2019-2020年高中生物《血紅蛋白的提取和分離》教案1 新人教版選修2.doc
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2019-2020年高中生物《血紅蛋白的提取和分離》教案1 新人教版選修2 教學目標: 1、嘗試從血液中提取和分離血紅蛋白 2、了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理 教學重點:凝膠色譜法的原理和方法 教學難點:樣品的預處理;色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填 教學過程: (一)引入新課 蛋白質是生命活動的主要承擔者,是細胞內含量最高的有機化合物。對蛋白質的研究有助于人們對生命過程的認識和理解。所以需要從細胞中提取蛋白質進行研究。怎樣提取蛋白質呢? (二)進行新課 1.基礎知識 蛋白質的物化理性質:形狀、大小、電荷性質和多少、溶解度、吸附性質、親和力等千差萬別,由此提取和分離各種蛋白質。 1.1凝膠色譜法(分配色譜法): (1)原理:(見課件圖) 分子量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙,路程短,流動快;分子量小的分子穿過多孔凝膠顆粒內部,路程長,流動慢。 (2)凝膠材料:多孔性,多糖類化合物,如葡聚糖、瓊脂糖。 (3)分離過程: 混合物上柱→洗脫→大分子流動快、小分子流動慢→收集大分子→收集小分子 *洗脫:從色譜柱上端不斷注入緩沖液,促使蛋白質分子的差速流動。 1.2緩沖溶液 (1)原理:由弱酸和相應的強堿弱酸鹽組成(如H2CO3-NaHCO3,HC-NaC,NaH2PO4/Na2HPO4等),調節(jié)酸和鹽的用量,可配制不同pH的緩沖液。 (2)緩沖液作用:抵制外界酸、堿對溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定。 1.3凝膠電泳法: (1)原理:不同蛋白質的帶電性質、電量、形狀和大小不同,在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同,導致不同蛋白質在電場中的運動方向和運動速度不同。 [思考]閱讀投影補充材料后,填寫下表: 決定運動方向 形成庫侖力 形成阻力 決定運動速率 電荷性質 √ 電荷量 √ √ 分子形狀 √ √ 分子大小 √ √ (2)分離方法:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺經膠電泳等。 (3)分離過程:在一定pH下,使蛋白質基團帶上正電或負電;加入帶負電荷多的SDS,形成“蛋白質-SDS復合物”,使蛋白質遷移速率僅取決于分子大小。 2.實驗設計 2.1蛋白質的提取和分離一般分為哪些基本步驟? 樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定。 思考:是否所有種類的蛋白質的提取和分離都是這樣的?為什么? 不是。因為蛋白質的來源和性質不同,分離方法差別很大。 2.2選擇實驗材料 (1)你認為鳥類血液和哺乳動物血液中,最好哪種血液來提取血紅蛋白?為什么? 哺乳動物血液。因為該細胞中沒有細胞核,血紅蛋白含量高。 (2)請閱讀投影資料,認識哺乳動物血液組成及血紅蛋白性質。并思考回答下列問題: 血液由 和 兩部分組成。 血細胞中 細胞數(shù)量最多,細胞的含量最高的化合物是 。 該化合物是由 和 構成的,其中每個亞基中都含有一個能與O2和CO2結合的 基團。 2.3從紅細胞中分離出血紅蛋白的過程為:洗滌紅細胞、釋放血紅蛋白、分離血紅蛋白、透析。洗滌紅細胞的目的是什么? 除去血漿蛋白的雜蛋白,有利于后續(xù)步驟的分離純化。 紅細胞的洗滌過程為 血液+檸檬酸鈉→低速短時離心→吸出上層血漿→紅細胞+5倍體積生理鹽水 →緩慢攪拌10min→低速短時離心→吸出上清液→反復洗滌直至上清液無黃色 思考:加入檸檬酸鈉有何目的?為什么要低速、短時離心?為什么要緩慢攪拌? 防止血液凝固;防止白細胞沉淀;防止紅細胞破裂釋放出血紅蛋白。 思考:你有什么方法將紅細胞中的血紅蛋白釋放出來? 加入蒸餾水,用玻璃棒快速攪拌一段時間。 補充:加入蒸餾水后紅細胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目的是溶解細胞膜,有利于血紅蛋白的釋放和分離。此時,紅細胞破碎混合液中不僅含有血紅蛋白,而且還含有細胞破碎物、脂質、甲苯有機溶劑等。怎樣除去這些雜質呢?由于它們的密度不同,科學家采取了離心分離的方法: 紅細胞破碎混合液→中速長時離心(2000c/min10min)→濾紙過濾除去脂質→分液漏斗分離出血紅蛋白 2.4如何除無機鹽離子和小分子有機物質呢?。 透析。半透膜的選擇透過性,大分子物質不能通過半透膜,離子和小分子能夠通過半透膜。 在透析過程中,血紅蛋白溶液中的離子和小分子不斷通過半透膜擴散進入到pH=7的磷酸緩沖液中。 思考:為何使用pH=7的磷酸緩沖液?為什么緩沖液量遠多于血紅蛋白溶液量? 維持血紅蛋白的正常特性。有利于雜質分子充分地向外擴散。 總結:通過以上四個基本過程,紅細胞中的血紅蛋白就被提取出來。但其中還含有其他種類的蛋白質分子(如呼吸酶等)。怎樣將雜蛋白與血紅蛋白分離開來呢?我們來研究蛋白質提取和分離的第二個步驟――粗分離(凝膠色譜操作)。 2.5凝膠色譜分離蛋白質包括:制作色譜柱、裝填色譜柱、樣品加入和洗脫。 根據(jù)教材圖5-19,說出制作色譜柱需要的材料。 橡皮塞2個、打孔器、小刀、移液管、尼龍紗、尼龍網、玻璃管、尼龍管等。 色譜柱的制作過程:準備材料→加工橡皮塞→安裝色譜柱 下面進行第二步――凝膠色譜柱的裝填。請閱讀教材: 色譜柱的裝填過程。 步驟 操作要求 ① 操作要求 色譜柱垂直固定在支架上 ② 計算稱量凝膠 根據(jù)色譜柱體積計算凝膠用量 ③ 配制懸浮液 凝膠顆粒+蒸餾水→充分溶脹 凝膠顆粒+洗脫液→沸水浴 ④ 裝填懸浮液 一次性緩慢倒入;輕輕敲打 ⑤ 緩沖液洗滌平衡 立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h 樣品加入和洗脫。其基本過程是: 調節(jié)緩沖液面→加入蛋白質樣品→調節(jié)緩沖液面→洗脫→收集分裝蛋白質 至此,血紅蛋白即可得到粗分離。在整個操作過程中,應當注意以下事項: (1)紅細胞的洗滌:洗滌次數(shù)不能過少;低速、短時離心。 (2)凝膠的預處理:沸水浴法時間短,還能除去微生物和氣泡 (3)色譜柱的裝填:裝填盡量緊密,降低顆粒間隙;無氣泡;洗脫液不能斷流。 (4)色譜柱成功標志:紅色區(qū)帶均勻一致地移動。 (三)課堂總結、點評 血 紅 蛋 白 的 取 和 分 離 凝膠色譜法 原 理 分離過程 凝膠電泳法 緩沖溶液 組 成 作 用 蛋白質的 提取分離 樣品處理 粗 分 離 純 化 純度鑒定 血 紅 蛋 白 的 提 取 和 離 蛋白質分子的差異性 蛋白質分子的差異性 凝膠色譜法 原 理 分離過程 凝膠電泳法 凝膠色譜法 原 理 分離過程 凝膠電泳法 緩沖溶液 組 成 作 用 緩沖溶液 組 成 作 用 蛋白質的 提取分離 樣品處理 粗 分 離 純 化 純度鑒定 蛋白質的 提取分離 樣品處理 粗 分 離 純 化 純度鑒定 (四)實例探究 例1 利用凝膠色譜法,什么樣的蛋白質先洗脫出來( ) A.相對分子質量大的 B.溶解度高的 C.相對分子量小的 D.所代電荷多的 解析:凝集色譜法使根據(jù)相對分子質量的大小分離蛋白質的有效方法。相對分子質量較小的蛋白質能進入凝膠內部通道,路程較長,移動速度較慢;相對分子質量大的蛋白質,路程較短,移動速度較快,首先洗脫出來。 答案:A 例2 蛋白質提取和分離分為哪幾步( ) A.樣品處理、凝膠色譜操作、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 B.樣品處理、凝膠色譜操作、純化 C.樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定 D.樣品處理、純化、粗分離、純度鑒定 解析:蛋白質的提取和分離分為樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定四步。A中凝膠色譜操作及SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳為實驗操作過程中的技術 答案:C ☆綜合應用 例3用凝膠色譜法分離蛋白質時,分子量大的蛋白質( ) A路程較長,移動速度較慢 B路程較長,移動速度較快 C路程較短,移動速度較慢 D路程較短,移動速度較快 解析:在小球體內部有許多貫穿的通道,當相對分子質量不同的蛋白質通過凝膠時,相對分子質量較小的蛋白質容易進入凝膠內部的通道,路程較長,移動速度較慢;而相對分子質量較大的蛋白質無法進入凝膠內部的通道,只能在凝膠外部移動,路程較短,移動速度較快。 答案:D (五)鞏固練習 1. 凝膠色譜法分離蛋白質的依據(jù)是( ) A. 對其他分子的親和力 B. 溶解度 C. 所帶電荷多少 D. 相對分子質量的大小 2. 凝膠色譜法中所用的凝膠化學本質大多是( ) A. 糖類化合物 B. 脂質 C. 蛋白質 D. 核酸 3. 選用紅細胞作為分離蛋白質的實驗材料,有何好處( ) A. 血紅蛋白是有色蛋白 B. 紅細胞無細胞核 C. 紅細胞蛋白質含量高 D. 紅細胞DNA含量高 4. 將攪拌好的混合液離心來分離血紅蛋白溶液時,第二層是( ) A. 甲苯 B. 血紅蛋白水溶液 C. 脂溶性物質的沉淀層 D. 其他雜質的沉淀 5. 血紅蛋白因含有( )而呈紅色 A. O2 B. CO C. CO2 D.血紅素 6. 下列操作正確的是( ) A. 分離紅細胞時采用低速長時間離心 B. 紅細胞釋放出血紅蛋白只需要加入蒸餾水就可 C. 分離血紅蛋白溶液是低速短時間離心 D. 透析時要用20mmol/l的磷酸緩沖液,透析12h 7. 樣品的加入和洗脫的敘述正確的是( ) A. 先加入1ml透析后的樣品 B. 加樣前要使緩沖液緩慢下降全部流出 C. 如果紅色帶均勻一致的移動,說明色譜柱制作成功 D. 洗脫時可以用緩沖液也可以用清水 8. 下列有關提取和分離血紅蛋白的程度敘述錯誤的是( ) A. 樣品的處理就是通過一系列操作收集到血紅蛋白溶液 B. 通過透析可以去除樣品中分子質量較大的雜質,此為樣品的粗提取 C. 可通過凝膠色譜法將相對分子質量大的雜質蛋白除去,即樣品的純化 D. 可通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白的純度 9. 凝膠色譜法操作正確的是( ) A. 將橡皮塞上部用刀切出鍋底狀的凹穴 B. 將橡皮塞下部切出凹穴 C. 插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面 D. 將尼龍網剪成與橡皮塞下部一樣大小的圓片 10. 樣品的加入和洗脫的操作不正確的是( ) A. 加樣前,打開色譜柱下端的流出口,使柱內凝膠面上的緩沖液緩慢下降到凝膠面的下面 B. 加樣后,打開下端出口,使樣品滲入凝膠床內 C. 等樣品完全進入凝膠層后,關閉下端出口 D. 用吸管小心的將1ml透析后的樣品加到色譜柱的頂端,不要破壞凝膠面 ★教后小記 本課題重在讓學生了解生物科學在蛋白質領域的進展,說明提取、分離高純度的蛋白質的重要性和必要性,并學習一些蛋白質分離和提取的基本技術??梢园l(fā)揮學生的主動性,讓學生介紹當前有關蛋白質研究的新進展,激發(fā)學生的學習興趣,然后指出本課題的學習意義,讓學生初步體會分離純化蛋白質的過程和方法。- 配套講稿:
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