【基金標書】2010CB912600-內(nèi)源性代謝產(chǎn)物硫化氫與介導心臟生理與病理機制的蛋白質(zhì)靶分子的相互作用及其機制

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項目名稱： 內(nèi)源性代謝產(chǎn)物硫化氫與介導心臟生理與病理機制的蛋白質(zhì)靶分子的相互作用及其機制首席科學家： 朱依諄 復旦大學起止年限： 2010 年 1 月-2014 年 8 月依托部門： 教育部 上海市科委一、研究內(nèi)容綜合應用代謝組學、基因組學、蛋白質(zhì)組學、結(jié)構(gòu)生物學等方法和技術(shù)，以重要的心血管生理和病理調(diào)控通路為研究主要對象，研究硫 化 氫 與蛋白 質(zhì)靶分子的相互作用及其機制；研究硫 化 氫 對 蛋白之間、蛋白 質(zhì)和核酸之間相互作用的調(diào)節(jié) 及其機制。 闡明心臟中內(nèi)源性硫 化 氫 在生理和病理情況下的生成代謝途徑，探討硫 化 氫 的分解代謝過程。1. 揭示若干 H2S 調(diào)控跨膜離子轉(zhuǎn)運的重要通路；發(fā)現(xiàn)若干 H2S 直接作用的靶分子；明確H2S 與靶分子蛋白相互作用的分子機制。2. 分離和驗證 H2S 細胞效應相關(guān)的細胞周期，細胞增殖和凋亡過程中信號通路中的重要蛋白因子，結(jié)合基因組學，蛋白質(zhì)組學, 生物化學和分子生物學以及細胞生物學的實驗結(jié)果揭示 H2S 細胞效 應的分子機制和重要蛋白的作用機理和生物學功能。3. 應用獨創(chuàng)的半胱氨酸衍生物 SPRC 可作為分子探針，全面揭示含硫氨基酸體內(nèi)代謝的基本規(guī)律。篩選出與含硫氨基酸及探 針藥物 SPRC 的心肌缺血保護作用密切相關(guān)蛋白分子，并對其功能進行研究，探尋含硫氨基酸及探 針藥物生物學效 應和代謝通路的機體內(nèi)源性拮抗劑和抑制劑，可能是具有臨 床應用前景的防治心血管疾病的新策略。4. 闡明心臟中 CSE 途徑和 ATT/MST 途徑的表達調(diào)控機制及兩條途徑的協(xié)調(diào)機制。闡明CSE 在生理條件和病理條件下表達調(diào)控的實時監(jiān)測和在體研究，同時對闡明 CSE 的調(diào)控網(wǎng)絡也非常重要。闡明 H2S 跨膜傳遞及與氧化性小分子和金屬離子的反應特性。H 2S 的跨膜傳遞關(guān)系到內(nèi)源性 H2S 的作用方式以及外源性 H2S 或 H2S 供體作 為藥物的可行性；與氧化性小分子和與金屬離子的反應特性則與 H2S 的分解代謝相關(guān)。二、預期目標（一）總體目標采用蛋白組學和代謝組學的經(jīng)典研究方法， 結(jié)合心血管疾病的生理和病理 過程，從 細胞水平到整體水平進行動態(tài)研究。以缺血性心 臟病為核心，探討體內(nèi)活性代謝產(chǎn)物小分子氣體信號-H 2S 對心血管系統(tǒng)保護 作用的分子機制，篩選分離出特異的靶蛋白、目標基因和生物標記物；進一步利用結(jié)構(gòu)生物學，生物化學的方法研究蛋白之 間，蛋白和 DNA，RNA 的相互作用機理。全面闡述心臟中內(nèi)源性 H2S 在生理和病理情況下的生成代謝途徑，以及生成的內(nèi)源性 H2S 在細胞內(nèi)和 細胞間的傳遞過程以及傳遞過程中與氧化性小分子（如 NO，H2O2）及金屬離子的相互作用，從而探討 H2S 的分解代謝過程。（二）五年預期目標1. 闡 明 H2S 在 細 胞 水 平 上 的 傳 遞 過 程 ，探 討 H2S 傳 遞 機 制 及 傳 遞 過 程 中 參 與 的 反應 ，如 H2S 對氧化 應激蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的構(gòu)象和正常功能的影響。該工作可能找到體內(nèi) H2S 新的作用靶分子，從而為最終闡明 H2S 對心臟保護作用的機制提供理論依據(jù)；2. 闡明 H2S 傳 遞 機 制 及 傳 遞 過 程 中 蛋白之間，蛋白和 DNA，RNA 的相互作用機理，為在哺乳動物中揭示 H2S 細胞效應的分子機制和闡明 H2S 在生理病理上的作用提供理論依據(jù)；3. 細胞水平和整體水平上研究內(nèi)源性 H2S 產(chǎn)生相關(guān)酶 CSE 在應激條件下（如氧化壓力）和病理狀態(tài)下表達調(diào)控的機理，找到相關(guān) 轉(zhuǎn)錄因子及激活這 些轉(zhuǎn)錄因子的信號通路和相關(guān)蛋白分子，為設計激活體內(nèi)內(nèi)源性 H2S 產(chǎn)生的藥物打下基礎(chǔ)；4. 培養(yǎng)一批國際一流心臟蛋白組學領(lǐng)域科研人員，培養(yǎng)一批高水平的中青年科學家，提高我國蛋白組學科研水平和自主創(chuàng)新能力，增 強國際競爭力。5. 研究成果將以論文形式表現(xiàn)，發(fā)表高水平論文 20~30 篇（其中 5~10 篇 IF>10），申 請10~15 項發(fā)明專利。三、研究方案（一）課題總體思路鑒于目前蛋白質(zhì)組研究比較多地側(cè)重于蛋白質(zhì)表達譜的研究上，對于在重要生理、病理過程中調(diào)控通路的蛋白質(zhì)間的相互作用的研究有待深入研究。此外，蛋白質(zhì)是在有機體內(nèi)發(fā)揮生理功能的；而機體內(nèi)存在著眾多可與蛋白質(zhì)結(jié)合的小分子物質(zhì)，其中包括代謝產(chǎn)物。內(nèi)源性代謝產(chǎn)物可能和蛋白質(zhì)結(jié)合，從而改 變蛋白質(zhì)分子的空 間構(gòu)象和功能。因此，研究內(nèi)源性代謝產(chǎn)物對蛋白質(zhì)組的作用是進一步了解蛋白質(zhì)在活體的功能是至關(guān)重要的，尤其是如能發(fā)現(xiàn)可直接與代謝產(chǎn)物發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)，不但 對 于了解重要的生理、病理 調(diào)節(jié)機制具有重要的科學意義，而且也將有助于蛋白 質(zhì)學的研究更加深入，更有望了解各重要生理、病理過程的機制；有望形成蛋白質(zhì)組學研究的一個分支，即小分子活性物 質(zhì)對蛋白質(zhì)大分子結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)控。H 2S 是最近幾年開始引起國內(nèi)外學術(shù)界注意的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物?？傮w來講國內(nèi)外對該領(lǐng)域的研究尚處于起步階段。通 過本課題的研究，有望分析 H2S 與蛋白質(zhì)之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)相互作用的基本 規(guī)律，揭示 H2S 調(diào)控若干重要心血管生理、病理過程的機制。其研究成果還有望對于蛋白 質(zhì)組學的進一步發(fā)展作出一定的 貢獻。（二）課題的特色和創(chuàng)新點心臟離子通道功能調(diào)節(jié)和血管新生是調(diào)節(jié)心臟生理功能和心臟缺血等疾病的重要調(diào)控通路，本課題組于 2007 年和 2008 年分別發(fā)現(xiàn)了 H2S 對上述兩條心血管通路的調(diào)節(jié)作用。本課題組發(fā)現(xiàn)在心肌細胞中，H 2S 抑制心肌細胞膜 L 型 Ca2+通道的開放；在內(nèi)皮細胞中，H 2S促進細胞增殖、遷移、管腔形成以及在整體模型中的血管新生。但是 H2S 產(chǎn)生生物學效應的機制未被闡明，尤其是 H2S 直接作用的靶分子至今不明。本 項目在前期工作的基礎(chǔ)上， 推定H2S 直接作用的靶分子在心肌細胞是調(diào)控跨膜離子轉(zhuǎn)運的 Ca2+離子通道，或與其相偶連的信號分子；在內(nèi)皮細胞直接作用于 VEGFR2，或 PI3K→Akt→HIF-1→ 生存素信號通路中的信號分子，在此有限范圍中尋 找 H2S 直接作用的靶分子。如能取得成功，對于揭示 H2S 這樣一個小分子物質(zhì)是如何調(diào)控大分子（靶蛋白）的空間構(gòu)象和功能的具有重要的科學意義，可能會發(fā)現(xiàn)一種蛋白功能調(diào)控的新規(guī)律。首次應用代謝組學方法系統(tǒng)研究含硫氨基酸及其衍生物包括：半胱氨酸、甲硫氨酸、SAC、SPRC 等在體內(nèi)的代謝 途徑，包括 H2S 及有關(guān)中間代謝產(chǎn)物。此外，針對缺血、缺氧性心臟疾病，特別是含硫氨基酸及 探針藥物 SPRC 進行生物化學，結(jié)構(gòu)研究和代謝功能的研究，及上述代謝途徑的變化。在此基 礎(chǔ)上， 篩選和優(yōu)化具有治療 前景的可以生成內(nèi)源性 H2S 的化合物，并進行合理的結(jié)構(gòu)改造。項目涉及的領(lǐng)域和技術(shù)非常多，預期在缺血、缺氧性心臟疾病的基礎(chǔ)研究、臨床治療和醫(yī) 藥開發(fā)方面取得突破性進展。首次通過裂殖酵母模式生物的基因組學和蛋白組學重點研究 H2S 對細胞周期，細胞增殖和凋亡過程中信號通路的影響， 結(jié)合用釀酒酵母的突變 體庫的篩選分離出 H2S 細胞效應信號傳導通路中的多個重要蛋白因子，找到這些重要蛋白因子在大鼠心肌 細胞中的同源蛋白，進一步利用結(jié)構(gòu)生物學，生物化學的方法研究蛋白之 間 ，蛋白和 DNA，RNA 的相互作用機理，結(jié)合基因組學和蛋白質(zhì)組 學, 生物化學和分子生物學以及細胞生物學的結(jié)果，揭示H2S 細胞效應的分子機制 ，闡 明 H2S 在生理病理上的作用為新藥設計及許多疾病的治療提供新的思路。通過轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)構(gòu)建攜帶 CSE 啟動子控制的報告基因的 轉(zhuǎn)基因小鼠，從而在整體水平上實現(xiàn)對心臟中內(nèi)源性 H2S 產(chǎn)生相關(guān)酶 CSE 在生理條件和病理條件下表達調(diào)控的實時觀測和在體研究。闡明生理和病理條件下心 臟內(nèi)源性 H2S 產(chǎn)生的調(diào)控機制及調(diào)控網(wǎng)絡，為通過藥物干預心臟內(nèi)源性 H2S 的 產(chǎn)生奠定基礎(chǔ)。 闡明體內(nèi) H2S 的傳遞途徑及其作用的小分子，從而探討 H2S 的分解代謝途徑。利用轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)，實現(xiàn)對 CSE 表達的實時監(jiān)測和在體研究。同時研究心臟內(nèi)源性 H2S 產(chǎn)生的兩條途徑，既 闡明各自的 調(diào)控網(wǎng)絡又研究兩條途徑之間的關(guān)聯(lián)。既研究生理條件下內(nèi)源性 H2S 產(chǎn)生的調(diào)控機制，又強調(diào)缺血、缺氧等病理條件下調(diào)控機制的變化。研究 H2S 與 細胞內(nèi)氧化性小分子和金屬離子的反應特性，探討內(nèi)源性 H2S的分解代謝。（三）課題設置課題 1. 內(nèi)源性代謝產(chǎn)物 H2S 對心臟細胞離子通道和血管新生通路的 調(diào)控機制主要研究內(nèi)容：離子通道和血管新生是與心臟生理、病理疾病密切相關(guān)的兩條重要 調(diào)節(jié)通路。本 課題組首先發(fā)現(xiàn) H2S 可影響上述兩條重要調(diào)控通路，并在前期研究中率先發(fā)現(xiàn) H2S 可抑制心肌細胞膜上 L 型 Ca2+通道的開放；可促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移、形成新的血管。在此基礎(chǔ)上，我們擬深入研究 H2S 調(diào)控 L 型 Ca2+通道與促血管新生的分子機制，確定 H2S 作用的關(guān)鍵靶蛋白，闡明其調(diào)控網(wǎng)絡，為通過 H2S 途徑干預心臟病打下基礎(chǔ)。研究目標：1. 揭示若干 H2S 調(diào)控跨膜離子轉(zhuǎn)運的重要通路，找到若干 H2S 直接作用的靶分子，深入研究 H2S 對其的 調(diào)控機制。2. 找到 H2S 調(diào)控血管新生的直接作用靶點，深入研究 H2S 的調(diào)控血管新生機制。3. 發(fā)現(xiàn) H2S 在不同靶分子蛋白上共同的可結(jié)合的位點或共有的化學修飾方式。課題承擔單位：復旦大學；上海理工大學課題負責人：朱依純 教授課題參加人員：王睿、錢睿哲、付偉、盧寧、蔡文杰、王文 偉經(jīng)費比例：23％課題 2. H2S 對 真核細胞中蛋白質(zhì)表達譜、蛋白 間相互作用以及蛋白與核酸的相互作用的調(diào)控主要研究內(nèi)容：H2S 是最近發(fā)現(xiàn) 的內(nèi)源性信號分子，對細胞具有獨特的調(diào)控作用。本課題以酵母為模式生物，通過基因組學和蛋白組 學的方法， 闡明 H2S 影響細 胞周期、 細胞增殖和細胞凋亡的信號通路，確定 H2S 作用的重要靶分子，繪制一幅完整的 H2S 細胞效應的信號通路圖。將酵母中的研究結(jié)果進一步到心肌細胞加以驗證。該工作有望全面系 統(tǒng)的闡明 H2S 細胞效應的分子機制與調(diào)控網(wǎng)絡，為通過 H2S 途徑干預重大疾病找到新的靶點。研究目標：結(jié)合基因組學和蛋白質(zhì)組學, 生物化學和分子生物學以及細胞生物學的結(jié)果在裂殖酵母中繪制一幅完整的 H2S 細胞效 應得信號傳導通路圖。 分離出多個參與細胞周期，細胞增殖和凋亡過程中信號通路中的重要蛋白因子，重點研究重要蛋白因子在各個信號通路中的作用機理，揭示 H2S 細胞效應的分子機制，為在哺乳動物中 揭示 H2S 細胞效應的分子機制和闡明 H2S 在生理病理上的作用提供巨大的幫助和奠定基礎(chǔ)。課題承擔單位：復旦大學；南開大學課題負責人：Alastair Murchie 教授課題參加人員：陳東戎、Mark Gerrard Bartlam、王哲、王 銘潔、霍克克經(jīng)費比例：20％課題 3. 含硫氨基酸及其衍生物對心臟作用靶點及代謝途徑研究主要研究內(nèi)容：體內(nèi)含硫氨基酸及從食物中攝入的含硫化合物通過酶的作用分解代謝產(chǎn)生 H2S，心臟中產(chǎn)生 H2S 的關(guān) 鍵酶是 CSE。本課題首次發(fā)現(xiàn)半胱氨酸衍生物 SAC 通過促進 H2S 生成而具有心血管保護作用。我們進一步合成了具有自主知 識產(chǎn)權(quán)的半胱氨酸衍生物 SPRC，其具有更好的心血管保護作用。在此基 礎(chǔ)上，我 們擬通過代謝組學的方法，全面揭示含硫氨基酸及其衍生物（如 SPRC）在體內(nèi)的代謝規(guī)律，確定與含硫氨基酸及探針藥物 SPRC 心臟保護作用密切相關(guān)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，并對其功能 進行深入研究。 設計、優(yōu)化、合成更好的具有藥用前景的H2S 供體化合物， 為 H2S 供體藥物的臨床應用打下基礎(chǔ)。研究目標：1. 闡明 SPRC 對心肌缺血保護作用的分子機制，鑒定出其作用的關(guān)鍵蛋白，揭示其調(diào)控網(wǎng)絡。2. 進一步優(yōu)化 SPRC 的結(jié)構(gòu)，設計合成出具有更好心肌保護作用的 H2S 供體化合物，為其臨床應用奠定基礎(chǔ)。3. 闡明含硫氨基酸和 SPRC 在體內(nèi)的代謝途徑，確定其代謝的關(guān)鍵酶，建立體內(nèi)含硫氨基酸代謝途徑研究的關(guān)鍵技術(shù)。4. 闡明缺血、缺氧病理條件下 SPRC 對心肌保護作用的機制和經(jīng)由 CSE 的代謝途徑， 鑒定出其影響的關(guān)鍵蛋白質(zhì)和信號通路，揭示 SPRC 對 CSE 是否具有反饋調(diào)節(jié)作用，從而發(fā)現(xiàn)干預心臟疾病病的全新靶蛋白。課題承擔單位：復旦大學課題負責人：朱依諄 教授學術(shù)骨干：郭薇、林國強、儲以微、趙偉利、孫遜、魏邦國、古險峰經(jīng)費比例：34％課題 4. 心肌中局部內(nèi)源性 H2S 生成調(diào)控及傳遞主要研究內(nèi)容：以小鼠為模式動物，綜合運用基因 組學和蛋白質(zhì)組學的方法，著重研究已知的心臟中內(nèi)源性 H2S 的生成關(guān) 鍵酶 CSE 在心臟生理和病理條件下的表達調(diào)控， 闡明其信號通路和調(diào)控網(wǎng)絡。本課題同時研究 AAT 途徑在心臟內(nèi)源性 H2S 產(chǎn)生中的作用及在心臟生理和病理過程中的表達調(diào)控。本課題還將研究內(nèi)源性 H2S 在細胞內(nèi)和細胞間的傳遞及傳遞過程中與氧化性小分子及金屬離子的相互作用，探討其在體內(nèi)的代謝途徑。研究目標：1. 構(gòu)建攜帶 CSE 啟動子控制的報告基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，在整體水平上實現(xiàn)在生理條件下和病理條件下對 CSE 表達調(diào)控的實時觀測和在體研究。2. 通過生物信息學、分子生物學、生物化學和生物物理的方法闡明生理條件和病理條件下 CSE 表達調(diào)控的分子機制， 闡明調(diào)控的信號網(wǎng)絡。3. 闡明 ATT/MST 途徑在心 臟生病理條件下表達調(diào)控的機制，及其對心臟內(nèi)源性 H2S 產(chǎn)生的作用。4. 闡明 H2S 在細胞內(nèi)和細胞間的傳遞過程，以及傳遞過程中與氧化性小分子和金屬離子的反應特性。課題承擔單位：同濟大學；復旦大學課題負責人：郭占云 研究員學術(shù)骨干：查錫良、郜洪文、楊奕清、孫曉宇、邵 曉霞、朱融融、吳玲玲 博士后經(jīng)費比例：23%（四）課題技術(shù)路線（五）各課題關(guān)系：本項目為確保參加單位分工協(xié)作、 優(yōu)勢互補，在明確合作方式的基礎(chǔ)上，加強與課題組核心單位以外的其它在學科、 資源、技 術(shù)及人才方面有優(yōu)勢 的實驗室協(xié)作，并吸收優(yōu)秀人才以個人所在實驗室身份加入到對口的課題承擔單位負責或參加本課題研究，以保證科研隊伍組成的最佳化。實現(xiàn)技術(shù)平臺共用、科研資源共享，研究目標集中、點面結(jié)合及研究內(nèi)容緊密銜接等組織形式。同時，課題實行 2＋3 的滾動制，制訂課題完成質(zhì)量的定量考核標準，半年和一年分別進行一次研究進度考核。完成不好的 課題 將減少科研經(jīng)費，完成好的 課題將增加科研經(jīng)費。2 年完成不好的 單位和個人承擔的課題將被取消，重新吸收新的課題組進行本課題的研究或?qū)⒔?jīng)費集中到其它有望獲得較大突破的課題。為保證項目的順利完成及與其它“973”項目的無縫銜接，項目將聘請國內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域的著名專家，特別是“973”相關(guān)領(lǐng) 域的首席科學家，擔任本項目的學術(shù)顧問并成立相應的顧問委員會，監(jiān)督本項目的實施，參與本項目的管理并提出合理化建 議。本項目第一子課題的研究方案針對 H2S 對心肌細胞離子通道的調(diào)控和 H2S 促血管新生作用的兩條重要生理、病理通路，結(jié)合內(nèi)源性代謝產(chǎn)物對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能進行調(diào)控形成，盡管上述研究可使我們在明確的生理、病理通路中研究 H2S 對蛋白質(zhì)靶分子結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)節(jié)機制，但其局限性也是勿庸置疑的。H 2S 很可能還有在上述兩條通路以外的靶蛋白，并由此再間接地影響上述通路。因此，還必須同時在更廣的范圍內(nèi)尋找 H2S 的靶蛋白，以便發(fā)現(xiàn) H2S 與靶蛋白 結(jié)合的共同規(guī) 律；還要應用基因組學和蛋白質(zhì)組學的方法，觀察 H2S 是否還能通過調(diào)控基因表達而使細胞蛋白質(zhì)表達譜發(fā)生變化，并分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)，以及蛋白 質(zhì)與核酸間的相互作用。這部分研究將構(gòu)成第二子 課題的主要研究方案。第二子課題研究中所得到的較全面的關(guān)于 H2S 調(diào)節(jié) 基因表達和蛋白質(zhì)表達譜的研究結(jié)果，將為第一子課題的研究提供更全面的信息。另一方面，第一子課題中關(guān)于 H2S 對于特定蛋白靶分子及其相互作用的研究結(jié)果，將有助于分析第二子 課題中觀察到的蛋白質(zhì) 和基因表達譜的諸多變化，有助于分析上述變化中基因表達產(chǎn)物之間的相互關(guān)系， 繼而可據(jù)此通 過基因敲除等方法確認上述因果關(guān)系。因此，通過第一和第二子課題在研究過程中的互動，綜合應用結(jié)構(gòu)生物學、蛋白質(zhì)組學、基因組學和生理、病理學研究方法，既在由本課題組首先發(fā)現(xiàn)的兩條重要心血管調(diào)控通路中有的放矢地研究 H2S 對靶蛋白分子空間結(jié)構(gòu)和動能的調(diào)控及其生理、病理學意義，又能全面地反映 H2S 對心臟蛋白 質(zhì)表達譜的影響，通過學科交叉的互補作用，使 H2S 對重要心血管信號通路的調(diào)控作用及其機制得到較完整、深入的解答。鑒于 H2S 是一種具有心血管 調(diào)節(jié)功能的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，其體內(nèi)代謝過程值得研究。H2S 是由體內(nèi)含硫氨基酸（半胱氨酸、甲硫氨酸）作 為底物代謝產(chǎn)生的。但是，上述 H2S 底物對體內(nèi) H2S 生成的作用及其機制仍有待闡明，尤其是其組織特異性的作用，如在心臟中對局部 H2S 生成的 調(diào)節(jié)作用至今不明。因此本項目第三子課題擬應用代謝組學方法研究含硫氨基酸及其衍生物的體內(nèi)代謝過程，研究其 對內(nèi)源性 H2S 產(chǎn)生的調(diào)節(jié)作用及其機制。此外，還將以本課題組特有的含硫氨基酸衍生物 SPRC 為分子探針，通過研究其為何具有獨特的調(diào)節(jié) H2S 體內(nèi)代 謝的作用，剖析含硫氨基酸在體內(nèi)的代謝過程。此外，由于 H2S 在體內(nèi)的半衰期極短；而其最重要的調(diào)節(jié)作用又發(fā)生在心血管系統(tǒng)，對于 H2S 的心臟 效應來說，局部生成的 H2S 可能發(fā)揮更重要的調(diào)節(jié)作用。因此，本項目中還將設置子課題四，重點研究心肌局部 H2S 生成的調(diào)節(jié)機制。子課題四同時研究心肌缺血、缺氧等病理狀態(tài)下心肌局部 H2S 生成的代謝途徑，可能發(fā)現(xiàn)新的生成 H2S 的代謝途徑。因此，子課題三是在整體水平上地 應用代謝組學的方法系 統(tǒng)地研究含硫氨基酸及其衍生物的代謝途徑，除了 H2S 的生成外，還觀察所有相關(guān)中 間產(chǎn)物的生成，可望 對內(nèi)源性 H2S生成的代謝途徑有一個全面系統(tǒng)的認識。而子 課題四則在此基 礎(chǔ)上重點研究心肌局部的H2S 生成及其調(diào) 控機制，使關(guān)于內(nèi)源性 H2S 代謝的認識進一步得到深入。事實上，子 課題三、四中調(diào)控 H2S 生成的關(guān)鍵因子 -有關(guān)代謝途徑的確都是蛋白 質(zhì)。因此，子 課題三、四的研究也可認為是關(guān)于蛋白質(zhì)對 H2S 作用的研究。而子課題一、二則屬于 H2S 對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)節(jié)作用。通過上述四個子課題的研究，可分析 H2S 與蛋白質(zhì)之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)相互作用的基本規(guī)律，揭示 H2S 調(diào)控若干重要心血管生理、病理 過程的機制。其研究成果還有望對于蛋白質(zhì)組學的進一步發(fā)展作出一定的貢獻。四、年度計劃2010 年 1 月至 2010 年 12 月1. 研究內(nèi)容1）在心肌細胞中研究 PKA 和 PKG 在介導 H2S/HS-對 L 型 Ca2+通道抑制效應中的作用；闡明 PKA 和 PKG 是否為 H2S/HS-在心肌細胞中的靶分子。2）研究在血管內(nèi)皮細胞中是否存在 PI3K→Akt→Hif-1→生存素通路，并研究這一通路分別與血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移以及管腔形成的關(guān)系。3）用裂殖酵母生物芯片對比在細胞內(nèi)有 H2S 和沒有 H2S 的條件下全基因組基因的表達譜的差異；4）在釀酒酵母中全基因組基因敲除的文庫和全基因組基因基因過表達的文庫，對比在細胞內(nèi)有 H2S 和沒有 H2S 的條件下 釀酒酵母生長情況。5）闡明 SPRC 通 過何種機制產(chǎn)生心肌缺血保護的作用；SPRC 及其衍生物對 CSE 是否具有反饋調(diào)節(jié)作用；SPRC 對缺血、缺氧狀態(tài)下原代培養(yǎng)心室肌細胞的比較蛋白組學研究。6）明確 SPRC 在體內(nèi)的代 謝途徑，在腎臟及肝臟中的代謝，完成動物實驗。7）克隆 CSE 的調(diào)控區(qū)，構(gòu)建用于 轉(zhuǎn)基因小鼠的表達載體；通 過顯微注射的方法構(gòu)建攜帶CSE 啟動子控制的報告基因的轉(zhuǎn)基因小鼠；培養(yǎng)心肌細胞，通過 RNA 干擾抑制 CSE 的表達。并建立測定體內(nèi) H2S、氧化性小分子和金屬離子的方法。2. 預期目標1）闡明 PKA 和 PKG 是否為 H2S/HS-在心肌細胞中的靶分子。2）闡明 PI3K→Akt→Hif-1→生存素通路對血管新生的影響。3）利用在釀酒酵母中所得結(jié)果對比， 補充和證實裂殖酵母在基因 組學和蛋白組學所得的實驗結(jié)果，闡明在細胞內(nèi)有 H2S 和沒有 H2S 的條件下釀酒酵母生長情況；4）構(gòu)建出 CSE 啟動子- 報告基因載體；初步得到攜帶 CSE 啟動子控制的報告基因的轉(zhuǎn)基因小鼠；建立小鼠心肌細胞的培養(yǎng)體系，確定 RNA 干擾可以抑制 CSE 的表達；建立起測定體內(nèi)H2S、氧化性小分子和金屬離子的方法。5）闡明 SPRC 對 心肌缺血時線粒體 KATP、KCa 和 PTP 離子通道的影響及其抗氧化作用關(guān)鍵蛋白 SOD 和 CAT 影響。6）揭示 SPRC 在體內(nèi) 釋放 H2S 的過程及在體內(nèi)的代謝途徑，找出其代謝過程中的關(guān)鍵酶。7）發(fā)表 SCI 論文 7 篇以上，申 請專利 1～2 項。8）培養(yǎng)研究生（博士生，碩士生） 25 名以上。2011 年 1 月至 2011 年 12 月1. 研究內(nèi)容1）研究 H2S/HS-在靶分子（PKA/PKG）上的結(jié)合位點， 結(jié)合后靶分子空 間構(gòu)象的變化與其功能之間的關(guān)系。2）研究 Hif-1 是否還存在生存素非依賴的通路（如 VEGF）。3) 利用雙向電 泳和質(zhì)譜的方法，對比在細胞內(nèi)有硫化氫和沒有硫化氫的條件下全基因組蛋白表達譜的差異。4）通過計算機模擬對 SPRC 與 CSE 的相互作用進行了初步研究。分析 CSE 活性位點的化學性質(zhì)，在設計中引入羥基，肼基，羧基，胍基， 脲基，羥胺基等極性基團以加強與 CSE 的親合性，進行活性篩選。5）通過生物信息學、CHIP 、DNA 親和層析等方法預測并分離純化調(diào)控 CSE 的轉(zhuǎn)錄因子；篩選轉(zhuǎn)基因小鼠并建系；研究抑制 CSE 表達后 ATT/MST 途徑的變化；研究 H2S 與細胞膜的相互作用。2. 預期目標1）闡明 H2S/HS-在靶分子（PKA /PKG）上的結(jié)合位點， 結(jié)合后靶分子空間構(gòu)象的變化與其功能之間的關(guān)系。2）闡明 Hif-1 是否還存在生存素非依賴的通路。3）得到生物芯片和蛋白差異表達譜，分離出重要蛋白因子。4) 完成在巰基上引入一系列疏水片段，以加強 SPRC 與 CSE 的結(jié)合。并將該一系列化合物應在心肌缺血模型上驗證心肌的保護作用，完成 H2S 供體化合物的初篩。5）找到調(diào)控 CSE 表達的轉(zhuǎn)錄因子；建立轉(zhuǎn)基因小鼠純系；在 mRNA、蛋白 質(zhì)和酶活力水平確定 CSE 被抑制后 ATT/MST 途徑的 變化；建立研究 H2S 與膜作用的研究方法，闡明作用的特性。6）發(fā)表 SCI 論文 6 篇以上，申 請專利 1～2 項。7）培養(yǎng)研究生（博士生，碩士生） 25 名以上。2012 年 1 月至 2012 年 12 月1. 研究內(nèi)容1）H2S/HS-是否可通過調(diào)控 AKAP 所介導的 PKA 錨定作用而間接調(diào)控 PKA 對 α1C亞單位的作用，從而抑制其開放。在心肌細胞中觀察同位素標記的 H2S/HS-是否可直接與 L 型 Ca2+通道結(jié)合（包括 α1C 和 β）。2）觀察 H2S 是否能 夠提高 VEGFR2 的活性。用 AutoDock program 計算 H2S/HS-與 VEGFR2相互作用的位點。3）找到這些重要蛋白因子在大鼠心肌細胞中的同源蛋白。用酵母雙雜交的方法大規(guī)模篩選重要蛋白在體內(nèi)的相互作用蛋白。同時利用 CHIP-CHIP 和 RIP-CHIP 技術(shù)篩選重要蛋白在體內(nèi)的 DNA 和 RNA 靶點，用免疫共沉淀（CO-IP）和凝膠阻滯（ EMSA）等離子表面共振 SPR和 X-光晶體衍射的方法研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象；4）將分離的重要蛋白因子在裂殖酵母中作轉(zhuǎn)基因和敲除研究，分析其在細胞周期，增殖和凋亡等方面的表型，并通過提高或降低硫化 氫在細胞中的濃 度對比野生型細胞， 轉(zhuǎn)基因細胞和敲除細胞的表型。5）采用基因突變技術(shù)改變 SPRC 靶蛋白的分子結(jié)構(gòu)，分析 SPRC 在靶蛋白上的作用位點，揭示 SPRC 結(jié)合與靶位點后 對該靶蛋白功能及對細胞生理、病理過程的影響。6）通過活體成像技術(shù)，監(jiān)測報 告基因在生理條件下表達調(diào) 控；研究 CSE 調(diào)控因子的調(diào)控機制與調(diào)控網(wǎng)絡；7）利用轉(zhuǎn)基因小鼠建立 I/R 模型；模 擬病理條件下抑制 CSE 表達后 ATT/MST 途徑的變化；研究外源 H2S 供體在細胞內(nèi)跨膜遷移輸運過程。2. 預期目標1）闡明 H2S/HS-是否可通過調(diào)控 AKAP 所介導的 PKA 錨定作用而間接調(diào)控 PKA 對 α1C亞單位的作用，從而抑制其開放。2）闡明 H2S/HS-是否可直接與 L 型 Ca2+通道結(jié)合。3）闡明 H2S 和 VEGFR2 重組蛋白相互作用的位點。4）揭示硫化氫對蛋白，DNA 和 RNA 的相互作用的影響；5）觀察 SPRC 對這 些酵母菌株作用后所影響到的相關(guān)基因。改變 SPRC 靶蛋白的分子結(jié)構(gòu)，分析 SPRC 在靶蛋白上的作用位點，揭示 SPRC 結(jié)合與靶位點后對該靶蛋白功能及對細胞生理、病理過程的影響。7）實驗 CSE 在心臟中表達調(diào)控的實時觀測；闡明 CSE 調(diào)控因子的調(diào)控機制與調(diào)控網(wǎng)絡；建立起小鼠 I/R 模型。8）在 mRNA、蛋白質(zhì)和酶活力水平確定病理條件下 CSE 被抑制后 ATT/MST 途徑的變化；闡明外源 H2S 供體在細胞內(nèi)跨膜能力和特性。9）發(fā)表 SCI 論文 4 篇以上，申 請專利 1～2 項。10）培養(yǎng)研究生（博士生，碩士生） 20 名以上。2013 年 1 月至 2013 年 12 月1. 研究內(nèi)容1）在心肌細胞中觀察 L 型 Ca2+通道的 α1C 和 β亞單位的相應位點是否被激活。在 HEK293細胞中轉(zhuǎn)染 L 型 Ca2+通道的 α1C 和 β亞單位，研究 H2S/HS-直接調(diào)控 L 型 Ca2+通道的機制。2）通過核磁共振、質(zhì)譜、紅外光譜掃描、元素分析等實驗方法，結(jié)合計算機輔助分子動力學模擬分析，研究 H2S 與 VEGFR2 相互作用后對后者空間構(gòu)象的影響。3）將分離的重要蛋白因子在裂殖酵母/大鼠心肌細胞中作轉(zhuǎn)基因和敲除研究，分析其在 細胞周期，增殖和凋亡等方面的表型，并通過提高或降低硫化氫在細胞中的濃度對比野生型細胞，轉(zhuǎn)基因細胞和敲除細胞的表型。4）用酵母雙雜交的方法大規(guī)模篩選重要蛋白在體內(nèi)的相互作用蛋白。同 時利用 CHIP-CHIP和 RIP-CHIP 技術(shù)篩選重要蛋白在體內(nèi)的 DNA 和 RNA 靶點，用免疫共沉淀（CO-IP），凝膠阻滯（EMSA），等離子表面共振 SPR 和 X-光晶體衍射的方法研究蛋白 質(zhì)的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象。5）SPRC 衍生物對 缺血、缺氧狀態(tài)下原代培養(yǎng)心室肌細胞的比較蛋白組學研究及對缺氧狀態(tài)下游離培養(yǎng)心室組織塊的比較蛋白組學研究。6）監(jiān)測 I/R 過程中報告基因的表達 實時變化；通過生物信息學、CHIP、DNA 親和層析等方法分離純化病理條件下調(diào)控 CSE 的轉(zhuǎn)錄因子。7）確定 ATT/MST 途徑在生理和病理條件下的 轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控元件；研究 H2S 與細胞內(nèi)氧化性小分子的相互作用。2. 預期目標1）闡明 H2S/HS-直接調(diào)控 L 型 Ca2+通道的機制。2）闡明 H2S 與 VEGFR2 相互作用后對后者空間構(gòu)象的影響。3）揭示硫化氫細胞效應中蛋白相互作用機理及生物學功能；4）進行生物信息學分析及聚類分析， 篩選出與 H2S 生成相關(guān)蛋白分子。揭示 H2S 生成化合物-炔丙基半胱氨酸對心肌保護 作用相關(guān)蛋白分子的功能研究。5）建立 I/R 病理模型，實現(xiàn)對 CSE 表達調(diào)控的實時監(jiān)測；找出病理條件下調(diào)控 CSE 的轉(zhuǎn)錄因子；6）找到 ATT/MST 途徑的轉(zhuǎn)錄 因子和調(diào)控元件。 闡明 H2S 與細胞內(nèi)氧化性小分子的反應特性。7）發(fā)表 SCI 論文 5 篇以上，申 請專利 1～2 項。8）培養(yǎng)研究生（博士生，碩士生） 20 名以上。2014 年 1 月至 2014 年 8 月1. 研究內(nèi)容1）研究 H2S/HS-與純化的 α1C 和 β亞單位相互作用后對后者空 間構(gòu)象的影響。2）進一步研究 H2S/HS-結(jié)合位點突變的 α1C 和 β亞單位是否 還能與 H2S/HS-發(fā)生相互作用，以此明確 H2S/HS-調(diào)控 α1C 和 β亞單位分子空間構(gòu)象和功能的機制。3）用免疫共沉淀（CO-IP）、凝膠阻滯（EMSA）、等離子表面共振 SPR 和 X-光晶體衍射的方法研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象。用酵母雙 雜交的方法大規(guī)模篩選 重要蛋白在體內(nèi)的相互作用蛋白。同時利用 CHIP-CHIP 和 RIP-CHIP 技術(shù)篩選重要蛋白在體內(nèi)的 DNA 和 RNA 靶點。 4）將分離的重要蛋白因子在裂殖酵母中作轉(zhuǎn)基因和敲除研究，分析其在細胞周期，增殖和凋亡等方面的表型，并通過提高或降低硫化 氫在細胞中的濃度 對比野生型細胞， 轉(zhuǎn)基因細胞和敲除細胞的表型。5）探討 SPRC 衍生物通 過何種機制起心肌缺血保護作用； SPRC 衍生物對 CSE 是否具有反饋調(diào)節(jié)作用；揭示 SPRC 衍生物對缺血、缺氧狀態(tài)下原代培養(yǎng)心室肌細胞的比較蛋白組學研究。6）SPRC 衍生物在體內(nèi)的代 謝途徑，尚需進一步了解其機制，有待進一步進行動物實驗和臨床研究。7）研究病理條件下 CSE 調(diào)控因子的調(diào)控機制與調(diào)控網(wǎng)絡； 測定 I/R 過程中氧自由基和 H2S的變化。8）研究外源 H2S 或 H2S 供體 對心臟的保護作用；研究 CSE 和 ATT/MST 兩條途徑的調(diào)控網(wǎng)絡和協(xié)調(diào)機制；研究 H2S 與細胞內(nèi)金屬離子的相互作用。2. 預期目標1）闡明 H2S/HS-與純化的 α1C 和 β亞單位相互作用后對后者空 間構(gòu)象的影響。2）結(jié)合蛋白質(zhì)組學和基因組學, 生物化學和分子生物學以及細胞生物學的結(jié)果繪制一幅完整的信號通路的圖，揭示硫化 氫細胞效應的分子機制；3）闡明 SPRC 衍生物 對心肌缺血時線粒體 KATP、KCa 和 PTP 離子通道的影響及其抗氧化作用關(guān)鍵蛋白 SOD 和 CAT 影響，闡明 SPRC 衍生物在體內(nèi)的代謝途徑，找出其代謝過程中的關(guān)鍵酶。4）揭示 SPRC 衍生物在體內(nèi) 釋放 H2S 的過程及其代謝規(guī)律。5）闡明病理條件下 CSE 調(diào)控因子的調(diào)控機制與調(diào)控網(wǎng)絡； 闡明 I/R 過程中心臟里氧自由基和 H2S 的變化 規(guī)律；闡明 CSE 和 ATT/MST 兩條途徑的調(diào)控網(wǎng)絡和協(xié)調(diào)機制；闡明 H2S 與細胞內(nèi)金屬離子反應的特性。6）發(fā)表 SCI 論文 5 篇以上。7）培養(yǎng)研究生（博士生，碩士生） 15 名以上。8）完成結(jié)題。