《土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)》參考課件

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1、課題課題2 2 土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)1 1、尿素的利用、尿素的利用 尿素尿素是一種重要的是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。農(nóng)業(yè)氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被農(nóng)被農(nóng)作物作物吸收。吸收。土壤中的細菌將尿素土壤中的細菌將尿素分解成氨分解成氨之后才能被之后才能被植物利用。植物利用。2 2、細菌利用尿素的原因、細菌利用尿素的原因土壤中的細菌分解尿素是因為它們土壤中的細菌分解尿素是因為它們能合成脲酶能合成脲酶CO(NHCO(NH2 2) )脲酶脲酶+ H+ H2 2O O + CO+ CO2 2NHNH3 33 3、常見的分解尿素的微生物、常見的分解尿素的微生物 芽孢桿菌

2、、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。尿素。4 4、課題目的、課題目的從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌（一）篩選菌株（一）篩選菌株1 1、實例：、實例： DNA DNA多聚酶鏈式反應多聚酶鏈式反應是一種在體外將是一種在體外將少量少量DNADNA大量復制大量復制的技術，此項技術要求使用的技術，此項技術要求使用耐高溫（耐高溫（93930 0C C）的的D

3、NADNA聚合酶。聚合酶。啟示：啟示：尋找目的菌種時要尋找目的菌種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應的環(huán)境中去尋找。到相應的環(huán)境中去尋找。原因：原因：因為熱泉溫度因為熱泉溫度707080800 0C C，淘汰了絕大多數(shù)微生，淘汰了絕大多數(shù)微生物只有物只有TaqTaq細菌被篩選出來。細菌被篩選出來。 要分離一種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點，要分離一種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點，包括營養(yǎng)、生理、生長條件等；包括營養(yǎng)、生理、生長條件等； 方法：方法：抑制大多數(shù)微生物不能生長；造成有抑制大多數(shù)微生物不能生長；造成有利于該菌生長的環(huán)境，利于該菌生長的環(huán)境， 結果：結果：培養(yǎng)

4、一定時間后，該菌數(shù)量上升，再通過培養(yǎng)一定時間后，該菌數(shù)量上升，再通過平板稀釋等方法對它進行純化培養(yǎng)分離。平板稀釋等方法對它進行純化培養(yǎng)分離。2 2、實驗室中微生物的篩選原理：、實驗室中微生物的篩選原理： 人為提供有利于人為提供有利于目的菌株目的菌株生長的條件生長的條件( (包括營養(yǎng)、包括營養(yǎng)、溫度、溫度、pHpH等等) )，同時抑制或阻止其他微生物生長。，同時抑制或阻止其他微生物生長。15.0g15.0g瓊脂瓊脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2O O2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH

5、2 2POPO4 43 3、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)所需培養(yǎng)基：、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)所需培養(yǎng)基：從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源：氮源：尿素尿素 培養(yǎng)基的培養(yǎng)基的氮源為尿素氮源為尿素，只有能合成，只有能合成脲酶脲酶的微生物才的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏缺乏脲酶的微生物由于脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受到不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受

6、到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。4 4、培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理、培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理1 1、顯微鏡直接計數(shù)：、顯微鏡直接計數(shù)： 利用利用血球計數(shù)板血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。品中微生物的數(shù)量。（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目：（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目： 不能區(qū)分死菌與活菌；不能區(qū)分死菌與活菌； 不適于對運動細菌的計數(shù)；不適于對運動細菌的計數(shù)； 需要相對高的細菌濃度；需要相對高的細菌濃度； 個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察；個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察；缺點缺點2.2.

7、間接計數(shù)法（間接計數(shù)法（活菌計數(shù)法）活菌計數(shù)法） 原理：原理：在稀釋度足夠高時，微生物在固體培養(yǎng)在稀釋度足夠高時，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個單細胞繁殖而成的，基上所形成的一個菌落是由一個單細胞繁殖而成的，即一個菌落代表原先的一個單細胞。即一個菌落代表原先的一個單細胞。 常用方法：稀釋涂布平板法。常用方法：稀釋涂布平板法。每克樣品中的菌落數(shù)每克樣品中的菌落數(shù)(C(CV)V)M M 其中，其中，C C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，落數(shù)，V V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)(ml)，M M代表稀釋

8、倍數(shù)。代表稀釋倍數(shù)。注意事項注意事項為了保證結果準確，一般選擇菌落數(shù)在為了保證結果準確，一般選擇菌落數(shù)在3030300300的的平板上進行計數(shù)。平板上進行計數(shù)。為使結果接近真實值可將為使結果接近真實值可將同一稀釋度加到三個或三同一稀釋度加到三個或三個以上的平皿中個以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)。，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)。統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。涂布平板法所選擇的稀釋度很重要，一般以三個稀涂布平板法所選擇的稀釋度很重要，一般以三個稀釋度中的第二個稀釋度所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在釋度中的第二個稀釋度所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在5050個左個左右為最好

9、。右為最好。計數(shù)法計數(shù)法直接計數(shù)法直接計數(shù)法平板計數(shù)法平板計數(shù)法比濁法比濁法膜過濾法膜過濾法例題：例題：統(tǒng)計菌落數(shù)目的方法有（統(tǒng)計菌落數(shù)目的方法有（ ）A.A. B. B. C.C. D. D.涂布平板法涂布平板法 重量法重量法 直接計數(shù)法直接計數(shù)法比濁法比濁法 生理指標法生理指標法 膜過濾法膜過濾法 設置對照的主要目的設置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素是排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度。對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度。 實例：實例：在做分解尿素的細菌的篩選與統(tǒng)計菌落數(shù)在做分解尿素的細菌的篩選與統(tǒng)計菌落數(shù)目的實驗時，目的實驗時，A A同學從對應的同學

10、從對應的10106 6倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約出大約150150個菌落，但是其他同學在同樣的稀釋度下只個菌落，但是其他同學在同樣的稀釋度下只選擇出大約選擇出大約5050個菌落。分析其原因。個菌落。分析其原因。 原因：原因：土樣不同，培養(yǎng)基污染或操作失誤土樣不同，培養(yǎng)基污染或操作失誤( (或或者是混入了其他的含氮物質(zhì)者是混入了其他的含氮物質(zhì)) ) （三）設置對照：（三）設置對照： 小結：小結：通過這個事例可以看出，實驗結果要有說服通過這個事例可以看出，實驗結果要有說服力，對照的設置是必不可少的。力，對照的設置是必不可少的。 方案一：方案一：由其他同學用與由其他同學用與A A

11、同學相同土樣進行實驗同學相同土樣進行實驗 方案二：方案二：將將A A同學配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況同學配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。染。 結果預測：結果預測：如果結果與如果結果與A A同學一致，則證明同學一致，則證明A A無誤；無誤；如果結果不同，則證明如果結果不同，則證明A A同學存在操作失誤或培養(yǎng)基的同學存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。配制有問題。（一）土壤取樣（一）土壤取樣 從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm3cm左右，再取樣，將樣品裝入事

12、先準備好的信封中。左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。 取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。要滅菌。（二）制備培養(yǎng)基：（二）制備培養(yǎng)基： 制備以尿素為唯一氮源的制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基。應在火焰旁稱取土壤應在火焰旁稱取土壤10g10g。在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進行在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進行分離不同的微生物采用不同的稀釋度分離不同的微生物采用不同的稀釋度原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保證獲得菌落數(shù)在目的：保證獲得菌落數(shù)在303030030

13、0之間、適于計數(shù)的平板之間、適于計數(shù)的平板（三）樣品的稀釋（三）樣品的稀釋 為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？ 原因：原因：土壤中各類微生物的數(shù)量（單位：株土壤中各類微生物的數(shù)量（單位：株/kg/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及是不同的。例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細菌數(shù)約為兼性厭氧細菌數(shù)約為2 1852 185萬，放線菌數(shù)約為萬，放線菌數(shù)約為477477

14、萬，萬，霉菌數(shù)約為霉菌數(shù)約為23.123.1萬。萬。 結論：結論：為獲得不同類型的微生物，就需要按不同為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進行分離，同時還應當有針對性地提供選擇的稀釋度進行分離，同時還應當有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。培養(yǎng)的條件。（四）取樣涂布（四）取樣涂布實驗時要對培實驗時要對培養(yǎng)皿作好標記。養(yǎng)皿作好標記。注明培養(yǎng)基類型、注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等。度、培養(yǎng)物等。如果得到了如果得到了2 2個或個或2 2個以上菌落數(shù)目在個以上菌落數(shù)目在3030300300的平板，的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數(shù)，如則說明稀釋操作比較成功

15、，并能夠進行菌落的計數(shù)，如果果同一稀釋倍數(shù)的三個重復的菌落數(shù)相差較大，表明試同一稀釋倍數(shù)的三個重復的菌落數(shù)相差較大，表明試驗不精確驗不精確，需要重新實驗。，需要重新實驗。（五）微生物的培養(yǎng)與觀察（五）微生物的培養(yǎng)與觀察 在菌落計數(shù)時，每隔在菌落計數(shù)時，每隔24h24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。 選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結果，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結果，以防止因以防止因培養(yǎng)時間不足而導致遺漏菌落的數(shù)目。培養(yǎng)時間不足而導致遺漏菌落的數(shù)目。 培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。 細菌：細菌：30303737培養(yǎng)培養(yǎng)1 12d2d 放線菌：放線菌

16、：25252828培養(yǎng)培養(yǎng)5 57d7d 霉菌：霉菌：25252828的溫度下培養(yǎng)的溫度下培養(yǎng)3 34d4d。微生物的微生物的培養(yǎng)與觀察培養(yǎng)與觀察 1. 1.通過對照實驗，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)通過對照實驗，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。 2. 2.提示：選擇每個平板上長有提示：選擇每個平板上長有3030030300個菌落的個菌落的稀釋倍計算每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的稀釋倍計算每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的三個重

17、復的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示三個重復的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實驗不精確。實驗不精確。操作提示操作提示 無菌操作無菌操作 做好標記做好標記 規(guī)劃時間規(guī)劃時間 在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細菌后，如果培養(yǎng)某種細菌后，如果PHPH升高，指示劑將變紅，說升高，指示劑將變紅，說明該細菌能夠分解尿素明該細菌能夠分解尿素。 測定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積測定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細菌過濾器過濾后，將濾膜放到的水用細菌過濾器過濾后，將濾膜放到 伊紅美藍伊紅美藍 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌培養(yǎng)

18、基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑色菌落呈現(xiàn)黑色，通過記述，通過記述得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。大腸桿菌呈大腸桿菌呈 黑色中心黑色中心 , ,有或無金屬光澤有或無金屬光澤大腸桿菌在伊大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂紅美藍瓊脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 本課題知識小結本課題知識小結: :1.1.對細菌群體生長規(guī)律測定的正確的表述是（對細菌群體生長規(guī)律測定的正確的表述是（ ） A.A.在液體培養(yǎng)基上進行在液體培養(yǎng)基上進行 B. B.至少接種一種細菌至少接種一種細菌 C.C.接種一個細菌接種一個細菌 D. D.及時補充消耗的營養(yǎng)物質(zhì)及時補充消耗的營養(yǎng)物質(zhì) 2.2.能合成脲酶的微

19、生物所需要的碳源和氮源分別是能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是( )( ) A.CO A.CO2 2和和N N2 2 B. B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素AD3.3.下列說法不正確的是（下列說法不正確的是（ ） A.A.科學家從科學家從70708080度熱泉中分離到耐高溫的度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNATaqDNA聚聚合酶合酶 B.B.統(tǒng)計某一稀釋度的統(tǒng)計某一稀釋度的5 5個平板的菌落數(shù)依次為個平板的菌落數(shù)依次為M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作為該樣品菌落數(shù)的估計值作為該樣品菌落數(shù)的估計值 C.C.設置對照實驗的主要目的是排除實驗組中非測試因設置對照實驗的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度素對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度 D.D.同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。種類最多。B