生物化學(xué):15 第15章RNA生物合成

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1、第15章 RNA生物合成 一、 教學(xué)大綱基本要求 轉(zhuǎn)錄過程中的RNA聚合酶,啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子,終止子和終止因子,轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)節(jié)控制。轉(zhuǎn)錄后的加工,原核生物RNA加工,真核生物RNA的加工,RNA的拼接和催化機(jī)理。RNA的復(fù)制,噬菌體Qβ RNA的復(fù)制,病毒RNA復(fù)制的主要方法。RNA指導(dǎo)DNA的合成,反轉(zhuǎn)錄酶,病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄的生物學(xué)意義。RNA生物合成的抑制,嘌呤和嘧啶類似物,DNA模板功能的抑制劑。 二、 本章知識(shí)要點(diǎn) (一) DNA指導(dǎo)下RNA的合成: 1.轉(zhuǎn)錄的基本概念 在DNA指導(dǎo)下RNA的合成稱為轉(zhuǎn)錄。 轉(zhuǎn)錄中充當(dāng)模板的DNA單鏈稱為模板鏈

2、、反意義鏈或(-)鏈,另一條與之互補(bǔ)的DNA鏈稱為編碼鏈、有意義鏈或(+)鏈。轉(zhuǎn)錄一個(gè)mRNA分子的DNA片段稱為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位。攜帶一條多肽鏈(或一條rRNA和tRNA鏈)所需信息的DNA片段稱為一個(gè)基因(或順反子)。原核細(xì)胞中大多數(shù)轉(zhuǎn)錄單位為多順反子,真核細(xì)胞的大多數(shù)mRNA為單順反子的產(chǎn)物。轉(zhuǎn)錄僅以DNA一條鏈的某一區(qū)段為模板,因而稱為不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄在DNA上特定的部位開始,至另一端的特定部位終止,是在DNA模板指導(dǎo)下,按堿基互補(bǔ)的原則,由RNA聚合酶催化完成的。 2.RNA聚合酶 RNA聚合酶要求以4種核苷三磷酸作為底物,并需要DNA作為模板,Mg2+能促進(jìn)反應(yīng),RNA鏈的合成方向

3、也是5ˊ→3ˊ。反應(yīng)是可逆的,焦磷酸的分解可推動(dòng)反應(yīng)趨向聚合。RNA聚合酶催化的反應(yīng)無需引物,也無校對(duì)功能。 大腸桿菌的RNA聚合酶只有一種,催化3類RNA的合成。RNA聚合酶全酶有5個(gè)亞基(α2ββˊσ )組成,σ亞基可識(shí)別并使全酶穩(wěn)定結(jié)合于啟動(dòng)子部位(轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-35序列和-10序列),開始轉(zhuǎn)錄;沒有σ亞基的酶為核心酶(α2ββ’),負(fù)責(zé)RNA鏈的延伸。 真核生物的RNA聚合酶有3種:I、II和III。它們分別轉(zhuǎn)錄rRNA、mRNA和小分子量RNA。利用α-鵝膏蕈堿的抑制作用可以區(qū)分這三類RNA聚合酶。 3. 啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子 啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段D

4、NA序列。原核生物的啟動(dòng)子有兩個(gè)保守序列,位于-10的Pribriow框,和位于-35的識(shí)別區(qū)。真核生物的啟動(dòng)子有3類,分別由RNA聚合酶I、Ⅱ和Ⅲ進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶不能直接識(shí)別和結(jié)合到啟動(dòng)子上,而需借助于轉(zhuǎn)錄因子和輔助轉(zhuǎn)錄因子才能在起點(diǎn)上形成前起始復(fù)合物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。類別I啟動(dòng)子包括核心啟動(dòng)子和上游控制元件兩部分,需要UBFl和SLl因子參與作用。 類別Ⅱ啟動(dòng)子包括四類控制元件:基本啟動(dòng)子、起始子、上游元件和應(yīng)答元件。識(shí)別這些元件的反式因子有通用轉(zhuǎn)錄因子、上游轉(zhuǎn)錄因子和可誘導(dǎo)的因子。類別Ⅲ啟動(dòng)子有兩類:上游啟動(dòng)子和基因內(nèi)啟動(dòng)子,分別由裝配因子和起始因子促進(jìn)轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成和轉(zhuǎn)錄。

5、 4. 終止子和終止因子 轉(zhuǎn)錄的終止控制元件為終止子,是基因末端一段特殊的序列,它使RNA聚合酶在模板上的移動(dòng)減慢,停止RNA的合成。終止子的輔助因子為終止因子。大腸桿菌有兩類終止子:依賴于rho因子的終止子和不依賴于rho的終止子。終止子還可用于控制下游基因的表達(dá)。 5. 轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)節(jié)控制 轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)是基因表達(dá)調(diào)節(jié)的重要環(huán)節(jié),包括時(shí)序調(diào)節(jié)和適應(yīng)調(diào)節(jié)。原核生物基因組成操縱子既是表達(dá)單位,也是協(xié)同調(diào)節(jié)的單位; 它包括在功能上彼此相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因和控制部位(操縱基因和啟動(dòng)子),可接受調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物質(zhì)(阻遏蛋白)的調(diào)節(jié)。原核生物基因表達(dá)調(diào)節(jié)有正調(diào)節(jié)和負(fù)調(diào)節(jié),以負(fù)調(diào)節(jié)為主。受一種調(diào)節(jié)蛋

6、白所控制的調(diào)節(jié)系統(tǒng)稱為調(diào)節(jié)子。不同調(diào)節(jié)系統(tǒng)間形成調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。乳糖操縱子是酶合成誘導(dǎo)型操縱子。它分別受降解物基因活化蛋白和阻遏蛋白的正負(fù)調(diào)控。Trp操縱子屬于酶合成型操縱子。它除了受操縱基因(阻遏物)的調(diào)節(jié)外,還有另一種轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié)基因即衰減子。衰減作用是比阻遏物更精細(xì)的調(diào)節(jié)。 真核生物基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)包括基因的活化、轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成、反式作用因子(即對(duì)轉(zhuǎn)錄起重要調(diào)節(jié)作用的許多核蛋白)的相互作用和順式作用元件(指基因5′端上游區(qū)域那些與基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)的順序,這些順序均與基因處于順式位置)的順序。 真核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)與原核生物有相同之處,也有顯著的不同。①真核生物基因不組成操縱子

7、;②真核生物存在大量順式元件和反式因子,調(diào)節(jié)更復(fù)雜;③真核生物的調(diào)節(jié)以正調(diào)節(jié)為主,可誘導(dǎo)因子以共價(jià)修飾為主;④真核生物具有染色質(zhì)結(jié)構(gòu)水平上的調(diào)節(jié)。 上游調(diào)節(jié)因子通常有3個(gè)結(jié)構(gòu)域:DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域和二聚化結(jié)構(gòu)域。最常見的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域有:螺旋—轉(zhuǎn)角—螺旋、鋅指、堿性螺旋—突環(huán)—螺旋以及堿性亮氨酸拉鏈。 增強(qiáng)子能在很遠(yuǎn)距離對(duì)啟動(dòng)子產(chǎn)生影響,不論在啟動(dòng)子上游或下游都有作用,作用無方向性,無生物種族特異性,但受發(fā)育影響。從本質(zhì)上講,增強(qiáng)子與上游元件起同樣作用。 (二)轉(zhuǎn)錄后的加工 1. 原核生物RNA加工 除原核生物mRNA外,其它各類RNA在轉(zhuǎn)錄后需要經(jīng)過一系列

8、復(fù)雜的加工過程才能成為成熟的RNA分子。原核生物的穩(wěn)定RNA(rRNA和tRNA)存在切割、修剪、附加、修飾和異構(gòu)化等加工過程,mRNA一般在轉(zhuǎn)錄的同時(shí)即能進(jìn)行翻譯,不存在加工作用。 2. 真核生物RNA的加工 在真核生物中,編碼大多數(shù)蛋白質(zhì)的基因?yàn)椴贿B續(xù)基因(或稱隔裂基因),即包含編碼序列(又稱外顯子,extron)和非編碼序列(又稱內(nèi)含子,intron),外顯子被內(nèi)含子隔裂成若干片段,二者一起被轉(zhuǎn)錄。真核生物轉(zhuǎn)錄的mRNA前體分子在核內(nèi)加工形成分子大小不等的中間產(chǎn)物,被稱為核不均一RNA(即hnRNA);其中有一部分可轉(zhuǎn)變成細(xì)胞質(zhì)的成熟mRNA。mRNA存在特殊結(jié)構(gòu)。由hnRNA轉(zhuǎn)變?yōu)?/p>

9、 mRNA的加工過程包括:① 5′端形成特殊的帽子結(jié)構(gòu)(m7G5′ppp5′NmpNp-);② 3′端加上polyA尾巴;③ 通過拼接去除內(nèi)含子相應(yīng)序列;④ 鏈內(nèi)部核苷被甲基化。 真核生物通過RNA的拼接、編輯和再編碼等信息加工過程,可以抽提有用信息,消除錯(cuò)誤,適應(yīng)調(diào)節(jié)和選擇性的表達(dá)。這類加工還有利于生物進(jìn)化。 3. RNA的拼接和催化機(jī)理 大多數(shù)真核基因是斷裂基因,其轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物需通過拼接,去除非編碼區(qū)(即內(nèi)含子,intron),使編碼區(qū)(外顯子,exon)連接成連續(xù)序列。這是基因表達(dá)調(diào)控的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。 RNA的拼接有類型I自我拼接、類型II自我拼接、核mRNA的拼接體的拼接、核tR

10、NA的酶促拼接4種方式。 類型I和類型II自我拼接都不需蛋白酶的參與,其內(nèi)含子本身具有催化功能(稱為核酶),能夠自我完成拼接。二者差別在于前者需要游離鳥苷酸(或鳥苷)存在,游離鳥苷酸3′-羥基攻擊內(nèi)含子5′-磷酸基引起轉(zhuǎn)酯反應(yīng);而后者的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)無需游離鳥苷酸(或鳥苷)的發(fā)動(dòng),是由內(nèi)含子靠近3′端的腺苷酸2′-羥基攻擊5′-磷酸基引起的。 核mRNA前體(既hnRNA)的拼接過程與類型II內(nèi)含子的拼接基本相同,其差別在于前者由拼接體完成,而后者由內(nèi)含子自我催化完成。拼接體是由U1、U2、U4-6snRNP(核糖核蛋白)以及一些拼接因子在RNA的拼接位點(diǎn)逐步裝配而。 核內(nèi)tRNA的酶促拼接反

11、應(yīng)分兩步進(jìn)行,分別由不同的酶催化。第一步是由一個(gè)特殊核酸內(nèi)切酶斷裂磷酸二酯鍵,切去插入序列,反應(yīng)不需要ATP。第二步需要ATP,由RNA連接酶催化失竊開的使切開的tRNA兩部分共價(jià)連接。 (三)RNA的復(fù)制 RNA也可以成為遺傳信息的基本攜帶分子。例如,一些病毒的基因組為RNA分子,含有特異的RNA復(fù)制酶,可以在RNA指導(dǎo)下合成RNA。 RNA通過復(fù)制將遺傳信息由親代分子傳遞給子代分子。 噬菌體Qβ RNA復(fù)制酶對(duì)模板有很高的特異性,只識(shí)別病毒自身的RNA,對(duì)寄主細(xì)胞或其它病毒的RNA均無反應(yīng);并且對(duì)RNA的復(fù)制和翻譯,正鏈和負(fù)鏈的數(shù)量等存在調(diào)節(jié)控制作用。噬菌體QβRNA為正鏈,當(dāng)它

12、侵入大腸桿菌細(xì)胞后,可以直接進(jìn)行與病毒繁殖有關(guān)的蛋白質(zhì)的合成。在噬菌體特異的復(fù)制酶裝配好后,酶就吸附到正鏈RNA的3ˊ末端,以正鏈為模板合成出負(fù)鏈RNA,直至合成進(jìn)程結(jié)束,負(fù)鏈從模板上釋放。同樣的酶又吸附到負(fù)鏈RNA的3ˊ末端,并以負(fù)鏈為模板合成正鏈。兩條鏈都是由5ˊ→3ˊ方向延長(zhǎng)。 病毒RNA復(fù)制方式可以歸為下列幾類。① 正鏈RNA病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后首先合成復(fù)制酶及有關(guān)蛋白,然后在復(fù)制酶的作用下進(jìn)行病毒RNA的復(fù)制,最后由病毒RNA和蛋白質(zhì)裝配成病毒顆粒;② 負(fù)鏈RNA病毒侵入細(xì)胞后,借助于病毒帶進(jìn)去的復(fù)制酶合成出正鏈RNA,再以正鏈RNA為模板合成病毒蛋白和復(fù)制病毒RNA;③ 雙鏈RNA

13、病毒在病毒復(fù)制酶的作用下通過不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄先合成出正鏈RNA,并以正鏈RNA為模板翻譯成病毒蛋白質(zhì),然后再合成負(fù)鏈RNA,形成雙鏈RNA分子。 (四)RNA指導(dǎo)下DNA的合成 1.反轉(zhuǎn)錄酶 以RNA為模板合成DNA的過程稱為逆轉(zhuǎn)錄,由逆轉(zhuǎn)錄酶催化。逆轉(zhuǎn)錄酶是依賴RNA的DNA聚合酶,催化以RNA為模板的DNA合成。逆轉(zhuǎn)錄酶最初發(fā)現(xiàn)于致癌RNA病毒。該酶為多功能酶,能以RNA為模板合成第一條cDNA鏈(逆轉(zhuǎn)錄酶活性),水解除去RNA-DNA雜合分子中的RNA(RNase H活性),再以DNA鏈為模板合成雙鏈DNA(DNA聚合酶活性)。病毒RNA的逆轉(zhuǎn)錄要求特定tRNA為引物。逆轉(zhuǎn)錄酶無

14、校正功能,因此錯(cuò)誤率較高。逆轉(zhuǎn)錄過程共有10步反應(yīng),其中有兩次逆轉(zhuǎn)錄酶在模板上的轉(zhuǎn)移或稱為跳躍。逆轉(zhuǎn)錄的結(jié)果在前病毒的兩端出現(xiàn)兩個(gè)長(zhǎng)末端重復(fù)(即U3-R-U5),這是末端重復(fù)逆轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所致。長(zhǎng)末端重復(fù)序列中含有整合位點(diǎn)、加工位點(diǎn)以及啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列,對(duì)于前病毒的整合和表達(dá)十分重要。 2.病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄 逆轉(zhuǎn)錄病毒能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主DNA序列。如果病毒攜帶了細(xì)胞的原癌基因,使其高水平表達(dá)或失去調(diào)控即成為癌基因。人免疫缺損病毒主要侵染T淋巴細(xì)胞,它在感染后即殺死宿主細(xì)胞,造成獲得性免疫缺損綜合征(AIDS)。逆轉(zhuǎn)錄過程的研究不僅揭示了DNA和RNA之間的關(guān)系,而且也為RNA病毒致癌和艾滋病等

15、的治療提供新的途徑。 由RNA逆轉(zhuǎn)錄和整合而形成的遺傳因子即為逆轉(zhuǎn)座子。逆轉(zhuǎn)座子有兩類,一類自身編碼逆轉(zhuǎn)錄酶/整合酶;另一類自身不能編碼有關(guān)的酶,而依賴于其他來源。事實(shí)上任何RNA都能經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄和整合而成為逆轉(zhuǎn)座子。具有整合酶和整合位點(diǎn)的逆轉(zhuǎn)座子以較高的效率發(fā)生整合。具有poly(A)n結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)座子易于結(jié)合在染色體富含A-T的斷裂處。有些逆轉(zhuǎn)座子利用染色體DNA隨機(jī)斷裂而發(fā)生整合,這種整合方式將缺乏轉(zhuǎn)座子整合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。 3.反轉(zhuǎn)錄的生物學(xué)意義 逆轉(zhuǎn)座子廣泛分布在真核生物基因組內(nèi)。它們的生物學(xué)作用主要為:①影響所在位點(diǎn)或鄰近基因的活性;②成為基因組的不穩(wěn)定因素,促進(jìn)基因組

16、重組;③促進(jìn)生物進(jìn)化。 (五)RNA生物合成的抑制 RNA生物合成的抑制劑包括嘌呤和嘧啶類似物、DNA模板抑制物(嵌合劑和烷化劑等)和RNA聚合酶抑制物(如利福霉素、利鏈菌霉素和α-鵝膏蕈堿)。它們有些可在臨床上,作為抗生素和抗腫瘤藥物,有些只能在實(shí)驗(yàn)室供試驗(yàn)用。 三、重點(diǎn)、難點(diǎn) 重點(diǎn):轉(zhuǎn)錄過程中的RNA聚合酶,啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子,終止子和終止因子,轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)節(jié)控制。轉(zhuǎn)錄后的加工,原核生物RNA加工,真核生物RNA的加工,RNA的拼接和催化機(jī)理。RNA的復(fù)制,噬菌體Qβ RNA的復(fù)制,病毒RNA復(fù)制的主要方法。RNA指導(dǎo)DNA的合成,反轉(zhuǎn)錄酶,病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄的生物學(xué)意義

17、。RNA生物合成的抑制。 難點(diǎn):轉(zhuǎn)錄過程,轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控,RNA轉(zhuǎn)錄后的加工與修飾。 四、典型例題解析 例題15-1:簡(jiǎn)要說明原核生物的轉(zhuǎn)錄過程 解:原核生物大腸桿菌轉(zhuǎn)錄過程大致可以模板的識(shí)別、轉(zhuǎn)錄的起始、轉(zhuǎn)錄的延伸和終止4個(gè)階段。RNA聚合酶在σ亞基引導(dǎo)下,識(shí)別并結(jié)合到啟動(dòng)子上,然后在與RNA聚合酶結(jié)合的部位,DNA雙鏈局部被解開。在轉(zhuǎn)錄的起始階段酶繼續(xù)結(jié)合在啟動(dòng)子上催化合成RNA鏈最初2-9個(gè)核苷酸。隨后σ亞基即脫離核心酶,后者也就離開啟動(dòng)子,起始階段至此結(jié)束,轉(zhuǎn)錄進(jìn)入延伸階段。在延伸階段核心酶一直沿著DNA分子向前移動(dòng),解鏈區(qū)也跟著移動(dòng),新生RNA鏈得以延長(zhǎng),直至R

18、NA聚合酶識(shí)別DNA上的終止子,轉(zhuǎn)錄終止,酶與RNA鏈離開模板。核心酶具有基本的轉(zhuǎn)錄功能,對(duì)于轉(zhuǎn)錄的全過程都是需要的,而識(shí)別啟動(dòng)子和起始轉(zhuǎn)錄還需要σ亞基,識(shí)別轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和終止轉(zhuǎn)錄還需要終止因子Nus A 參與。 例題15-2:下面是單鏈DNA模板的堿基序列,將它與RNA聚合酶、GTP、CTP、UTP和[α-32p]ATP〕混合物一起保溫,再用脾磷酸二酯酶水解RNA產(chǎn)物,試問可得到哪些3′-32p標(biāo)記的NMP? 5ˊpApTpCpTpCpGpTpApTpGpCpApTpGpTpCT3ˊ 解:根據(jù)DNA模板的堿基序列先寫出RNA產(chǎn)物的堿基序列,每個(gè)A的5’端為32p: 5′32pAp

19、G32pApC32pApUpGpC32pApU32pApCpG32pA32pApG32pAp U 3′ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ 5′-磷酸二酯酶依次水解生成3′-NMP 得到3′―32p[GMP]∶3′―32p[CMP]∶3′― 32p[UMP]∶3′― 32p[CMP]∶3′― 32p[AMP]=3∶2∶1∶1 例題15-3:原核生物RNA聚合酶是如何找到啟動(dòng)子的?真核生物RNA聚合酶與之相比有和異同? 解:大腸桿菌RNA聚合酶在σ亞基引導(dǎo)下識(shí)別并結(jié)合到啟動(dòng)子上。單獨(dú)核心酶也能與DNA結(jié)合,σ因子的存在對(duì)核心酶的構(gòu)象有

20、較大影響;它導(dǎo)致RNA聚合酶與DNA一般序列和啟動(dòng)子序列親和力有很大不同,極大降低了酶與DNA一般序列的結(jié)合常數(shù)和停留時(shí)間。RNA聚合酶可通過擴(kuò)散與DNA任意部位結(jié)合,這種結(jié)合是松散的,并且是可逆的。隨后酶結(jié)合的DNA迅速被置換。這個(gè)過程一直繼續(xù)下去,全酶不斷變化與DNA結(jié)合部位,直到與上啟動(dòng)子序列,隨即有疏松結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)槔喂探Y(jié)合,并且DNA雙鏈被局部揭開。 真核生物基因組遠(yuǎn)比原核生物更大,它們的RNA聚合酶也更為復(fù)雜。真核生物RNA聚合酶主要有三類:RNA聚合酶I 轉(zhuǎn)錄45SrRNA前體,經(jīng)轉(zhuǎn)錄后加工產(chǎn)生5.8SrRNA,18SrRNA和28SrRNA。RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄所有的mRNA前體

21、和大多數(shù)SnRNA。RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄所tRNA,5SrRNA等小分子轉(zhuǎn)錄物。真核生物RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄過程大體于細(xì)菌相似,所不同的是真核生物RNA聚合酶自身不能識(shí)別和結(jié)合到啟動(dòng)子上,而需要在啟動(dòng)子上有轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶裝配成活性轉(zhuǎn)錄復(fù)合物才能起始轉(zhuǎn)錄。 例題15-4:何謂啟動(dòng)子?如何利用足跡法法確定啟動(dòng)子的序列結(jié)構(gòu)。 解:?jiǎn)?dòng)子是指RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。利用足跡法和DNA測(cè)序法可以確定啟動(dòng)子的序列結(jié)構(gòu)。所謂足跡法是將DNA起始轉(zhuǎn)錄的限制片段分離出來。具體方法是加RNA聚合酶使之與啟動(dòng)子部位結(jié)合,再用DNA酶部分水解。與酶結(jié)合的部位被保護(hù)而不水解,其余部

22、位水解成長(zhǎng)短不同的片段,經(jīng)凝膠電泳即可測(cè)出酶所結(jié)合的部位。 例題15-5:雞卵白蛋白基因有7700個(gè)核苷酸對(duì),經(jīng)轉(zhuǎn)錄后加工從前體分子中剪去內(nèi)含子,拼接成1872個(gè)殘基的成熟mRNA,其中卵白蛋白的編碼序列含1164個(gè)核苷酸(包括一個(gè)終止密碼子)。計(jì)算:(a)從轉(zhuǎn)錄出mRNA前體到最后加工成一個(gè)成熟的卵白蛋白mRNA(假定3′端還有200個(gè)腺苷酸殘基組成的尾巴)需要消耗多少分子ATP?(b)從游離氨基酸開始,把這個(gè)mRNA翻譯一次又需要多少分子ATP? 解:(a)從卵白蛋白基因轉(zhuǎn)錄出的前體mRNA應(yīng)含7700個(gè)核苷酸殘基,另外有200個(gè)腺苷酸殘基組成的尾巴,因?yàn)閐NMP+2ATP→dNTP+

23、2ADP,所以每摻入一個(gè)殘基相當(dāng)于消耗兩分子ATP。如果戴帽和內(nèi)部修飾消耗的能量忽略不計(jì),這個(gè)基因轉(zhuǎn)錄和加工共需消耗的ATP數(shù)為: (7700+200)2=1.58104個(gè)ATP分子 (b)卵白蛋白編碼序列共有1164個(gè)核苷酸,減去一個(gè)終止密碼子,編碼氨基酸的部分共有1161個(gè)殘基,共編碼387個(gè)氨基酸。在蛋白質(zhì)合成時(shí),每摻入一個(gè)氨基酸相當(dāng)于消耗4分子ATP(詳見第三部分13)。這個(gè)mRNA釋譯一次所需消耗的ATP數(shù)為: 3874=1548個(gè)ATP分子 例題15-6 RNA拼接可分為幾種類型,其作用特點(diǎn)是什么? 解:RNA的拼接有類型I自我拼接、類型II自我拼接、核mRNA的拼接體的

24、拼接、核tRNA的酶促拼接4種方式。類型I和類型II自我拼接都不需蛋白酶的參與,其內(nèi)含子本身具有催化功能(稱為核酶),能夠自我完成拼接。二者差別在于前者需要游離鳥苷酸(或鳥苷)存在,游離鳥苷酸3′-羥基攻擊內(nèi)含子5′-磷酸基引起轉(zhuǎn)酯反應(yīng);而后者的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)無需游離鳥苷酸(或鳥苷)的發(fā)動(dòng),是由內(nèi)含子靠近3′端的腺苷酸2′-羥基攻擊5′-磷酸基引起的。 核mRNA前體(既hnRNA)的拼接過程與類型II內(nèi)含子的拼接基本相同,其差別在于前者由拼接體完成,而后者由內(nèi)含子自我催化完成。拼接體是由U1、U2、U4-6snRNP(核糖核蛋白)以及一些拼接因子在RNA的拼接位點(diǎn)逐步裝配而。 核內(nèi)tRNA的酶

25、促拼接反應(yīng)分兩步進(jìn)行,分別由不同的酶催化。第一步是由一個(gè)特殊核酸內(nèi)切酶斷裂磷酸二酯鍵,切去插入序列,反應(yīng)不需要ATP。第二步需要ATP,由RNA連接酶催化失竊開的使切開的tRNA兩部分共價(jià)連接。 例題15-7:簡(jiǎn)述RNA生物功能的多樣性。 解:1981年Cech T發(fā)現(xiàn)四膜蟲rRNA前體能通過自我拼接切除內(nèi)含子,表明RNA也具有催化功能,稱之為核酶。核酶的發(fā)現(xiàn)破除了“RNA的功能只是控制蛋白質(zhì)合成”這一傳統(tǒng)觀點(diǎn)。此后,RNA的重要功能不斷有新的發(fā)現(xiàn)。從而認(rèn)識(shí)到DNA是攜帶遺傳信息分子,蛋白質(zhì)是執(zhí)行生命功能的分子,RNA則既是信息分子,又是功能分子。其主要功能有以下幾個(gè)方面:① RNA在遺傳

26、信息的翻譯中起著決定的作用。蛋白質(zhì)生物合成是生物機(jī)體最復(fù)雜也是最重要的代謝過程,三類RNA共同承擔(dān)并完成這一過程。② RNA具有重要的催化功能和其他持家功能。持家功能是指細(xì)胞(包括病毒)的基本功能,如原核和真核生物染色體的結(jié)構(gòu)RNA,噬菌體的裝配RNA等。③ RNA轉(zhuǎn)錄后加工和修飾依賴于各類小RNA和其它蛋白質(zhì)復(fù)合物。RNA轉(zhuǎn)錄后的信息加工十分復(fù)雜,其中包括切割、修剪、修飾、異構(gòu)、附加、拼接、編輯和再編碼等,除少數(shù)比較簡(jiǎn)單的過程可以直接由酶完成外,通常都要由一些特殊的RNA參與作用。④ RNA對(duì)基因表達(dá)和細(xì)胞功能具有重要調(diào)節(jié)作用。反義RNA可通過與靶部位序列互補(bǔ)而與之結(jié)合,或直接阻止其功能,

27、或改變靶部位構(gòu)象而影響其功能。⑤ RNA在生物的進(jìn)化中起重要作用。從RNA的拼接過程可以推測(cè)蛋白質(zhì)及基因由模塊構(gòu)建的演化歷程,拼接和編輯可以消除基因突變的危險(xiǎn),增加遺傳信息的多樣性,促進(jìn)生物進(jìn)化。 例題15-8:舉例說明原核生物基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。 解:原核生物基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的機(jī)制,可以用Jacob和Monod提出的操縱子學(xué)說來解釋。操縱子既是表達(dá)單位,也是協(xié)同調(diào)節(jié)的單位; 它包括在功能上彼此相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因和控制部位(操縱基因和啟動(dòng)子),可接受調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物質(zhì)(阻遏蛋白)的調(diào)節(jié)。原核生物基因表達(dá)調(diào)節(jié)有正調(diào)節(jié)(即調(diào)節(jié)因子與操縱基因的結(jié)合促進(jìn)轉(zhuǎn)錄)和負(fù)調(diào)節(jié)(即阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄),以

28、負(fù)調(diào)節(jié)為主。 以乳糖操縱子為例說明分解代謝調(diào)節(jié)。乳糖操縱子由調(diào)節(jié)基因、操縱基因和結(jié)構(gòu)基因Z(β-半乳糖苷酶)、Y(β-半乳糖透性酶)和A(β-半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶)組成。當(dāng)培養(yǎng)基中沒有乳糖存在時(shí),由調(diào)節(jié)基因表達(dá)產(chǎn)生的阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合,阻止結(jié)構(gòu)基因表達(dá);當(dāng)培養(yǎng)基中有乳糖存在時(shí),乳糖作為效應(yīng)物與阻遏蛋白結(jié)合,阻止阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合,結(jié)構(gòu)基因得以表達(dá),分解培養(yǎng)基中的乳糖供給細(xì)胞,這是轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控。乳糖操縱子也存在正調(diào)節(jié),即調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物—環(huán)腺苷酸受體蛋白(cyclic AMP receptor protein,CRP)經(jīng)環(huán)腺苷酸(cAMP)活化,可結(jié)合于受其調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子附近,促進(jìn)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄

29、。 再以色氨酸操縱子為例說明氨基酸合成代謝的調(diào)節(jié)。當(dāng)細(xì)胞中色氨酸過量時(shí),由調(diào)節(jié)基因表達(dá)產(chǎn)生的阻遏蛋白與色氨酸結(jié)合成為有活性的阻遏蛋白,與操縱基因結(jié)合,阻止結(jié)構(gòu)基因表。在轉(zhuǎn)錄水平上還存在“衰減子”用來終止和衰減轉(zhuǎn)錄作用,從而阻止基因表達(dá)。 例題15-9:指出下列各種二倍體基因型的大腸桿菌中,β-半乳糖苷酶和透性酶是可誘導(dǎo)的還是組成型的或者不表達(dá)的。 (a)i+O+Z-Y+/i+OcZ+Y+ (b)i+OcZ+Y+/i-OcZ-Y- (c)i-O+Z-Y+/i-OcZ+Y- (d)i+OcZ-Y-/i-OcZ-Y- (e)i-O+Z+Y-/i+OcZ-Y- - 解:題

30、中各基因型所用符號(hào)表示:i為調(diào)節(jié)基因,O為操縱基因,Z和Y分別代表β-半乳糖苷酶和透性酶的結(jié)構(gòu)基因;各基因右上角的符號(hào)“+”表示正常,“-”為不表達(dá),“c”表示組成型。 (a)這種基因型的β-半乳糖苷酶是組成型的,透性酶是部分可誘導(dǎo)的。因?yàn)閕+O+Z-Y+中雖有野生型的調(diào)節(jié)基因和操縱基因,但編碼β-半乳糖苷酶的Z基因失活,編碼透性酶的Y基因可在誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)下生成正常的透性酶。而在i+OcZ+Y+中,突變?yōu)榻M成型的操縱基因不再結(jié)合阻遏蛋白,因而Z基因和Y基因的表達(dá)是組成型的。 (b)β-半乳糖苷酶和透性酶的合成均為組成型。顯然,i+OcZ-Y-無法生成有活性的產(chǎn)物,而i+OcZ+Y+中的結(jié)構(gòu)

31、基因都是野生型的,Oc的存在使它們?cè)跊]有誘導(dǎo)劑的情況下也能表達(dá)。 (c)這個(gè)二倍體中的兩個(gè)調(diào)節(jié)基因都發(fā)生了突變,不能編碼有活性的阻遏蛋白。因此,β-半乳糖苷酶和透性酶的合成都是組成型的。 (d)由于這種基因型的Z和Y基因均不表達(dá),因而不能合成β-半乳糖苷酶和透性酶。 (e)i+OcZ-Y-中的結(jié)構(gòu)基因均不表達(dá),但i+基因可以編碼正常的阻遏蛋白,結(jié)合到i+O+Z+Y-的操縱基因上,當(dāng)誘導(dǎo)劑出現(xiàn)時(shí)就可以轉(zhuǎn)錄Z基因。所以,這個(gè)基因型的β-半乳糖苷酸是可誘導(dǎo)的,透性酶不能合成。 例題15-10:簡(jiǎn)要說明什么是“葡萄糖效應(yīng)”? 解:“葡萄糖效應(yīng)”是指在培養(yǎng)基中,葡萄糖與乳糖都存在時(shí),細(xì)菌通常優(yōu)

32、先利用葡萄糖不能利用乳糖的現(xiàn)象。只有在葡萄糖耗盡之后,經(jīng)過短暫停滯后,才能分解利用乳糖。這是由于葡萄糖降解物引起的調(diào)節(jié)作用。受到降解物阻遏表達(dá)的操縱子有乳糖、半乳糖、阿拉伯糖和麥芽糖等操縱子。在這種情況下,調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是cAMP受體蛋白(cyclic AMP receptor protein,CRP)或降解基因活化蛋白(catabolite gene activation protein, CAP),當(dāng)CRP或CAP與cAMP結(jié)合后即被活化,然后與啟動(dòng)子中的某個(gè)部位結(jié)合,促使結(jié)構(gòu)基因表達(dá),但是當(dāng)細(xì)胞內(nèi)葡萄糖豐富時(shí),cAMP的濃度降低,以及葡萄糖的降解物抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性,同時(shí)能活化磷酸二

33、酯酶,從而阻止cAMP的生成,分解細(xì)胞中已經(jīng)生成的cAMP。cAMP在細(xì)胞中含量低,CRP或CAP就不能被活化,結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄受阻。這種調(diào)節(jié)屬于精細(xì)調(diào)節(jié)。 五、單元自測(cè)題 (一)名詞解釋或概念比較 1. 轉(zhuǎn)錄與逆轉(zhuǎn)錄 2. 單順反子與多順反子 3. 反意義鏈與有意義鏈 4. 啟動(dòng)子與終止子 5. 內(nèi)含子與外顯子 6. RNA聚合酶全酶與核心酶 7. 操縱子與操縱基因 8. 順式作用元件與反式作用因子。 9. 阻遏物與輔阻遏物 10. -10序列與TATA box 11. 核酶 (二)填空題 1. 引物酶與轉(zhuǎn)錄中的RNA聚

34、合酶之間的差別在于它對(duì) 不敏感,并可以 作為底物。 2. 大腸桿菌中DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶全酶的亞基組成為 ,去掉 因子的部分稱為核心酶,這個(gè)因子使全酶能辯認(rèn)DNA上的 位點(diǎn)。 3. 利福平抑制細(xì)菌中轉(zhuǎn)錄的起始,因?yàn)? 。 4. 原核生物中各種RNA是 催化生成的。而真核生物基因的轉(zhuǎn)錄分別由 種RNA聚合酶催化,其中rRNA基因由 轉(zhuǎn)錄,hnRNA基因由 轉(zhuǎn)錄,各類小分子量RNA則是 的產(chǎn)物。 5.

35、 一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位一般應(yīng)包括 序列、 序列和 順序。 6. 真核細(xì)胞中編碼蛋白質(zhì)的基因多為 。編碼的序列還被保留在成熟mRNA中的是 ,編碼的序列在前體分子轉(zhuǎn)錄后加工中被切除的是 。在基因中 ______被_____分隔,而成熟的mRNA中外顯子轉(zhuǎn)錄的序列被拼接起來。 7. 真核生物與原核生物的tRNA前體一個(gè)重要的區(qū)別就是前者含有 。 8. 在原核細(xì)胞中,由同一調(diào)控區(qū)控制的一群功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因組成一個(gè)基因表達(dá)調(diào)控單位,稱為 ,其調(diào)控區(qū)包括

36、 和 。 9. 大腸桿菌乳糖操縱子調(diào)節(jié)基因編碼的 與 結(jié)合,對(duì)lac表達(dá)實(shí)施負(fù)調(diào)控; 和 的復(fù)合物結(jié)合于 上游部分,對(duì)lac表達(dá)實(shí)施正調(diào)控。 10. 大腸桿菌色氨酸操縱子阻遏蛋白必須先與輔阻遏物 相結(jié)合,才能結(jié)合于操縱基因。在trp操縱基因與結(jié)構(gòu)基因之間有一段能被轉(zhuǎn)錄的 ,可編碼含有2個(gè) 殘基的14肽。色氨酸充裕時(shí), 翻譯迅速,轉(zhuǎn)錄中斷,色氨酸不足時(shí), 翻譯遲滯,結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄得以繼續(xù)進(jìn)行,

37、稱為 調(diào)節(jié)。 11. 乳糖操縱子的啟動(dòng),不僅需要有誘導(dǎo)物乳糖存在,而且培養(yǎng)基中不能有 ,因?yàn)樗姆纸獯x產(chǎn)物會(huì)降低細(xì)胞中 的水平,而使 復(fù)合物不足,它是啟動(dòng)基因啟動(dòng)所不可缺少的 調(diào)節(jié)因子。 12.中心法則是 于 年提出的其內(nèi)容可概括為 。 (三)選擇題 1. hnRNA是: A. 存在于細(xì)胞核內(nèi)的tRNA前體 B. 存在于細(xì)胞核內(nèi)的mRNA前體 C. 存在于細(xì)胞核內(nèi)的rRNA前體 D. 存在于細(xì)胞核內(nèi)的snRNA前體 2. 真核細(xì)胞中RNA聚合

38、酶Ⅲ的產(chǎn)物是: A. mRNA B.hnRNA C. rRNA D. tRNA和snRNA 3. 合成后無需進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后加工修飾就具有生物活性的RNA是: A. tRNA B. rRNA C. 原核細(xì)胞mRNA D. 真核細(xì)胞mRNA 4. 下列抑制劑哪一種既抑制DNA的復(fù)制又抑制轉(zhuǎn)錄作用: A. 利福平 B. 絲裂霉素G C. 高劑量放線菌素 D. α-鵝膏蕈堿 5. 下列核酸合成抑制劑中對(duì)真核細(xì)胞RNA聚合酶Ⅱ高度敏感的抑制劑是: A. 利福平 B. 氨甲喋呤 C. α-鵝膏蕈堿 D氮芥 6. 以下哪種物質(zhì)常造成

39、堿基對(duì)的插入或缺失,從而發(fā)生移碼突變? A. 嘧淀衍生物 B. 5-氟尿嘧啶 C. 羥胺 D. 亞硝基胍 7. 下列關(guān)于基因增強(qiáng)子的敘述錯(cuò)誤的是: A. 刪除增強(qiáng)子通常導(dǎo)致RNA合成的速度降低 B. 增強(qiáng)子與DNA-結(jié)合蛋白相互作用 C. 增強(qiáng)子增加mRNA翻譯成為蛋白質(zhì)的速度 D. 在病毒的基因組中有時(shí)能夠發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)子 8. 下列有關(guān)操縱子的論述哪個(gè)是錯(cuò)誤的? A. 操縱子是由啟動(dòng)基因、操縱基因與其所控制的一組功能上相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因組成的基因表達(dá)調(diào)控單位 B. 操縱子不包括調(diào)節(jié)基因 C. 代謝底物往往是該途徑可誘導(dǎo)酶的誘導(dǎo)物,代謝終產(chǎn)物則往往是可阻遏酶的

40、輔助遏物 D. 真核細(xì)胞的酶合成也存在誘導(dǎo)和阻遏現(xiàn)象,因此也是由操縱子進(jìn)行調(diào)控的 9. 操縱子調(diào)節(jié)系統(tǒng)屬于哪一種水平的調(diào)節(jié)? A. 復(fù)制水平的調(diào)節(jié) B. 轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控 C. 轉(zhuǎn)錄后加工的調(diào)控 D. 翻譯水平的調(diào)控 10. 下列關(guān)于操縱基因的論述哪個(gè)是正確的? A. 能專一地與阻遏蛋白結(jié)合 B. 能與結(jié)構(gòu)基因一起被轉(zhuǎn)錄但未被翻譯 C. 是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位 D. 是誘導(dǎo)物或輔助遏物的結(jié)合部位 11. 下列有關(guān)降解物基因活化蛋白(CAP)的哪個(gè)論點(diǎn)是正確的? A. CAP-cAMP可專一地與啟動(dòng)基因結(jié)合,促進(jìn)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄 B.

41、CAP可單獨(dú)與啟動(dòng)基因相互作用,促進(jìn)轉(zhuǎn)錄 C. CAP-cAMP可與調(diào)節(jié)基因結(jié)合,控制阻遏蛋白合成 D. CAP-cAMP可與RNA聚合酶競(jìng)爭(zhēng)地結(jié)合于啟動(dòng)基因,從而阻礙結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄 12. 與乳糖操縱子操縱基因結(jié)合的物質(zhì)是: A. RNA聚合酶 B. DNA聚合酶 C. 阻遏蛋白 D. 反密碼子 13. 下列關(guān)于生物體內(nèi)物質(zhì)代謝特點(diǎn)的論述哪個(gè)是不正確的? A. 各種物質(zhì)都有特定的代謝途徑 B. 各種物質(zhì)的代謝是相互聯(lián)系的 C. 在任何情況下代謝都以不變的速率進(jìn)行 D. 各種物質(zhì)的代謝是相互聯(lián)系的 14. 假定在含有乳糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿

42、菌?;蛐褪莍-Z+Y+。然后加入葡萄糖。那么將發(fā)生下列哪種情況? A. 不發(fā)生什么變化 B. 細(xì)胞不再利用乳糖 C. 不再產(chǎn)生Lac mRNA D. 阻遏物將結(jié)合到操縱基因上 15.真核基因表達(dá)受下列哪個(gè)成分調(diào)控 A. 操縱 B. 非組蛋白 C. 組蛋白 D. 阻遏蛋白 16. 參與識(shí)別轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的是: A. ρ因子 B. 核心酶(α2ββˊ) C. 引物酶 D. 全酶(α2ββˊσ) 17. 下列有關(guān)轉(zhuǎn)錄作用的敘述些是對(duì)的? A.模板上專一的轉(zhuǎn)錄起始部位必須由RNA聚合酶來識(shí)別 B.對(duì)于一個(gè)基因而

43、言,DNA中的一條鏈?zhǔn)寝D(zhuǎn)錄模板,其互補(bǔ)鏈有可能是另一基因的反意義鏈 C.轉(zhuǎn)錄從模板的3ˊ端開始,沿模板鏈3ˊ→5ˊ 的方向進(jìn)行,RNA鏈按3ˊ→5ˊ的方向合成 D.模板5ˊ端附近有特殊的終止序列,確定轉(zhuǎn)錄的終點(diǎn) (四)是非題 1. 所有核酸合成時(shí),新鏈的延長(zhǎng)方向都是從5’→3’。 2. 抑制RNA合成酶的抑制劑不影響DNA的合成。 3. 在真核細(xì)胞中,三種主要RNA的合成都是由一種RNA聚合酶催化。 4. 中心法則概括了DNA在信息代謝中的主導(dǎo)作用。 5. 逆轉(zhuǎn)錄酶催化RNA指導(dǎo)的DNA合成不需要RNA引物。 6. 原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中許多mRNA都是多順反子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

44、 7. 在DNA合成中,大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ和真核細(xì)胞中的RNaseH均能切除RNA引物。 8. 用一個(gè)帶poly(U)的親和層析柱,可以方便地從勻漿中分離出真核和原核細(xì)胞的mRNA。 9. 逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成DNA時(shí),利用病毒RNA鏈通過氫鍵結(jié)合的一個(gè)tRNA分子作為引物。 10. 隔裂基因的內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的序列在前體分子的加工中都被切除,因此可以斷定內(nèi)含子的存在完全沒有必要。 11. 原核細(xì)胞中mRNA一般不需要轉(zhuǎn)錄后加工。 12. 如果沒有σ因子,核心酶只能轉(zhuǎn)錄出隨機(jī)起始的、不均一的、無意義的RNA產(chǎn)物。 13. 已發(fā)現(xiàn)一些RNA前體分子具有催化活性,可以準(zhǔn)確地自我剪

45、接,被稱為核酸構(gòu)成酶(ribozyme)。 14. RNA聚合酶不具備核酸外切酶活性,因此RNA合成的保真度比DNA低得多。 15. 大腸桿菌乳糖操縱子是第一個(gè)闡明的操縱子,是由Monod和Jacob于1961年提出的。 16. 大腸桿菌乳糖操縱子真正的誘導(dǎo)物不是乳糖,而是它的異構(gòu)體別乳糖。 17. 操縱基因又稱操縱子,如同啟動(dòng)基因又稱啟動(dòng)子一樣 (五)簡(jiǎn)答與計(jì)算 1. 大腸桿菌的DNA聚合酶與RNA聚合酶有哪些重要的異同點(diǎn)。 2. 如果一種突變的菌株合成的σ因子與核心酶不易解離,對(duì)RNA合成可能產(chǎn)生什么影響? 3. 下面是某基因中的一個(gè)片段: (1)指出轉(zhuǎn)錄的方向和

46、哪條鏈?zhǔn)寝D(zhuǎn)錄模板 (2)寫出轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的序列 (3)RNA產(chǎn)物的序列與有意義鏈的序列之間有什么關(guān)系? 4. 每次DNA合成的起始需要一小段RNA作引物,E.coli RNA聚合酶受利福平的抑制。 (1)把利福平加到正在進(jìn)行對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的E.coli群體中,對(duì)DNA復(fù)制會(huì)產(chǎn)生什么影響? (2)如果將E.coli在缺乏某種生長(zhǎng)必需因子的培養(yǎng)中饑餓兩小時(shí),然后再加入這種生長(zhǎng)必需因子和利福平,對(duì)DNA復(fù)制會(huì)產(chǎn)生什么影響? 5. 一個(gè)正在旺盛生長(zhǎng)的大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)約含15000個(gè)核糖體。 (1) 如果rRNA前體的基因共含有5000對(duì)核苷酸殘基,轉(zhuǎn)錄出這么多rRNA共需消耗多少分子ATP(設(shè)反應(yīng)

47、從5′-NMP和ATP開始)? (2) 如果這些能量由葡萄糖的有氧氧化提供,共需消耗多少分子葡萄糖? 6. 假設(shè)大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄速度為每秒50個(gè)核苷酸殘基,計(jì)算RNA聚合酶合成一個(gè)編碼分子量為100KD的蛋白質(zhì)的mRNA大多需要多少時(shí)間?(氨基酸殘基的平均分子量按110計(jì))。 7. 在突變的大腸桿菌中下列基因的缺失將產(chǎn)生什么結(jié)果? (1) 乳糖操縱子調(diào)節(jié)基因缺失; (2) 色氨酸操縱子調(diào)節(jié)基因缺失。 8. 從野生型大腸桿菌中分離出一個(gè)單基因突變的突變株,它不能在乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等碳原上生長(zhǎng),但它細(xì)胞內(nèi)的AMP水平正常。試推測(cè)什么突變可導(dǎo)致這樣的結(jié)果? 9. 指出下列二倍

48、體基因型(1)能否產(chǎn)生β-半乳糖苷酶?(2)β-半乳糖苷酶的合成是誘導(dǎo)型還是組成型?(3)如果以乳糖作為唯一碳源是否能生長(zhǎng)? (1)I+Z-Y+/ i-Z+Y- (2)i+Z+Y+/ i+OcZ-Y+ (3)i+Z-Y+/ OcZ+Y+ (4)i+Z+Y-/ i-Z-Y+ (5)i-Z+Y-/ i-Z+Y+ (6)i-Z+Y+/ i+OcZ-Y+ (7)i-P-Z+/ i-Z- (8)i+OcZ-Y+/ i+Z+Y- (9)i+P-OcZ-Y-/ i-Z+Y- (10)i+ P-OcZ+Y-/ i-P+O+Z+Y-

49、 10. 一種突變的大腸桿菌乳糖操縱子阻遏蛋白對(duì)lac操縱基因的親和力比野生型大100倍,而對(duì)DNA上非專一部位的結(jié)合親和力沒有改變。試預(yù)測(cè)其后果。 11. 如果把乳糖加到預(yù)先在缺少所有糖的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)的一種Lac+ 大腸桿菌菌株培養(yǎng)物中,那么mRNA合成,酶合成,以及酶活性發(fā)生什么變化?假定所加入的乳糖量在生長(zhǎng)兩代后耗盡。 12. 有一個(gè)基因型為i+Z+Y+的細(xì)胞,在既不含葡萄糖也不含乳糖的培養(yǎng)基(即用一些其它碳源)內(nèi)有多少種蛋白結(jié)合成組成型lac操縱子的DNA上?如果葡萄糖存在時(shí)有多少種? 13. cAMP-CAP系統(tǒng)的作用保證下列哪一點(diǎn)? (1) cAMP水平不會(huì)變得太高;

50、 (2) 一些酶在需要時(shí)產(chǎn)生; (3) 一些酶在不需要時(shí)不產(chǎn)生. 14.原核生物RNA聚合酶是如何找到啟動(dòng)子的?真核生物RNA 聚合酶與之相比有何異同? 15. 簡(jiǎn)要說明原核生物和真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控的主要特點(diǎn)。 16. 簡(jiǎn)要說明RNA功能多樣性。 六、參考答案 (一)名詞解釋或概念比較 1. 在DNA指導(dǎo)下RNA的合成稱為轉(zhuǎn)錄, 轉(zhuǎn)錄是在DNA模板指導(dǎo)下,按堿基互補(bǔ)的原則,由RNA聚合酶催化完成的。以RNA為模板合成DNA的過程稱為逆轉(zhuǎn)錄,由逆轉(zhuǎn)錄酶催化。 2.攜帶一條多肽鏈(或一條rRNA和tRNA鏈)所需信息的DNA片段為單順反子,真核細(xì)胞的大多數(shù)mRNA

51、為單順反子的產(chǎn)物。攜帶多條多肽鏈(或一條rRNA和tRNA鏈)所需信息的DNA片段稱為多順反子,原核細(xì)胞中大多數(shù)轉(zhuǎn)錄單位為多順反子的產(chǎn)物。 3.轉(zhuǎn)錄中充當(dāng)模板的DNA單鏈稱為模板鏈、反意義鏈或(-)鏈,另一條與之互補(bǔ)的DNA鏈稱為編碼鏈、有意義鏈或(+)鏈。 4.啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。終止子是轉(zhuǎn)錄的終止控制元件,是基因末端一段特殊的序列,它使RNA聚合酶在模板上的移動(dòng)減慢,停止RNA的合成。 5.在真核生物中,編碼大多數(shù)蛋白質(zhì)的基因?yàn)椴贿B續(xù)基因(或稱隔裂基因),即包含編碼序列(又稱外顯子,extron)和非編碼序列(又稱內(nèi)含子,intron),外

52、顯子被內(nèi)含子隔裂成若干片 段,二者一起被轉(zhuǎn)錄。 6.RNA聚合酶全酶與核心酶 RNA聚合酶全酶有5個(gè)亞基(α2ββˊσ )組成,σ亞基可識(shí)別并使全酶穩(wěn)定結(jié)合于啟動(dòng)子部位(轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-35序列和-10序列),開始轉(zhuǎn)錄;沒有σ亞基的酶為核心酶(α2ββ’),負(fù)責(zé)RNA鏈的延伸。 7.操縱子既是原核生物基因表達(dá)單位,也是協(xié)同調(diào)節(jié)的單位; 它包括在功能上彼此相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因和控制部位(操縱基因和啟動(dòng)子),可接受調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物質(zhì)(阻遏蛋白)的調(diào)節(jié)。而操縱基因是操縱子上的控制部位。 8.順式作用元件是指基因5′端上游區(qū)域那些與基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)的順序,這些順序均與基因處于順式位置。反

53、式作用因子是指對(duì)轉(zhuǎn)錄起重要調(diào)節(jié)作用的許多核蛋白,它們的編碼基因位于其它不同的位置。 9 .阻遏物又稱阻遏蛋白,是調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物,它通過與操縱基因的結(jié)合,可以控制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。輔阻遏物一般是各種生物合成途徑的終產(chǎn)物(或產(chǎn)物類似物),它與無活性的阻遏蛋白結(jié)合,可以使阻遏蛋白構(gòu)象發(fā)生變化,從而可以結(jié)合到操縱基因上,以阻制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。 10.-10序列是指大腸桿菌基因啟動(dòng)子共有序列,它在基因上游約-10位置處,是6bp的保守序列TATAAT,稱為Pribnow 框,或稱為-10序列TATA box,該序列有助于DNA局部雙鏈解開。 TATA box是真核生物類別II啟動(dòng)子中基本啟動(dòng)

54、子的共有序列,它的位置在-25至-30處,其保守序列為TATAAAA(T),這一序列稱為TATA box,其功能與RNA聚合酶的定位有關(guān),DNA雙鏈在次解開并決定轉(zhuǎn)錄的起始位置。 11. 核酶是那些指具有催化功能的RNA。 (二)填空題 1. 利福平 dNTP 2. α2ββ’σ σ 啟動(dòng)子 3. 利福平與β亞基競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合GTP和ATP 4. 同一RNA聚合酶 3 RNA聚合酶Ⅰ RNA聚合酶Ⅱ RNA聚合酶Ⅲ 5. 啟動(dòng)子 編碼 終止子 6. 隔裂基因 外顯子 內(nèi)含子

55、 外顯子 內(nèi)含子 7. 插入序列 8. 操縱子 啟動(dòng)基因 操縱基因 9. 阻遏蛋白 操縱基因 cAMP 降解物基因活化蛋白 啟動(dòng)基因 10. 色氨酸 前導(dǎo)序列 色氨酸 前導(dǎo)肽 前導(dǎo)肽 衰減或制動(dòng) 11. 葡萄糖 cAMP cAMP-CAP 正 復(fù)制 轉(zhuǎn)錄 翻譯 12.Crick 1958 DNA←—→DNA——→RNA——→ 蛋白質(zhì) (三)選擇題 1.B 2. D 3.C 4.C 5.C 6.A

56、7.A 8.D 9.B 10.A 11.A 12.C 13.C 14.C 15.B 16.D 17.B,D (四)是非題 1. 對(duì) 2.錯(cuò) 3. 錯(cuò) 4. 對(duì) 5. 錯(cuò) 6. 錯(cuò) 7. 對(duì) 8. 錯(cuò) 9. 對(duì) 10. 錯(cuò) 11. 對(duì) 12. 對(duì) 13. 對(duì) 14. 對(duì) 15. 對(duì) 16. 對(duì) 17. 錯(cuò) (五)簡(jiǎn)答與計(jì)算 1. DNA聚合酶和RNA聚合酶主要的相似點(diǎn):①都以DNA為模板;②都根據(jù)堿基互補(bǔ)的原則按5’→3’的方向合成新鏈;③合成反應(yīng)均由焦磷酸的水解驅(qū)動(dòng);④都需要2價(jià)陽(yáng)離子作為輔因子。DNA聚合酶Ⅲ與RN

57、A聚合酶全酶主要的不同之點(diǎn)如下: 不同點(diǎn) DNA聚合酶Ⅲ RNA聚合酶全酶 亞基組成 αβγδεθι α2ββ’σ 功能 復(fù)制 轉(zhuǎn)錄 單體 4種dNTP 4種NTP 模板 DNA兩條鏈全部 DNA一條鏈的一段 對(duì)引物的需求 需要引物 不需要引物 產(chǎn)物 較長(zhǎng),與模板結(jié)合 較短,從模板解離 核酸外切酶活性 有 無 校對(duì)功能 有 無 2. RNA聚合酶全酶與DNA模板的結(jié)合比核心酶緊密得多。RNA合成起始之后,突變的σ因子不能及時(shí)解離,極大地降低了RNA聚合酶沿模板移動(dòng)的速度。因此該突變株的RNA合成比野生型慢得多。 3.(1)轉(zhuǎn)

58、錄從右向左進(jìn)行,即沿模板(負(fù)鏈)3’→5’的方向進(jìn)行。上面寫的那條鏈負(fù)鏈)是反意義鏈。 (2)5′ … A G C C U G C G A A U … 3′ (3)RNA產(chǎn)物的堿基序列與有意義鏈(正鏈)相同,唯一的區(qū)別是U替了正鏈的T,因此通常以正鏈(有意義鏈)為基因標(biāo)示鏈。 4. (1)已經(jīng)開始合成的所有DNA分子,將會(huì)繼續(xù)完成其復(fù)制過程;沒有開始合成的DNA,將會(huì)開始其復(fù)制過程,所以在這種情況下不影響任何細(xì)胞群體的DNA合成。 (2)由于氨基酸饑餓,所有正在進(jìn)行合成的DNA分子都會(huì)停止,以后加入必需氨基酸和利福平。所有的DNA分子,都不會(huì)重新開始復(fù)制過程。 5. (1)1.510

59、8個(gè)ATP分子 (2)4.17106個(gè)葡萄糖分子 6. 54.6秒 7. (1)lac調(diào)節(jié)基因缺失的突變體不能編碼有活性的阻遏蛋白,使乳糖操縱子變?yōu)榻M成型的。 (2)trp調(diào)節(jié)基因的缺失使該突變體不能產(chǎn)生阻遏蛋白,色氨酸操縱子的表達(dá)呈組成型。 8. 很可能是編碼降解物基因活化蛋白(CAP)的基因發(fā)生突變,無法合成有功能的CAP。 9. 基因型 β-半乳糖苷酶的合成 Z基因表達(dá)類型 在乳糖中能否生長(zhǎng) (1) 合成 誘導(dǎo)型 生長(zhǎng) (2) 合成 誘導(dǎo)型 生長(zhǎng) (3) 合成 組成型 生長(zhǎng) (4) 合成 誘導(dǎo)型 生長(zhǎng) (5) 合成 組

60、成型 生長(zhǎng) (6) 合成 誘導(dǎo)型 生長(zhǎng) (7) 不合成 不表達(dá) 不能生長(zhǎng) (8) 合成 誘導(dǎo)型 生長(zhǎng) (9) 不合成 不表達(dá) 不能生長(zhǎng) (10) 合成 誘導(dǎo)型 生長(zhǎng) 10. 野生型lac阻遏蛋白與操縱基因的締合速度常數(shù)接近于擴(kuò)散控制極限。因此,結(jié)合親和力增大100倍意味著突變的阻遏蛋白從操縱基因上的解離速度大約為野生型的1/%,導(dǎo)致從加入誘導(dǎo)劑到lac操縱子開始轉(zhuǎn)錄之間的滯后,在突變體中比在野生型中長(zhǎng)得多。 11. mRNA在加入乳糖后不久就合成,隨之酶合成。合成持續(xù)兩代,在乳糖用盡時(shí)便引起阻遏的建立,關(guān)閉mRNA合成,停止酶合成。由于β-半乳

61、糖苷酶十分穩(wěn)定,所以酶活性繼續(xù)保持,即使在細(xì)胞分裂時(shí),每個(gè)細(xì)胞的活性減少。 12. 兩種,一種。 13. (2)、一些酶在需要時(shí)產(chǎn)生; (3) 一些酶在不需要時(shí)不產(chǎn)生. 14. 大腸桿菌RNA聚合酶全酶由5個(gè)亞基(α2ββˊσ)組成,沒有σ亞基的酶為核心酶。RNA聚合酶在σ亞基引導(dǎo)下識(shí)別并結(jié)合到啟動(dòng)子上。單獨(dú)核心酶也能與DNA結(jié)合,σ因子的存在對(duì)核心酶的構(gòu)象有較大影響;它導(dǎo)致RNA聚合酶與DNA一般序列和啟動(dòng)子序列親和力有很大不同,極大降低了酶與DNA一般序列的結(jié)合常數(shù)和停留時(shí)間。RNA聚合酶可通過擴(kuò)散與DNA任意部位結(jié)合,這種結(jié)合是松散的,并且是可逆的。隨后酶結(jié)合的DNA迅速被置換。這

62、個(gè)過程一直繼續(xù)下去,全酶不斷變化與DNA結(jié)合部位,直到與上啟動(dòng)子序列,隨即有疏松結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)槔喂探Y(jié)合,并且DNA雙鏈被局部揭開。 真核生物基因組遠(yuǎn)比原核生物更大,它們的RNA聚合酶也更為復(fù)雜。真核生物RNA聚合酶主要有三類:RNA聚合酶I 轉(zhuǎn)錄45SrRNA前體,經(jīng)轉(zhuǎn)錄后加工產(chǎn)生5.8SrRNA,18SrRNA和28SrRNA。RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄所有的mRNA前體和大多數(shù)SnRNA。RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄所tRNA,5SrRNA等小分子轉(zhuǎn)錄物。真核生物RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄過程大體于細(xì)菌相似,所不同的是真核生物RNA聚合酶自身不能識(shí)別和結(jié)合到啟動(dòng)子上,而需要在啟動(dòng)子上有轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶裝配

63、成活性轉(zhuǎn)錄復(fù)合物才能起始轉(zhuǎn)錄。 15.真核生物的轉(zhuǎn)錄與原核生物的主要差別為:① 原核生物功能相關(guān)的基因構(gòu)成操縱子,作為基因表達(dá)調(diào)控的單位。真核生物不組成操縱子,每個(gè)基因都有自己的啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)元件,單獨(dú)進(jìn)行轉(zhuǎn) 錄;② 原核生物只有少數(shù)種類調(diào)節(jié)元件,真核生物存在大量順式元件和反式因子,調(diào)節(jié)更為復(fù)雜;③ 原核生物常以負(fù)調(diào)節(jié)為主,調(diào)節(jié)因子活性常受變構(gòu)效應(yīng)調(diào)節(jié),真核生物以正調(diào)節(jié)為主,調(diào)節(jié)因子常受共價(jià)修飾,主要是磷酸化的調(diào)節(jié);④真核生物具有染色質(zhì)結(jié)構(gòu)上的調(diào)節(jié)。 16. RNA功能多樣性如下:① RNA在遺傳信息的翻譯中起著決定的作用;②RNA具有重要的催化功能和其它持家功能;③RNA轉(zhuǎn)錄后加工和修飾依賴于各類小RNA和其它蛋白質(zhì)復(fù)合物;④RNA對(duì)基因表達(dá)和細(xì)胞功能具有重要調(diào)節(jié)功能;⑤RNA在生物的進(jìn)化中起主要作用。 13

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