實(shí) 性 。 已知 復(fù) 制 的 誤 差 率 僅 為 十 億 分 之 一 至 百 億 分 之 一 ， 即 復(fù) 制 十 億到 一 百

13、 億 個(gè) 堿 基 才 可 能 出 一 個(gè) 差 錯(cuò) 。 10.2.4 DNA連 接 酶 催 化 兩 條 DNA 單 鏈 連 接 起 來 或 把 單 條 DNA 鏈 閉 合 起 來 。 10.3 以 DNA為 模 板 合 成 DNA的 過 程n 10.3.1 復(fù) 制 的 起 始n 10.3.2 復(fù) 制 的 延 伸n 10.3.3 復(fù) 制 的 終 止 10.3.1 復(fù) 制 的 起 始n （ 1） 4 個(gè) danA 蛋 白 結(jié) 合 與 復(fù) 制原 點(diǎn) （ origin） 上的 danA 蛋 白 結(jié) 合部 位 蛋 白 。 n （ 2） 接 著 danB 和 danC 等 蛋 白 復(fù) 合 物 進(jìn)入 DNA

14、的 熔 解 區(qū) 形 成 前 引 物 化 復(fù) 合 物 。n （ 3） 前 引 物 化 復(fù) 合 物 形 成 后 ， 導(dǎo) 致 模 板 DNA 雙 螺 旋 解 鏈 ， 解 螺 旋 的 DNA部 分 被單 鏈 結(jié) 合 蛋 白 結(jié) 合 ， 保 持 伸 展 狀 態(tài) ， 形 成單 鏈 模 板 。n （ 4） 引 物 合 成 ： 接 著 ， 引 物 酶 也 結(jié) 合 于單 鏈 模 板 上 開 始 合 成 RNA 引 物 。 danA 蛋 白 結(jié) 合 時(shí) 要 求 雙 螺 旋 DNA 必 須 是 負(fù) 超螺 旋 狀 態(tài) ， 識 別 起 始 原 點(diǎn) 的 作 用 。 danB 蛋 白 是 解 螺 旋 酶 ， 它 催 化 由

15、 ATP 推 動(dòng) 的雙 螺 旋 DNA 的 解 鏈 。 10.3.2 復(fù) 制 的 延 伸n 引 物 RNA 合 成 完 成 后 ， DNA聚 合 全酶 進(jìn) 入 已 形 成 的 復(fù) 制 叉 上 ， 它 已 合 成 的引 物 RNA開 始 延 伸 子 鏈 。 在 聚 合 酶 全 酶 的 前 頭 ， 還 有 一 個(gè) rep 蛋 白 ，它 像 起 始 部 位 的 dnaB 蛋 白 一 樣 是 一 個(gè) 解 螺 旋 酶 使 復(fù)制 叉 得 以 推 進(jìn) ， SSB 再 次 保 持 解 鏈 的 DNA 單 鏈 處 于伸 展 狀 態(tài) 而 使 之 起 模 板 作 用 ， DNA 促 旋 酶 則 同 時(shí) 引入 負(fù) 超

16、 螺 旋 ， 以 避 開 拓 撲 學(xué) 上 的 危 機(jī) ， 以 利 聚 合 酶 全 酶 在 兩 條 模 板 不 斷 延 伸 。 先 導(dǎo) 鏈 和 隨 后 鏈 同 時(shí) 同 方 向 合 成 ： 完 整 的 隨 后 鏈 的 形 成 ： 半 保 留 半 不 連 續(xù) 復(fù) 制 ： DNA 復(fù) 制 時(shí) 子 鏈 雙 鏈 中 有 一 條來 源 于 母 鏈 ， 以 DNA 母 鏈 雙 鏈 為模 板 合 成 子 鏈 時(shí) , 其 中 一 條 子 鏈 的合 成 是 不 連 續(xù) 的 , 而 另 一 條 鏈 的 合成 是 連 續(xù) 的 。 10.3.3 復(fù) 制 的 終 止 （ 3） 復(fù) 制 的 終 止 復(fù) 制 具 有 終 止 （

17、 termination） 位 置 。 在 大 腸桿 菌 里 ， 由 于 基 因 組 是 一 環(huán) 型 DNA， 兩 個(gè) 復(fù)制 叉 向 前 推 移 ， 最 后 在 終 止 區(qū) 相 遇 并 停 止 復(fù)制 。 10.4 DNA損 傷 與 修 復(fù)n 10.4.1 DNA的 損 傷n 10.4.2 損 傷 修 復(fù) 系 統(tǒng) 10.4.1 DNA的 損 傷n 某 些 化 學(xué) 、 物 理 的 因 素 可 引 起 細(xì) 胞 DNA 的 損 傷 （ 化 學(xué) 結(jié) 構(gòu) 發(fā) 生 改 變 ） 。 化 學(xué) 因素 種 類 繁 多 ， 機(jī) 制 也 很 復(fù) 雜 ； 物 理 因 素中 紫 外 線 的 作 用 機(jī) 制 研 究 得 比

18、較 清 楚 。例 如 形 成 胸 腺 嘧 啶 二 聚 體 。 此 外 ， DNA 的 損 傷 還 有 堿 基 可 能 改 變 或 丟 失 、 骨 架中 的 磷 酸 二 酯 鍵 可 能 斷 裂 ， 螺 旋 鏈 可 能形 成 交 聯(lián) 等 。 胸 腺 嘧 啶 二 聚 體 : 紫 外 線 引 起 DNA 分 子 中 同 一 條 鏈 上 相 鄰 的 兩 個(gè)嘧 啶 核 苷 酸 以 共 價(jià) 鍵 連 接 生 成 環(huán) 丁 烷 結(jié) 構(gòu) ， 即 嘧 啶二 聚 體 。 最 易 見 的 是 胸 腺 嘧 啶 二 聚 體 。 此 種 二 聚 體 不 能 容納 在 雙 螺 旋 結(jié) 構(gòu) 中 ， 它 不 能 與 互 補(bǔ) 鏈 上

19、的 腺 嘌 呤 形 成 氫 鍵 配對 ， 影 響 DNA 的 復(fù) 制 和 基 因 表 達(dá) 。 胸腺嘧啶二聚體 CC CCCH 3 H NNR OOHHOO RNH N CH 3CC CC 10.4.2 損 傷 修 復(fù) 系 統(tǒng)n 修 復(fù) 作 用 是 一 種 普 遍 的 功 能 。 不 論 物 理因 素 或 化 學(xué) 因 素 所 造 成 的 損 傷 ， 只 要 DNA 結(jié) 構(gòu) 發(fā) 生 改 變 ， 就 能 被 修 復(fù) 酶 識 別 ，而 把 不 正 常 的 部 分 切 除 。 修 復(fù) 對 保 護(hù) DNA 的 正 常 功 能 是 非 常 重 要 的 。n 修 復(fù) 作 用 包 括 光 誘 導(dǎo) 的 修 復(fù) （

20、 光 修 復(fù) ）和 不 依 賴 光 的 修 復(fù) （ 暗 修 復(fù) ） ， 在 高 等動(dòng) 物 體 內(nèi) 暗 修 復(fù) 代 替 了 光 修 復(fù) 。 （ 1） 光 修 復(fù) 光 修 復(fù) 也 稱 光 復(fù) 活 ， 它 是 由 可 見 光 （ 300nm-400nm） 激 活 光 復(fù) 活 酶 ， 該 酶 能 分 解 胸 腺 嘧 啶 二聚 體 。 已 從 細(xì) 菌 和 一 些 動(dòng) 物 的 細(xì) 胞 中 分 裂 出 一 種 光復(fù) 活 酶 。 此 酶 與 DNA形 成 的 復(fù) 合 物 以 一 種 尚 未 了解 的 方 式 吸 收 光 ， 并 利 用 光 能 裂 解 二 聚 體 中 的 環(huán)丁 基 的 C-C鍵 ， 以 達(dá) 到

21、 復(fù) 活 胸 腺 嘧 啶 。 哺 乳 動(dòng) 物和 人 體 內(nèi) 缺 乏 此 酶 。 （ 2） 暗 修 復(fù) : 暗 修 復(fù) 通 過 三 種 不 同 的 機(jī) 理 來 完 成 修 復(fù) ： （ 1） 切 除 修 復(fù) （ excison repair） （ 2） 重 組 修 復(fù) （ recombinational repair） （ 3） SOS 修 復(fù) （ SOS repair） （ 1） 切 除 修 復(fù) 紫外特異核酸內(nèi)切酶的切斷作用DNA聚合酶合成DNA作用 DNA聚合酶35 切割作用 連接作用 5 33 5 DNA連接酶DNA中含胸腺嘧啶二聚體區(qū)的修復(fù) 胸腺嘧啶二聚體 新DNA區(qū); 重組修復(fù)的過程再合

22、成 重組復(fù)制 （ 2） 重 組 修 復(fù) 重 組 修 復(fù) 是 一 種 復(fù) 制后 修 復(fù) 。 重 組 修 復(fù) 的 結(jié) 果 是 親代 鏈 上 的 嘧 啶 二 聚 體 并 未消 除 ， 但 這 一 條 DNA 鏈卻 逐 漸 被 稀 釋 ， 最 后 對 正常 生 理 過 程 沒 有 影 響 ， 損傷 也 就 得 到 了 修 復(fù) 。 （ 3） SOS修 復(fù) 這 種 修 復(fù) 是 允 許 子 鏈 DNA 復(fù) 制 合 成 時(shí) 越 過親 鏈 上 受 損 傷 的 片 段 而 不 形 成 缺 口 ， 這 種 修 復(fù) 以犧 牲 復(fù) 制 的 忠 實(shí) 性 為 代 價(jià) 。 重組修復(fù)的過程 再合成 重組 復(fù)制 10.5 以 R

23、NA為 模 板 合 成 DNA的 過 程n 20 世 紀(jì) 70 年 代 從 一 些 含 RNA 的 腫瘤 病 毒 如 鳥 類 成 髓 細(xì) 胞 白 血 病 病 毒 和 勞 氏 肉 瘤 病 毒 中 分 離 到 一 種 獨(dú) 特的 RNA 指 導(dǎo) 的 RNA 聚 合 酶（ RNA-directed DNA polymerase） ，由 于 它 以 RNA 為 模 板 合 成 DNA，故 此 稱 為 反 轉(zhuǎn) 錄 酶 （ reverse transcriptase） 。 反 轉(zhuǎn) 錄 酶 ： 反 轉(zhuǎn) 錄 酶 以 病 毒 RNA 為 模 板 ， 在 引 物 參 與 下 以 四 種 dNTP 為 底 物 像 D

24、NA 聚 合 酶 一 樣 ， 按 5 3 方 向 催 化 合成 一 條 與 模 板 RNA 互 補(bǔ) DNA 鏈 ， 形 成 RNA-DNA 雜 交 鏈 ，其 中 的 DNA鏈 稱 為 互 補(bǔ) DNA 鏈 （ cDNA ） 。 這 時(shí) RNA 被降 解 ， 然 后 再 以 新 合 成 的 DNA 鏈 為 模 板 ， 合 成 另 一 條 互 補(bǔ)的 DNA 鏈 ， 形 成 雙 鏈 的 DNA 分 子 。 新 合 成 的 雙 鏈 DNA 分 子 可 以 進(jìn) 入 宿 主 細(xì) 胞 核 ， 并 整 合 到宿 主 的 DNA 中 ， 隨 宿 主 DNA 一 起 復(fù) 制 傳 遞 給 子 代 細(xì) 胞 。 在某 些

25、 條 件 下 此 潛 伏 的 DNA 可 以 活 躍 起 來 轉(zhuǎn) 錄 出 病 毒 RNA 而使 病 毒 繁 殖 。 在 另 外 一 些 條 件 下 它 也 可 以 引 起 宿 主 細(xì) 胞 發(fā) 生癌 變 。 PCR 2 0世 紀(jì) 80 年 代 末 發(fā) 展 起 來 的 一 種 的 DNA 特 定 片 段 體 外 快 速 合 成 擴(kuò) 增 的 方法 。 稱 多 聚 酶 鏈 式 反 應(yīng) （ PCR，Polymerase chain reaction） PCR 反 應(yīng) 的 步 驟 : 在 微 量 離 心 管 中 ， 加 入 適 量 的 緩 沖 液 ， 微 量 的 模 板 DNA，人 工 合 成 的 兩 個(gè)

26、 DNA 引 物 ， 四 種 脫 氧 單 核 苷 酸 （ dNTP ） ，一 種 耐 熱 的 多 聚 酶 和 Mg 2+。 高 溫 變 性 ： 將 上 述 溶 液 加 熱 ， 使 模 板 DNA 在 高 溫 下 變 性 ，雙 鏈 解 開 為 兩 條 單 鏈 （ 如 95 ） ； 低 溫 退 火 ： 然 后 降 低 反 應(yīng) 溫 度 ， 使 兩 條 引 物 在 低 溫 下 分 別 與兩 條 模 板 互 補(bǔ) 退 火 ， 形 成 局 部 雙 鏈 （ 37 -65 ） ； 中 溫 延 伸 ： 再 升 高 反 應(yīng) 溫 度 至 中 溫 （ 72 ） ， 此 時(shí) 多 聚 酶 以 dNTP 為 原 料 ， 以 兩 引 物 為 復(fù) 制 的 起 點(diǎn) ， 在 兩 條 模 板 上 合 成新 的 DNA 子 鏈 。 如 此 重 復(fù) 改 變 反 應(yīng) 溫 度 ， 即 高 溫 變 性 、 低 溫 退 火 和 中 溫 延 伸三 個(gè) 階 段 ， DNA 片 段 幾 何 級 數(shù) 擴(kuò) 增 下 去 。