生物化學(xué)與分子生物學(xué)：第14章 DNA的生物合成

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1、第十四章第十四章 DNA的生物合成的生物合成DNA Replication1. DNA與染色體與染色體-DNA高度盤繞成基因組高度盤繞成基因組原核生物原核生物DNAl 真核生物染色體真核生物染色體DNA2. DNA的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu) DNA的生物合成又稱的生物合成又稱DNA復(fù)制。復(fù)制。 復(fù)制（復(fù)制（replication）是指遺傳物質(zhì)的傳代，是指遺傳物質(zhì)的傳代，以母鏈以母鏈DNA為模板，按照堿基配對原則指導(dǎo)為模板，按照堿基配對原則指導(dǎo)合成子鏈合成子鏈DNA的過程。的過程。復(fù)制復(fù)制親代親代DNA子代子代DNA 第一節(jié)第一節(jié) DNA復(fù)制的基本規(guī)律復(fù)制的基本規(guī)律 l DNA復(fù)制的方式為半保留復(fù)制復(fù)制的方式

2、為半保留復(fù)制 (semi- conservative replication) l DNA復(fù)制的形式為雙向復(fù)制復(fù)制的形式為雙向復(fù)制 (bidirectional replication) l DNA復(fù)制的過程為半不連續(xù)復(fù)制復(fù)制的過程為半不連續(xù)復(fù)制 (semi-discontinuous replication) 一、一、DNA 以半保留方式進行復(fù)制以半保留方式進行復(fù)制 （semiconservative replication） DNA復(fù)制時，母鏈復(fù)制時，母鏈DNA解開為兩股單鏈，解開為兩股單鏈，各自作為模板，按堿基配對規(guī)律合成與模各自作為模板，按堿基配對規(guī)律合成與模板互補的子鏈，形成子代板互

3、補的子鏈，形成子代DNA雙鏈，其中雙鏈，其中一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股單鏈則是合成的，故稱單鏈則是合成的，故稱半保留復(fù)制半保留復(fù)制。 n子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式: : 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 半保留復(fù)制的實驗依據(jù)半保留復(fù)制的實驗依據(jù) 1958年，年，Messelson 和和stahl 用實驗證實。用實驗證實。 1、把細菌放在含把細菌放在含15NH4Cl的培養(yǎng)液中培養(yǎng)的培養(yǎng)液中培養(yǎng)若干代，密度梯度離心分離出若干代，密度梯度離心分離出DNA是是含含15N的的重重DNA。 2、把含把含

4、15N-DNA的細菌放的細菌放14NH4Cl普通普通培培養(yǎng)液中培養(yǎng)。子一代的養(yǎng)液中培養(yǎng)。子一代的DNA是是中等密中等密度度DNA 。 3、繼續(xù)培育出子二代，其繼續(xù)培育出子二代，其DNA則是則是中等中等密度密度DNA與普通與普通DNA各占一半。各占一半。 DNA半保留復(fù)制的實驗證據(jù)半保留復(fù)制的實驗證據(jù)含含N15-DNA的細菌的細菌培養(yǎng)于培養(yǎng)于14NH4Cl培養(yǎng)液培養(yǎng)液 第一代第一代 第二代第二代梯度離心結(jié)果梯度離心結(jié)果培養(yǎng)于培養(yǎng)于14NH4Cl培養(yǎng)液培養(yǎng)液重重DNA普通普通DNA中等密中等密度度DNADNA半保留復(fù)制的意義半保留復(fù)制的意義l按半保留復(fù)制的方式，子代保留了親代按半保留復(fù)制的方式，子

5、代保留了親代DNA的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳過程的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳過程的相對保守性。的相對保守性。l遺傳的保守性是相對的，而不是絕對的。遺傳的保守性是相對的，而不是絕對的。自然界還存在著普遍的變異現(xiàn)象。自然界還存在著普遍的變異現(xiàn)象。AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈母鏈DNA復(fù)制過程中形成的復(fù)制過程中形成的復(fù)制叉復(fù)制叉子代子代DNA（動畫（動畫1

6、）lDNA復(fù)制時，從復(fù)制起始點復(fù)制時，從復(fù)制起始點(origin) )向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向相反的復(fù)制叉，稱為相反的復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制雙向復(fù)制。二、二、 DNA復(fù)制從起點的兩個方向延伸復(fù)制從起點的兩個方向延伸-雙雙 向向 復(fù)復(fù) 制制(bidirectional replication) l原核生物是單復(fù)制子雙向復(fù)制。其環(huán)形原核生物是單復(fù)制子雙向復(fù)制。其環(huán)形DNADNA為單復(fù)制子，只有一個復(fù)制起始點。為單復(fù)制子，只有一個復(fù)制起始點。l真核生物是多復(fù)制子雙向復(fù)制。其線形真核生物是多復(fù)制子雙向復(fù)制。其線形DNADNA有多個復(fù)制起始點，形成多個復(fù)制子。有多個

7、復(fù)制起始點，形成多個復(fù)制子。（復(fù)制子復(fù)制子是獨立完成復(fù)制的功能單位，一個是獨立完成復(fù)制的功能單位，一個復(fù)制起始點起始的復(fù)制起始點起始的DNADNA復(fù)制區(qū)域稱為復(fù)制區(qū)域稱為復(fù)制子復(fù)制子replicon ）。）。A. 環(huán)狀雙鏈環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點及復(fù)制起始點B. 復(fù)制中的兩個復(fù)制叉復(fù)制中的兩個復(fù)制叉C. 復(fù)制接近終止點復(fù)制接近終止點(termination, ter)oriterA B C原核生物原核生物DNA復(fù)制復(fù)制原核生物的原核生物的DNA雙向復(fù)制形成雙向復(fù)制形成結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)53oriorioriori535533553復(fù)制復(fù)制3真核生物真核生物DNA復(fù)制復(fù)制三、三、DNA 復(fù)制反應(yīng)呈半不連

8、續(xù)性復(fù)制反應(yīng)呈半不連續(xù)性3 5 3 5 解鏈方向解鏈方向3 5 3 3 5 前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈(leading strand)后隨鏈后隨鏈(lagging strand) 岡崎片段岡崎片段 前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈(leading strand) ：復(fù)制方向與解鏈：復(fù)制方向與解鏈方向一致的子鏈。領(lǐng)頭鏈復(fù)制是連續(xù)的。方向一致的子鏈。領(lǐng)頭鏈復(fù)制是連續(xù)的。 后隨鏈后隨鏈(lagging strand) ：復(fù)制方向與解鏈：復(fù)制方向與解鏈方向相反的子鏈。隨從鏈的復(fù)制是不連續(xù)的，方向相反的子鏈。隨從鏈的復(fù)制是不連續(xù)的，形成多個岡崎片段。形成多個岡崎片段。 岡崎片段（岡崎片段（Okazaki fragment）：1968年，

9、年，日本科學(xué)家岡崎用電鏡觀察到，原核生物大日本科學(xué)家岡崎用電鏡觀察到，原核生物大小在一千至二千核苷酸范圍，真核生物數(shù)百小在一千至二千核苷酸范圍，真核生物數(shù)百個核苷酸。復(fù)制中不連續(xù)的個核苷酸。復(fù)制中不連續(xù)的DNA片段。片段。第二節(jié)第二節(jié) DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓撲學(xué)變化復(fù)制的酶學(xué)和拓撲學(xué)變化參與參與DNA復(fù)制的酶與物質(zhì)：復(fù)制的酶與物質(zhì)： 1、底物、底物dNTPs（N: A , G , C , T ） 2、DNA聚合酶（聚合酶（DNA polymerase, DNA-pol) 3、模板、模板(template) 4、解螺旋酶（解鏈酶）（、解螺旋酶（解鏈酶）（helicase) 5、拓撲異構(gòu)酶（、拓撲異

10、構(gòu)酶（topoisomerase) 6、單鏈、單鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白SSB 7、引物酶（、引物酶（primase) 8、引物（、引物（primer) 9、 DNA連接酶（連接酶（ligase) 10、其他因子、其他因子1、復(fù)制的基本化學(xué)反應(yīng)：核苷酸和核苷酸之、復(fù)制的基本化學(xué)反應(yīng)：核苷酸和核苷酸之間，通過間，通過3,5磷酸二酯鍵的生成而逐一聚磷酸二酯鍵的生成而逐一聚合。反應(yīng)底物是合。反應(yīng)底物是 dNTP，加入單鏈的是，加入單鏈的是dNMP 。2、復(fù)制的方向性：新鏈只能從、復(fù)制的方向性：新鏈只能從5-端向端向3-端延端延長（所有新生成的長（所有新生成的RNA或或DNA單鏈其方向單鏈其方向都是都

11、是53，模板鏈與之反向互補平行）。，模板鏈與之反向互補平行）。3355模板鏈模板鏈新生鏈新生鏈復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)復(fù)制的化學(xué)反應(yīng) 243,5磷酸二酯鍵的生成磷酸二酯鍵的生成 一、一、DNA聚合酶催化脫氧核苷酸間的聚合聚合酶催化脫氧核苷酸間的聚合（DNA polymerase, DNA-pol) （一）原核生物的（一）原核生物的DNA聚合酶聚合酶 DNA-pol I DNA-pol II DNA- pol DNA聚合酶的多種活性聚合酶的多種活性5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A

12、 C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性: 5 3 外切酶活性外切酶活性:?能切除引物及突變的能切除引物及突變的 DNA片段。片段。能辨認錯配的堿基對，并將其水解。能辨認錯配的堿基對，并將其水解。原核生物的原核生物的DNA聚合酶聚合酶1、 DNA- pol ： 結(jié)構(gòu)：由結(jié)構(gòu)：由10種亞基組成的不對稱異聚合體。其種亞基組成的不對稱異聚合體。其中中組成核心酶。組成核心酶。 功能：功能：真正的復(fù)制酶真正的復(fù)制酶，亞基具聚合活性。亞基具聚合活性。 亞基有亞基有35核酸外切酶活性和堿核酸外切酶活性和堿 基選擇功能。基選擇功能。個核心酶個核心酶1個個 -復(fù)合物復(fù)合物（ 、 、 、 、 、 6種亞基）種亞基）

13、1對對 -亞基（可亞基（可滑動的滑動的DNA夾夾子）子）全酶結(jié)構(gòu)包括：全酶結(jié)構(gòu)包括：2、DNA-pol II 有有3 5核酸外切酶活性和聚合酶活性，主核酸外切酶活性和聚合酶活性，主要參與要參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)（損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)（SOS修復(fù)）。修復(fù)）。3、DNA-pol I 單一肽鏈的大分子，二級結(jié)構(gòu)以單一肽鏈的大分子，二級結(jié)構(gòu)以-螺旋為主，螺旋為主，從從A至至R共共18個個-螺旋肽段。螺旋肽段。I螺旋與螺旋與O螺旋之螺旋之間有較大的空隙，可容納間有較大的空隙，可容納DNA鏈。鏈。圖圖小片段：小片段：AF螺旋區(qū)螺旋區(qū)大片段（大片段（Klenow片段）：片段）：GR螺旋區(qū)螺旋區(qū)pol I

14、323個氨基酸個氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604個氨基酸個氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是分子生物片段是分子生物學(xué)常用的工具酶。學(xué)常用的工具酶。 DNA-pol I作用：作用：l 切除引物和突變片段；切除引物和突變片段； （53核酸外切酶活性）核酸外切酶活性）l 復(fù)制和修復(fù)中的空隙填補；復(fù)制和修復(fù)中的空隙填補； （DNA聚合酶活性）聚合酶活性）l 復(fù)制中的錯誤校讀。復(fù)制中的錯誤校讀。 （35核酸外切酶活性）核酸外切酶活性）5 A

15、G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 l 3 5 外切酶活性外切酶活性 l 5 3 外切酶活性外切酶活性?切除引物和突變的切除引物和突變的 DNA片段。片段。能辨認錯配的堿基對，并將其水解。能辨認錯配的堿基對，并將其水解。 （二）真核生物的（二）真核生物的DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶主要有聚合酶主要有5種。種。 DNA-pol：具引物酶活性：具引物酶活性(合成含合成含RNA+DNA 的引物的引物) DNA-pol：似：似DNA-pol (修復(fù)，低保真修復(fù)，低保真) D

16、NA-pol：線粒體：線粒體DNA復(fù)制酶復(fù)制酶 DNA-pol：真正的復(fù)制酶，似：真正的復(fù)制酶，似DNA-pol ， 并有解螺旋酶活性并有解螺旋酶活性 DNA-pol：似：似DNA-pol 真核生物和原核生物真核生物和原核生物DNA聚合酶的比較聚合酶的比較 E.Coli真核細胞真核細胞 功能功能填補復(fù)制中的填補復(fù)制中的DNA空隙，空隙，DNA修復(fù)和重組修復(fù)和重組復(fù)制中的校對，復(fù)制中的校對，DNA修復(fù)修復(fù) DNA修復(fù)修復(fù) 線粒體線粒體DNA合成合成 錯配修復(fù)（校對和填補缺口）錯配修復(fù)（校對和填補缺口）DnaG 引物酶引物酶 前導(dǎo)鏈和后隨鏈合成，錯配修復(fù)前導(dǎo)鏈和后隨鏈合成，錯配修復(fù)（一）復(fù)制的保真

17、性依賴正確的堿基選擇（一）復(fù)制的保真性依賴正確的堿基選擇u利用利用“錯配錯配”實驗發(fā)現(xiàn)，實驗發(fā)現(xiàn)，DNA pol 對核對核苷酸的參入（苷酸的參入（incorporation）具有選擇功能。）具有選擇功能。 uDNA pol 對嘌呤的不同構(gòu)型表現(xiàn)不同親對嘌呤的不同構(gòu)型表現(xiàn)不同親和力，因此實現(xiàn)其選擇功能。和力，因此實現(xiàn)其選擇功能。 二、二、DNA聚合酶的堿基選擇和校對聚合酶的堿基選擇和校對功能實現(xiàn)復(fù)功能實現(xiàn)復(fù) 制保真性制保真性u原核生物原核生物DNA -pol I、真核生物、真核生物DNA -pol 和真核生物和真核生物DNA -pol 具有具有35外外切酶活性，可以在復(fù)制過程中辨認并切除切酶活性

18、，可以在復(fù)制過程中辨認并切除錯配的堿基，對復(fù)制錯誤進行校正，這個錯配的堿基，對復(fù)制錯誤進行校正，這個過程叫過程叫錯配修復(fù)（錯配修復(fù)（mismatch repair）。u原核生物原核生物DNA -pol I 還具有還具有53外切外切酶活性，切除引物和突變片段酶活性，切除引物和突變片段 。（二）（二）DNA聚合酶的核酸外切酶活性辨認聚合酶的核酸外切酶活性辨認切除錯配堿基并加以校正切除錯配堿基并加以校正 DNA復(fù)制的保真性，依賴三種機制：復(fù)制的保真性，依賴三種機制： 遵守嚴格的堿基配對規(guī)律遵守嚴格的堿基配對規(guī)律; 聚合酶在復(fù)制延長中對堿基的選擇功能聚合酶在復(fù)制延長中對堿基的選擇功能; 復(fù)制出錯時有即

19、時的校讀功能。復(fù)制出錯時有即時的校讀功能。 三、三、 DNA解鏈伴有解鏈伴有DNA分子拓撲學(xué)變化分子拓撲學(xué)變化 (一）參與解鏈的酶與因子一）參與解鏈的酶與因子 主要有解螺旋酶、引物酶和單鏈主要有解螺旋酶、引物酶和單鏈DNA 結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白 1、解螺旋酶、解螺旋酶（helicase） 又稱解鏈酶又稱解鏈酶,復(fù)制蛋白復(fù)制蛋白rep(replication), DnaB 。 其作用是利用其作用是利用ATP供能來解開供能來解開DNA雙鏈雙鏈。 （動畫（動畫2） 復(fù)制起始時復(fù)制起始時DnaA辨認辨認E.coli上復(fù)制起上復(fù)制起始點始點oriC（origin C），），DnaC輔助輔助DnaB(解螺旋酶

20、解螺旋酶)結(jié)合起始點并打開雙鏈。結(jié)合起始點并打開雙鏈。 （DnaA DnaB DnaC 分別是分別是dnaA dnaB dnaC基因產(chǎn)物基因產(chǎn)物) 。E.coli基因圖基因圖E. Coli 基因圖基因圖 又稱又稱 DnaG （ dnaG 基因產(chǎn)物）?；虍a(chǎn)物）。 作用是催化形成短片段的作用是催化形成短片段的RNA引物，在引物，在其其3-OH端開始復(fù)制。端開始復(fù)制。 引物引物 (primer)：由引物酶催化合成的短由引物酶催化合成的短鏈鏈RNA分子。約十數(shù)個至數(shù)十個核苷分子。約十數(shù)個至數(shù)十個核苷酸。酸。 2、引物酶（、引物酶（primase） 3、單鏈、單鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白 （single

21、 stranded DNA binding protein，SSB） 由由177個氨基酸殘基組成的相同四聚體，個氨基酸殘基組成的相同四聚體， 結(jié)合單鏈結(jié)合單鏈DNA的跨度約的跨度約32個核苷酸單位。復(fù)個核苷酸單位。復(fù)制過程中不斷與制過程中不斷與單鏈單鏈DNA結(jié)合和脫離。結(jié)合和脫離。 作用是在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)作用是在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護單鏈并保護單鏈的完整。的完整。(二二) DNA拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶（DNA topoisomerase） 拓撲拓撲：指物體或圖像作彈性移位而又保持物：指物體或圖像作彈性移位而又保持物 體不變的性質(zhì)。體不變的性質(zhì)。 復(fù)制解鏈中的復(fù)制解鏈中的DN

22、A分子繞雙螺旋軸高速解鏈分子繞雙螺旋軸高速解鏈旋轉(zhuǎn)（旋轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)（旋轉(zhuǎn)100次次/秒），會造成解鏈前方的秒），會造成解鏈前方的DNA分子纏繞打結(jié)，通過拓撲異構(gòu)酶的作用，分子纏繞打結(jié)，通過拓撲異構(gòu)酶的作用，以改變以改變DNA分子拓撲構(gòu)象，解除分子拓撲構(gòu)象，解除DNA分子纏分子纏繞打結(jié)。繞打結(jié)。 108局部解鏈后局部解鏈后復(fù)制過程正超螺旋的形成：復(fù)制過程正超螺旋的形成：l 拓撲酶拓撲酶I 切斷切斷DNA雙鏈中一股，切口處的斷端繞雙鏈中一股，切口處的斷端繞螺旋軸按照松弛螺旋的方向轉(zhuǎn)動，解除螺旋軸按照松弛螺旋的方向轉(zhuǎn)動，解除DNA解鏈旋轉(zhuǎn)中的纏繞打結(jié)，適當時候解鏈旋轉(zhuǎn)中的纏繞打結(jié)，適當時候又把切口封閉。催

23、化反應(yīng)不需又把切口封閉。催化反應(yīng)不需ATP。l 拓撲酶拓撲酶II 1. 無無ATP時，切斷時，切斷DNA分子雙鏈某一部分子雙鏈某一部 位，通過切口使超螺旋松馳，解除解位，通過切口使超螺旋松馳，解除解 鏈過程中的纏繞打結(jié)。鏈過程中的纏繞打結(jié)。 2. 在利用在利用ATP供能情況下，斷端在拓撲供能情況下，斷端在拓撲 酶催化下恢復(fù)連接。酶催化下恢復(fù)連接。（動畫（動畫3） 作用：連接作用：連接DNA單鏈單鏈3-OH末端和相鄰末端和相鄰DNA單鏈的單鏈的5-P末端末端,使二者生成使二者生成3,5-磷磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA單鏈連單鏈連成完整的鏈。需成完整的鏈。需ATP。

24、 圖圖四、四、DNA連接酶連接復(fù)制中產(chǎn)生的單連接酶連接復(fù)制中產(chǎn)生的單鏈缺口鏈缺口（DNA ligase）HO5335DNA連接酶連接酶ATPADP5353POO-O-OPOO-O-O（動畫（動畫4）提供核糖提供核糖3 -OH提供提供5 -P結(jié)果結(jié)果DNA聚合酶聚合酶引物或延長中的引物或延長中的新鏈新鏈游離游離dNTP去去PPi(dNTP)n+1連接酶連接酶復(fù)制中不連續(xù)的兩條單鏈復(fù)制中不連續(xù)的兩條單鏈不連續(xù)不連續(xù)連續(xù)鏈連續(xù)鏈拓撲酶拓撲酶切斷、整理后的兩鏈切斷、整理后的兩鏈改變拓撲狀態(tài)改變拓撲狀態(tài)DNA聚合酶，拓撲酶和連接酶催化聚合酶，拓撲酶和連接酶催化3 ,5 -磷酸二酯鍵生成的比較磷酸二酯鍵生

25、成的比較第三節(jié)第三節(jié) 原核生物原核生物DNA生物合成過程生物合成過程 一、復(fù)制的起始一、復(fù)制的起始l復(fù)制起始點結(jié)構(gòu)：復(fù)制起始點結(jié)構(gòu)：E.coli固定的復(fù)制起始固定的復(fù)制起始 點點OriC跨度為跨度為245bp，包含有，包含有3組串連重組串連重復(fù)序列和復(fù)序列和2對反向重復(fù)序列。對反向重復(fù)序列。E.coli復(fù)制起始點復(fù)制起始點 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201

26、209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串聯(lián)重復(fù)序列串聯(lián)重復(fù)序列 反向重復(fù)序列反向重復(fù)序列5 3 5 3 l復(fù)制起始過程：復(fù)制起始過程： DnaA辨認結(jié)合于辨認結(jié)合于OriC重復(fù)序列，重復(fù)序列，DnaC輔輔助助DnaB結(jié)合于結(jié)合于OriC附近，解開局部雙鏈附近，解開局部雙鏈 ，置換出置換出DnaA，DnaG（引物酶）進入，形成（引物酶）進入，形成引發(fā)體引發(fā)體。 繼續(xù)解鏈，繼續(xù)解鏈，SSB結(jié)合保護解開的單鏈，拓結(jié)合保護解開的單鏈，拓撲異構(gòu)酶發(fā)揮作用，引物酶催化生成撲異構(gòu)酶發(fā)揮作用，引物酶催化生成RNA引引物，復(fù)制起始完成物，復(fù)制起始完成 。3 5 Dna

27、 CDna B DnaG3 5 ori CDnaB, DnaC ,DnaG與與OriC共同形成引發(fā)體共同形成引發(fā)體（動畫（動畫5）3 5 3 5 引物引物3 HO5SSBDna CDna B引物酶引物酶3 HO引物酶引物酶5復(fù)制起始完成復(fù)制起始完成拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶二、復(fù)制的延長二、復(fù)制的延長 復(fù)制的延長是在復(fù)制的延長是在DNA-pol催化下以催化下以dNTP為原料，以為原料，以dNMP方式逐個加入到引物或延方式逐個加入到引物或延長中的新鏈長中的新鏈3-OH末端上，逐個形成末端上，逐個形成3,5-磷磷酸二酯鍵酸二酯鍵, 復(fù)制方向復(fù)制方向53，復(fù)制特點：半不，復(fù)制特點：半不連續(xù)性復(fù)制。連續(xù)性復(fù)

28、制。圖圖1 圖圖2 DNA復(fù)制速度相當快，復(fù)制速度相當快，E.coli 20分鐘可繁殖分鐘可繁殖一代，每秒可參入一代，每秒可參入2500個核苷酸。個核苷酸。3 5 3 5 引物引物5SSBDna B引物引物酶酶5復(fù)制延長復(fù)制延長拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶5聚合酶聚合酶（動畫（動畫6）復(fù)制延長過程復(fù)制延長過程5 5 5 RNA酶酶OHP5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA連接酶連接酶子鏈上不連續(xù)性片段的連接子鏈上不連續(xù)性片段的連接 三、復(fù)制的終止三、復(fù)制的終止 原核生物環(huán)狀原核生物環(huán)狀DNA采取單復(fù)制子雙向復(fù)采取單復(fù)制子雙向復(fù)制。領(lǐng)頭鏈和隨從鏈上的制。領(lǐng)頭鏈和隨從鏈

29、上的RNA引物被引物被RNA酶（或酶（或DNA-pol I）水解，空隙由）水解，空隙由DNA-pol I來催化填補，來催化填補，DNA連接酶將各片段連接連接酶將各片段連接成完整的成完整的環(huán)狀環(huán)狀新鏈，新鏈，形成兩個完整的形成兩個完整的環(huán)狀環(huán)狀DNA。 ori53原核生物復(fù)制終止原核生物復(fù)制終止 ter ter ori33555335355 3 3 5 5 3 3 5 +5 3 3 3 3 5 5 5 （動畫（動畫7）細胞周期細胞周期DNADNA合成期合成期G1G2SM第四節(jié)第四節(jié) 真核生物的真核生物的DNA生物合成生物合成 細胞周期可分為：細胞周期可分為：S期期（Synthetic phase

30、, DNA合成期）合成期）G2期期（ Gap , DNA合成后期）合成后期）M期（期（mitotic phase, 有絲分裂期有絲分裂期）G1期（期（Gap , DNA合成前期）合成前期）DNA在每個細胞周期只復(fù)制一次在每個細胞周期只復(fù)制一次1. 真核生物真核生物DNADNA復(fù)制是多復(fù)制子雙向復(fù)制，復(fù)制是多復(fù)制子雙向復(fù)制，有多個起始點；有多個起始點；2. 復(fù)制有時序性，復(fù)制子以分組方式激活復(fù)制有時序性，復(fù)制子以分組方式激活而不是同步起動；而不是同步起動；一、復(fù)制的起始一、復(fù)制的起始 真核生物復(fù)制起始與原核生物基本相似，真核生物復(fù)制起始與原核生物基本相似，有以下特點：有以下特點：3. 復(fù)制起始點

31、序列較原核復(fù)制起始點序列較原核oriC短。短。 酵母復(fù)制起始點含酵母復(fù)制起始點含11bp的自主復(fù)制序列：的自主復(fù)制序列：A(T)TTTATA(G)TTTA(T)。4. DNA-pol具引物酶活性，具引物酶活性，DNA-pol具解具解螺旋酶活性。螺旋酶活性。5. 增殖細胞核抗原增殖細胞核抗原(PCNA)參與復(fù)制起始。參與復(fù)制起始。其作用與原核其作用與原核DNA- pol的的亞基相似，亞基相似，形成鉗卡形成鉗卡DNA的夾子的夾子 。二、復(fù)制的延長二、復(fù)制的延長真核生物復(fù)制延長與原核生物基本相似，真核生物復(fù)制延長與原核生物基本相似，有以下特點：有以下特點：1 1、DNA-pol生成引物（生成引物（R

32、NA+小段小段DNA）。）。2 2、DNA-pol在增殖細胞核抗原在增殖細胞核抗原PCNA協(xié)助下協(xié)助下合成合成DNADNA子鏈子鏈 。3 3、引物和岡崎片段較原核生物短，單個復(fù)制引物和岡崎片段較原核生物短，單個復(fù)制子復(fù)制速度慢，但總體速度不慢。子復(fù)制速度慢，但總體速度不慢。3 5 5 3 前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈3 5 3 5 親代親代DNA后隨鏈后隨鏈引物引物核小體核小體三、真核生物三、真核生物DNA合成后立即組裝成核小體合成后立即組裝成核小體四、端粒酶參與解決染色體末端復(fù)制四、端粒酶參與解決染色體末端復(fù)制 1、真核生物復(fù)制終止、真核生物復(fù)制終止 真核生物復(fù)制終止與原核生物基本相似。真核生物復(fù)制終止與原

33、核生物基本相似。 不同點：不同點： DNA為線形，復(fù)制結(jié)束時兩條為線形，復(fù)制結(jié)束時兩條新生子鏈的新生子鏈的5端的引物切下后形成的空隙需端的引物切下后形成的空隙需端粒酶修補并形成端粒。端粒酶修補并形成端粒。n線性線性DNA復(fù)制的末復(fù)制的末端端 53端粒酶端粒酶RNA533 OH53逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄反折反折5DNA-polDNA-pol，連接酶，連接酶TTTGGGTTTGG-OH 3AAACCCAAACCCAAACCCTTTGGGTTTGGGTTTGGG-OH3AAACCCAAACCCAAACCC端粒酶端粒酶RNA2、端粒（、端粒（telomere） 是真核生物染色體是真核生物染色體線性線性DNA分子

34、末端分子末端的膨大的粒狀結(jié)構(gòu)，由的膨大的粒狀結(jié)構(gòu)，由DNA和結(jié)合蛋白和結(jié)合蛋白形成。在維持染色體的穩(wěn)定性和形成。在維持染色體的穩(wěn)定性和DNA復(fù)復(fù)制的完整性有重要作用。制的完整性有重要作用。 端粒端粒DNA序列共同特點是富含序列共同特點是富含T、G短短序列的重復(fù)序列序列的重復(fù)序列(Tn G n )x 3、端粒酶、端粒酶(telomerase) 是一種是一種RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。蛋白質(zhì)復(fù)合物。 端粒酶端粒酶RNA (An C n )x 端粒酶協(xié)同蛋白端粒酶協(xié)同蛋白 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶端粒酶端粒酶端粒酶以其端粒酶以其RNA為模板，在其協(xié)同蛋白參為模板，在其協(xié)同蛋白參與下，其逆轉(zhuǎn)錄酶催化生成

35、與下，其逆轉(zhuǎn)錄酶催化生成DNA單鏈。單鏈。l端粒酶借助其端粒酶借助其RNA與與DNA單鏈有互補單鏈有互補鹼基序列而辨認結(jié)合。鹼基序列而辨認結(jié)合。 l以以RNA為模板的逆轉(zhuǎn)錄，進行母鏈為模板的逆轉(zhuǎn)錄，進行母鏈DNA的延長。的延長。 l延長以后的單鏈反折，延長以后的單鏈反折，DNA-pol以其以其3- OH末端復(fù)制末端復(fù)制DNA 單鏈，填補引物單鏈，填補引物切除后的缺失，切除后的缺失，DNA連接酶完成連接。連接酶完成連接。 端粒酶（端粒酶（TBP）類似于反轉(zhuǎn)錄酶）類似于反轉(zhuǎn)錄酶，其中的其中的RNA與與DNA的的3端端互補并作為合成互補并作為合成cDNA的模板延長的的模板延長的 T2G4 3-端端

36、作為作為5-端端DNA合成的模板合成的模板端粒酶端粒酶(telomerase)的作用機制的作用機制爬行模型爬行模型通過通過TGTG鏈的回折形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（鏈的回折形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（GGGG氫鍵）氫鍵）實現(xiàn)實現(xiàn)端粒酶位置的調(diào)整端粒酶位置的調(diào)整復(fù)制子鏈復(fù)制子鏈進一步加工進一步加工第五節(jié)第五節(jié) 逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式 一、逆轉(zhuǎn)錄一、逆轉(zhuǎn)錄 (reverse transcription)l逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄: :以以RNA為模板指導(dǎo)合成為模板指導(dǎo)合成DNA的過的過程，因與轉(zhuǎn)錄方向相反故稱逆轉(zhuǎn)錄（反程，因與轉(zhuǎn)錄方向相反故稱逆轉(zhuǎn)錄（反轉(zhuǎn)錄）。轉(zhuǎn)錄）。l19701970年，年，H. Temin和和D.

37、 Baltimore分別從分別從R N A病毒中發(fā)現(xiàn)病毒中發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶( r e v e r s e transcriptase)。此類此類RNA病毒稱病毒稱逆轉(zhuǎn)錄病逆轉(zhuǎn)錄病毒毒(retrovirus)。 l逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 有有3種酶活性種酶活性 1. 以以RNA為模板的為模板的DNA聚合酶活性。聚合酶活性。 2. RNase活性，水解雜化鏈上的活性，水解雜化鏈上的RNA。 3. 以以DNA 為模板的為模板的DNA聚合酶活性。聚合酶活性。l細胞中的病毒逆轉(zhuǎn)錄細胞中的病毒逆轉(zhuǎn)錄 逆轉(zhuǎn)錄病毒在宿主細胞中逆轉(zhuǎn)錄生成雙逆轉(zhuǎn)錄病毒在宿主細胞中逆轉(zhuǎn)錄生成雙鏈鏈DNA，此又稱，此又稱前病毒。前病毒

38、。 前病毒可在細胞內(nèi)獨立繁殖，利用宿前病毒可在細胞內(nèi)獨立繁殖，利用宿主主RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄生成病毒聚合酶轉(zhuǎn)錄生成病毒RNA，并翻譯，并翻譯病毒蛋白質(zhì)，組裝成大量新病毒。病毒蛋白質(zhì)，組裝成大量新病毒。 前病毒前病毒DNA也可整合到宿主細胞基因組也可整合到宿主細胞基因組中，隨宿主基因復(fù)制和表達。中，隨宿主基因復(fù)制和表達。逆轉(zhuǎn)錄病毒細胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄病毒細胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄RNA 模板模板逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA 雜雜化雙鏈化雙鏈逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶細胞細胞RNA酶酶單鏈單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈雙鏈DNA二、逆轉(zhuǎn)錄研究的意義二、逆轉(zhuǎn)錄研究的意義 l逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生物學(xué)逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄

39、現(xiàn)象，是分子生物學(xué)研究中的重大發(fā)現(xiàn)，發(fā)展了中心法則。研究中的重大發(fā)現(xiàn)，發(fā)展了中心法則。 l逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，RNA同樣兼有遺傳信息傳代與表達功能同樣兼有遺傳信息傳代與表達功能。l對逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究，拓寬了病毒致癌對逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究，拓寬了病毒致癌理論和病毒性疾病的研究（艾滋?。?。理論和病毒性疾病的研究（艾滋?。?。l逆轉(zhuǎn)錄應(yīng)用于基因工程中（試管內(nèi)合成逆轉(zhuǎn)錄應(yīng)用于基因工程中（試管內(nèi)合成cDNA）。）。 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶A AA AT T T TAAAASISI核酸酶核酸酶 Klenow片段片段堿水解堿水解T T T T以以mRNA為模板，經(jīng)逆為模板，經(jīng)

40、逆轉(zhuǎn)錄合成雙鏈轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA (complementary DNA 。是基因工程獲取目的是基因工程獲取目的基 因 的 一 種 方 法基 因 的 一 種 方 法（cDNA法）法）。 試管內(nèi)合成試管內(nèi)合成cDNA三、真核生物線粒體按三、真核生物線粒體按D環(huán)方式復(fù)制環(huán)方式復(fù)制D D環(huán)復(fù)制環(huán)復(fù)制( (D-loop replication) ) 是是線粒體線粒體DNA的復(fù)制形式。因復(fù)制中呈的復(fù)制形式。因復(fù)制中呈字母字母D D形狀得名。形狀得名。 線粒體線粒體DNA復(fù)制起始點不在雙鏈同一位復(fù)制起始點不在雙鏈同一位點，內(nèi)外環(huán)復(fù)制有時序差，復(fù)制需引物。點，內(nèi)外環(huán)復(fù)制有時序差，復(fù)制需引物。 先在內(nèi)環(huán)復(fù)制起始點以內(nèi)環(huán)為模板復(fù)制，先在內(nèi)環(huán)復(fù)制起始點以內(nèi)環(huán)為模板復(fù)制，至外環(huán)復(fù)制起始點，以外環(huán)為模板反向復(fù)至外環(huán)復(fù)制起始點，以外環(huán)為模板反向復(fù)制，形成兩個子代環(huán)狀制，形成兩個子代環(huán)狀DNA。dNTPDNA-pol D D 環(huán)環(huán) 復(fù)復(fù) 制制oriori