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2、液和組織。主要包括血液、尿液、唾液。最為常用的樣本是血液。,采集時(shí)間：,根據(jù)臨床治療藥物監(jiān)測的不同目的確定。,目的,取樣時(shí)間,確定、調(diào)整用藥方案,用藥穩(wěn)態(tài)后,臨床治療藥物檢測,用藥穩(wěn)態(tài)后,急性藥物中毒診斷,用藥后立即,藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué),給藥前、給藥后多時(shí)間點(diǎn),一,.,血樣（,全血,-Whole blood,血漿,-Plasma,血清,-Serum,）,血樣采集：患者（靜脈），動(dòng)物實(shí)驗(yàn)（動(dòng)脈、心臟）。,全血采集：采集后放置于含抗凝劑（,肝素,、,乙二胺四乙酸,EDTA,、,草酸鹽,、,枸緣酸鹽,）的試管中，混合均勻即得。,血漿,的制備：全血抗凝劑試管混合,1000 xg,力,離心,5100min,
3、上清液,即為血漿。,血清的制備：全血室溫,放置,0.51h,凝固出現(xiàn)血餅,600 xg,力,離心,5,10min,上清液,即為血清。,注意事項(xiàng),血樣采集后應(yīng)及時(shí)分離,血漿,和,血清,，最好,立即分析,。,全血：血液于抗凝管中，冷凍儲(chǔ)存或直接分析。短期,4,，長期,-,20,或,-80,保存。,二,.,尿樣,尿液測定用途：藥物劑量回收研究、藥物尿清除率、生物利用度、判斷患者用藥是否遵醫(yī)囑、,預(yù)測藥物的代謝過程和代謝類型,。,尿藥濃度,改變不直接反映,血藥濃度,，受試者腎功能將影響藥物的排泄，所以尿液樣品的采集和測定應(yīng)當(dāng)與腎功能指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。,尿液的,分類,：隨時(shí)尿、晨尿、白天尿、夜間尿、時(shí)間
4、尿。,尿液的采集（,自然排尿,）：,測定尿液中藥物濃度時(shí)應(yīng)采用,時(shí)間尿,。,測定尿液中藥物的總量時(shí)，應(yīng)收集用藥后一定時(shí)間內(nèi)的,全部尿液,，進(jìn)行分析。,尿液的處理方法：,處理：采集后應(yīng)立即測定。,保存：低溫保存，或加入,防腐劑,（鹽酸、二甲苯、三氯甲烷等）。,三,.,唾液,唾液：腮腺、頜下腺、舌下腺和口腔黏膜腺體分泌的黏液在口腔里混合而成的,消化液,。,采集：安靜狀態(tài)，,漱口,后,15min,進(jìn)行，,采集時(shí)間為,10min,，采用一些物理或化學(xué)方法刺激唾液分泌。,保存與處理：取樣后，,除去泡沫,，用,1000 xg,力,離心,10min,，取,上清液,，凍存或直接分析。唾液采集后在,4,下保存，
5、往往需要在取樣時(shí),測定,pH,值。,第二節(jié) 體內(nèi)樣品處理,目的：不破壞測定成分的前提下，用適當(dāng)?shù)姆椒?分離純化或濃縮待測藥物,，以減少干擾、提高檢測靈敏度和特異性、降低對儀器的污染和損害。,常用方法：,去除蛋白質(zhì)法,綴合物水解法,分離純化與濃集法,化學(xué)衍生化法,影響因素：,樣品種類,、,被測藥物的性質(zhì),、,濃度,、,測定方法的選擇,。,樣品種類：如血漿或血清需要清除蛋白，使藥物從蛋白結(jié)合物中釋出；尿液樣品則常采用酸或酶水解使藥物從綴合物中釋出；唾液樣品主要采用離心去除黏蛋白沉淀。,測定方法：測定方法的耐受污染程度和抗干擾能力越強(qiáng)、專屬性越好、靈敏度越高，則對前處理的要求越低。,一,.,去除蛋白
6、法：,蛋白沉淀法,和,蛋白分解法,1.,蛋白沉淀法：加入有機(jī)溶劑、強(qiáng)酸和無機(jī)鹽,加入與水混溶的有機(jī)溶劑,原理,:,水溶性的有機(jī)溶劑可使蛋白質(zhì)分子內(nèi)及分子間的,氫鍵變化,，,使蛋白質(zhì)凝聚,，進(jìn)而使與之結(jié)合的藥物釋放。,常用有機(jī)溶劑,:,乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氫呋喃,體積比：,1,：,1,3,90,去除,方法：超速離心（,10000r/min,）,實(shí)例,:,乙腈,沉淀蛋白質(zhì)為,絮狀,，易于離心去除；,甲醇,沉淀蛋白則為,細(xì)小顆粒狀,，需高速離心去除。使用乙腈或甲醇時(shí)上清液,pH,為,8.59.5,，使用丙酮時(shí)上清液,pH,為,910,。,加入強(qiáng)酸,原理：當(dāng)溶液,pH,低于,蛋白質(zhì)的,等電
7、點(diǎn),時(shí)，蛋白質(zhì)以,陽離子,形式存在，可與酸根陰離子形成,不溶性鹽,而沉淀。,常用強(qiáng)酸：,10,三氯醋酸、,6,高氯酸、硫酸鎢酸混合液、,5,偏磷酸,體積比：,1,：,0.4,，,90,去除,所得上清液呈強(qiáng)酸性（,pH04,）。,加入無機(jī)鹽,原理：加入無機(jī)鹽后，溶液的,離子強(qiáng)度,發(fā)生變化，,抑制蛋白質(zhì)解離,，無機(jī)鹽具有比蛋白質(zhì)更強(qiáng)的,親水性和電解能力,，使蛋白質(zhì),鹽析脫水,而沉淀。,常用中性鹽：飽和硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽、磷酸鹽、枸櫞酸鹽,比例：,1,：,2,混合，,90,去除,方法：超速離心（,10000r/min,）,所得上清液近中性，,pH,為,7.07.7,。,2.,蛋白分解法,原理：在測
8、定某些與蛋白結(jié)合牢固、且對酸不穩(wěn)定的藥物時(shí)，常需用,酶解法,使蛋白分解而釋放出藥物。,枯草菌溶素,不僅可使組織酶解，且可使藥物析出。,應(yīng)用：主要用于臟器組織中藥物的測定。,二,.,綴合物水解法：,酸水解法和酶水解法,1.,酸水解法,：使用無機(jī)酸如鹽酸、磷酸,特點(diǎn)：簡單、快速、專屬性差,2.,酶水解法,：常用,葡萄糖酸酐酶或硫酸酯酶,，或者二者的混合物,用時(shí)應(yīng)按不同酶的要求控制條件、,PH,值在,4.5-7.0,，,37,培育數(shù)十小時(shí)，進(jìn)行水解。,如果,尿液,在采用酶水解，應(yīng)先除去尿中能抵制酶的,陽離子,。,特點(diǎn)：,高選擇性,，,專屬性強(qiáng),，,低降解性,，酶水解比酸水解溫和，一般不會(huì)引起被測物分
9、解，,缺點(diǎn)：水解時(shí)間稍長，費(fèi)用大，酶制劑可能引進(jìn)粘液蛋白，易引起乳化或色譜柱阻塞。,應(yīng)用范圍：,遇酸及受熱不穩(wěn)定的藥物,三,.,分離純化與濃集法：,萃取法,1.,液,-,液提取法（,LLE,）,關(guān)鍵要考慮三個(gè)方面的因素：,有機(jī)溶劑的特性,有機(jī)溶劑相和水相的體積,水相的,pH,值,優(yōu)點(diǎn)：簡單，選擇性好，去除內(nèi)源性物質(zhì)干擾能力強(qiáng)，應(yīng)用廣泛。,2.,固相萃?。?SPE,）,原理：將具有,吸附,、,分配,或,離子,交換性質(zhì)的大比表面積吸附填料作為萃取劑填成小柱，,柱色譜分離方法,。,決定因素：藥物與固定相表面的,活性基團(tuán),、藥物與溶劑分子間的,分子間作用力,。,優(yōu)點(diǎn),：引入的雜質(zhì)少；可以完全避免乳化的
10、形成；有較高的萃取回收率，重現(xiàn)性好；小柱可棄，沒有污染；需要的樣品量少；洗脫溶劑多為水溶性的，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)。,缺點(diǎn),：價(jià)格昂貴，技術(shù)要求高，小柱各批之間有差異，柱子容易堵塞，影響分離效果。,四,.,化學(xué)衍生化法,1.,目的：,改變待測藥物的色譜行為；增強(qiáng)藥物的穩(wěn)定性；改善（手性拆分）分離能力；提高檢測靈敏度。,2.,GC,法,硅烷化法（應(yīng)用最廣）,硅烷化,：與葡萄糖醛酸結(jié)合的藥物,烷基化,：有活性氫原子的藥物,?；?：具有,-NH,2,、,-OH,的藥物,3.,HPLC,法,柱前衍生化法、柱后衍生化法,柱前衍生化法,：分離前使藥物與衍生化試劑發(fā)生反應(yīng)。,柱后衍生化法,：藥物經(jīng)色譜分離后在流出液
11、中進(jìn)行衍生化。一般用紫外檢測器,第三節(jié) 體內(nèi)樣品的測定,一,.,體內(nèi)樣品測定的常用方法,免疫分析法,:,色譜分析法,:,測定方法,免疫分析法,色譜分析法,靈敏度,+,+,專屬性,+,+,適用范圍,臨床治療藥物監(jiān)測,藥代動(dòng)力學(xué)研究,1.,免疫分析法,(Immunoassay,，,IA,),原理：,特異性抗原,-,抗體反應(yīng),為基礎(chǔ),應(yīng)用：,測定生物利用度和藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)等重要數(shù)據(jù)。,監(jiān)測藥物血液濃度。,快速測定有效組分的含量。,對藥品中是否存在特定的微量有害雜質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。,2.,色譜分析法：,GC/HPLC/GC-MS,二,.,定量分析方法驗(yàn)證,1.,體內(nèi)樣品定量分析方法驗(yàn)證的指標(biāo)：,特異性,
12、標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍,定量下限,精密度與準(zhǔn)確度,樣品穩(wěn)定性,提取回收率,質(zhì)控樣品與質(zhì)量控制,2.,特異性,定義：必須證明所測定的物質(zhì)是,原型藥物,或者,特定活性代謝物,。,要求：,6,個(gè)不同來源的空白體內(nèi)樣品色譜圖、空白體內(nèi)樣品外加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖以及用藥后的體內(nèi)樣品色譜圖。,3.,標(biāo)準(zhǔn)曲線（,standard curve,）,定義：生物樣品中所測定藥物濃度與響應(yīng)的相關(guān)性（,比例的程度,）,要求：,至少,6,個(gè)濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,應(yīng)使用與待測樣品相同的生物介質(zhì),通常用,線性回歸方程,來評(píng)價(jià),4.,線性范圍（,linear rang,）,定義：標(biāo)準(zhǔn)曲線的,最高與最低濃度的區(qū)間,要求：,至少含,6,個(gè)濃
13、度點(diǎn),(,不包括空白點(diǎn),),可覆蓋,全部,待測生物樣品中的,藥物濃度,偏差,%,（回歸值標(biāo)示值）標(biāo)示值,100%,5.,定量下限,定義：標(biāo)準(zhǔn)曲線上的,最低濃度點(diǎn),要求：,S/N,應(yīng)大于,5,滿足測定,3,5,個(gè)消除半衰期后生物樣品中的藥物濃度是,C,max,的,10,5,至少,5,個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品測試結(jié)果證明。,精密度與準(zhǔn)確度,樣品選擇：,3,個(gè)濃度，低濃度為定量下限,3,倍以內(nèi)，高濃度接近標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限附近，中間選一個(gè)濃度。每一濃度每批至少測定,5,個(gè)樣品。,精密度：批內(nèi)、批間精密度。,RSD,15%,，最低定量限附近,20%,。,準(zhǔn)確度：相對回收率表示。,在,85115%,，最低定量限附近在,8
14、0120%,。,7.,樣品穩(wěn)定性,定義：一種分析物在確定條件下，一定時(shí)間內(nèi)在一定介質(zhì)中的,化學(xué)穩(wěn)定性,。,要求：對含藥生物樣品再,室溫、冷凍或凍融條件下以及不同存放時(shí)間,進(jìn)行穩(wěn)定性考察。,8.,提取回收率,定義：反映出樣品預(yù)處理過程中,組分丟失,的情況，是評(píng)價(jià)萃取,方案優(yōu)劣,的指標(biāo)之一，以樣品提取和處理過程前后分析物含量百分比表示。,要求：考察高、中、低,3,個(gè)濃度的提取回收率，其值一般,低于,100%,（可能低至,60%,），但重要的是,重現(xiàn)性好,。,9.,質(zhì)控樣品：將已知量的待測藥物加入到生物介質(zhì)中配制的樣品，用于質(zhì)量控制。,10.,質(zhì)量控制：每個(gè)分析批均應(yīng)建立相應(yīng),標(biāo)準(zhǔn)曲線,，并隨行測定
15、高、中、低,3,個(gè)濃度的質(zhì)控樣品。,要求：,6,個(gè),QC,樣品中至少,4,個(gè)的測定結(jié)果的準(zhǔn)確度在各自正常濃度,80,120,，,RSD 20%,，允許由,2,個(gè),QC,樣品超出各自的,20,。,三,.,應(yīng)用,治療藥物監(jiān)測（,Therapeutic Drug Monitoring,TDM,）,監(jiān)測對象：治療安全濃度范圍窄、治療劑量與中毒劑量相近、毒副作用強(qiáng)、具有非線性藥代動(dòng)力學(xué)特征、長期使用藥效和毒性不明確、以及聯(lián)合用藥可能發(fā)生相互作用的藥物。,2.,在藥代動(dòng)力學(xué)研究中的應(yīng)用,例如：地高辛的藥代動(dòng)力學(xué)研究，以毛地黃毒苷為內(nèi)標(biāo)，用,LC-MS,測定人血漿和尿液中地高辛濃度。,本章小結(jié),1.,體內(nèi)樣
16、品種類：,血樣、尿樣和唾液的采集和處理方法,。,2.,體內(nèi)樣品處理的常用方法：,去除蛋白質(zhì)法、綴合物水解法、萃取分離法、化學(xué)衍生化法的基本原理、優(yōu)缺點(diǎn)和應(yīng)用范圍,。,3.,體內(nèi)樣品測定：,常用方法的基本原理、驗(yàn)證指標(biāo)以應(yīng)用,。,習(xí)題,1.TDM,的意思是指（）,A,、臨床監(jiān)護(hù),B,、種藥物代謝酶,C,、相對標(biāo)準(zhǔn)差,D,、治療藥物監(jiān),2.,從機(jī)體采集的血液加抗凝劑經(jīng)離心后得到的上層清液稱為（）,A,、血漿,B,、血清,C,、血球,D,、血樣,3.,血樣的長期冷凍貯存是指（）,A,、,4,8 B,、,-20,以下,C,、,-18,以下,D,、,0,4,4.,表示生物介質(zhì)中藥物最低可測濃度的是（）,A,、線性范圍,B,、定量下限,C,、檢測限,D,、可信限,5.,尿樣的采集一般為（）,A,、服藥后,8h B,、服藥后,2,12h C,、服藥后,24h D,、服藥后一定時(shí)間內(nèi)總量,第七章,完,謝謝觀看,/,歡迎下載,BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK
14內(nèi)藥物分析法 (2)
