生化小結(jié)：第十章 DNA的生物合成

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1、生 化 小 結(jié) 第十章 DNA的生物合成 一．DNA復(fù)制(replication)：是指遺傳物質(zhì)的傳代，以母鏈DNA為模板合成子鏈DNA的過(guò)程。 分子基礎(chǔ)：堿基互補(bǔ)配對(duì)和DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。 化學(xué)本質(zhì)：酶促反應(yīng)。 參與物質(zhì)：酶和蛋白質(zhì)因子。 二．半保留復(fù)制是DNA復(fù)制的基本特征。 1.半保留復(fù)制(semi-conservative replication)：DNA生物合成時(shí)，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板(template)按堿基配對(duì)規(guī)律，合成與模板互補(bǔ)的子鏈。子代細(xì)胞的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過(guò)來(lái)，另一股單鏈則完全從新合成。兩個(gè)子細(xì)胞的DNA都和親代D

2、NA堿基序列一致。 2.意義：按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。 三．DNA復(fù)制從起始點(diǎn)向兩個(gè)方向延伸形成雙向復(fù)制。 1.雙向復(fù)制：原核生物復(fù)制時(shí)，DNA從起始點(diǎn)(origin)向兩個(gè)方向解鏈，形成兩個(gè)延伸方向相反的復(fù)制叉。 2.復(fù)制子(replicon)：真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多復(fù)制子的復(fù)制。習(xí)慣上把兩個(gè)相鄰起始點(diǎn)之間的距離定為一個(gè)復(fù)制子(replicon) 。復(fù)制子是獨(dú)立完成復(fù)制的功能單位。 四．DNA一股子鏈復(fù)制的方向與解鏈方向相反導(dǎo)致半不連續(xù)復(fù)制。 1.DNA復(fù)制是有方向性

3、：總是沿著子鏈的5’--3’方向合成，這種方向的形成取決于DNA聚合酶的聚合活性，在同一個(gè)復(fù)制叉上只有一個(gè)解鏈方向。 2.順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，這股鏈稱為領(lǐng)頭鏈(leading strand)。 3.另一股鏈因?yàn)閺?fù)制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長(zhǎng)，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為隨從鏈(lagging strand) 。復(fù)制中的不連續(xù)片段稱為岡崎片段(okazaki fragment)。 4.領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)性。 五．參與DNA復(fù)制的物質(zhì)：底物(dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、聚合酶(依賴DNA的

4、DNA聚合酶，簡(jiǎn)寫為DNA-pol)、模板(解開成單鏈的DNA母鏈)、引物(提供3’-OH末端使dNTP可以依次聚合)、其他的酶和蛋白質(zhì)因子 DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué) 一．核苷酸和核苷酸之間生成磷酸二酯鍵是復(fù)制的基本化學(xué)反應(yīng)，(dNMP)n + dNTP → (dNMP)n+1 + PPi。 1.DNA聚合酶（DNA-pol）催化核苷酸之間聚合?；钚裕?’--5’的聚合活性，核酸外切酶活性（3’--5’外切酶能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對(duì)，并將其水解；5’--3’外切酶能切除突變的 DNA片段）。 2.原核生物的DNA聚合酶分為DNA-polⅠ、DNA-polⅡ、DNA-polⅢ三型，

5、都具有5`——3`聚合的活性和3`——5`核酸外切酶的活性。 DNA-polⅠ：只能催化延長(zhǎng)約20核苷酸左右；對(duì)復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對(duì)復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。大片段 小片段 結(jié)構(gòu) DNA-polⅡ：DNA-pol II基因發(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活；在I和III缺失情況下暫時(shí)起作用；對(duì)模板的要求不高，它參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。 DNA-polⅢ：活性遠(yuǎn)高于I，是原核生物復(fù)制延長(zhǎng)中真正起催化作用的酶。 結(jié)構(gòu) 3.常見的真核細(xì)胞DNA聚合酶有DNA-pola（起始引發(fā)，有引物酶活性）、DNA-polb（參與低保真度的復(fù)制）、DNA-polg

6、（在線粒體DNA復(fù)制中起催化作用）、DNA-pold（延長(zhǎng)子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性）、DNA-pole（在復(fù)制過(guò)程中起校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口的作用）五種。 二. 保真性的酶學(xué)依據(jù)` DNA-pol的核酸外切酶的校讀活性和堿基選擇功能。 核酸外切酶(exonuclease)：能從核酸鏈的末端把核苷酸依次水解出來(lái)的酶，外切酶是有方向性的。 堿基選擇:DNA聚合酶靠其大分子結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)非共價(jià)（氫鍵）與共價(jià)（磷酸二酯鍵）鍵的有序形成 嘌呤應(yīng)處于反式構(gòu)型 DNA-pol DNA復(fù)制的保真性至少要依賴三種機(jī)制。（遵守嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律；聚合酶在復(fù)制延

7、長(zhǎng)時(shí)對(duì)堿基的選擇功能；復(fù)制出錯(cuò)時(shí)DNA-pol的及時(shí)校讀功能） 三．復(fù)制中的分子解鏈伴有DNA 分子拓?fù)鋵W(xué)變化。 A 解鏈,維持單鏈相關(guān)酶 1.解螺旋酶（helicase)：利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈。Rep DnaB 2.引物酶：依賴DNA的RNA聚合酶。復(fù)制起始時(shí)催化生成RNA引物的酶。這一小段RNA作為復(fù)制的引物，提供3’-OH末端，使DNA-pol能夠催化dNTP聚合。 利福平 是RNA-pol特異抑制劑 3.單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)：在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)，保護(hù)單鏈的完整。117AA同源4聚體 ，結(jié)合約32個(gè)核

8、苷酸。協(xié)同效應(yīng) B DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶改變DNA超螺旋狀態(tài)、理順DNA鏈。包括拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，既能水解 、又能連接磷酸二酯鍵。 1.拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ作用機(jī)制：切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時(shí)候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)；反應(yīng)不需ATP。 2.拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ作用機(jī)制：切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過(guò)切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛；利用ATP供能，連接斷端， DNA分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。 相關(guān)概念： 正超螺旋：在復(fù)制過(guò)程中，DNA每復(fù)制10bp，復(fù)制叉前方的模板DNA雙螺旋就要繞其長(zhǎng)軸旋轉(zhuǎn)一周，產(chǎn)生正超螺旋 DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶功能

9、 消除正超螺旋，使復(fù)制叉能夠順利前進(jìn)。 維持E. coli、噬菌體和質(zhì)粒DNA復(fù)制起始模板DNA負(fù)超螺旋狀態(tài)。 環(huán)形染色體復(fù)制后產(chǎn)生的兩個(gè)子染色體連環(huán)體解連環(huán)。 四．DNA連接酶連接DNA雙鏈中的單鏈缺口。ATP 1.作用方式：連接DNA鏈3’-OH末端和相鄰DNA鏈5’-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。 2.功能: DNA連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用 在DNA修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用, 也是基因工程的重要工具酶之一。 DNA的生物合成過(guò)程 原核生物

10、DNA 復(fù)制起始：DNA解鏈形成引發(fā)體。 引物合成 1.DNA解開成單鏈，提供模板：E.coli復(fù)制起始點(diǎn) oriC。識(shí)別區(qū)（3串聯(lián)）和富含AT區(qū)（2反向重復(fù)） Dna A（4聚） 結(jié)合AT區(qū)，多聚 Dna B 解旋置換C協(xié)同>>復(fù)制叉的形成 反向重復(fù)序列由兩個(gè)相同順序的互補(bǔ)拷貝在同一DNA鏈上反向排列而成。變性后再?gòu)?fù)性時(shí)，同一條鏈內(nèi)的互補(bǔ)的拷貝可以形成鏈內(nèi)堿基配對(duì)，形成發(fā)夾式或“+”字形結(jié)構(gòu)。 串聯(lián)重復(fù)序列是指2～200個(gè)堿基左右的核心重復(fù)單位，以頭尾相串聯(lián)的方式重復(fù)多次所組成的重復(fù)序列。它廣泛存在于真核生物和

11、一些原核生物的基因組中，并表現(xiàn)出種屬、堿基組成等的特異性。 2.形成引發(fā)體，合成引物，提供3’-OH末端：含有解螺旋酶、DnaBC蛋白、引物酶（DNAG）和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。 復(fù)制延長(zhǎng)：復(fù)制的延長(zhǎng)指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個(gè)加入引物或延長(zhǎng)中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。 1.領(lǐng)頭鏈的合成：領(lǐng)頭鏈的子鏈沿著5￠→3￠方向可以連續(xù)地延長(zhǎng)。 2.隨從鏈的合成：4階段 引發(fā)酶(Dna G) 折疊繞環(huán) 復(fù)制 修補(bǔ) 3.同一復(fù)制叉上領(lǐng)頭鏈和隨從鏈由相同的DNA-po

12、l催化延長(zhǎng)。 復(fù)制終止：切除引物、填補(bǔ)空缺、連接切口。 真核生物的DNA生物合成 概述 特點(diǎn): 1.細(xì)胞能否分裂，決定于進(jìn)入S期及M期這兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。G1→S及G2→M的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關(guān)；2.蛋白激酶通過(guò)磷酸化激活或抑制各種復(fù)制因子而實(shí)施調(diào)控作用。 真核生物和原核生物合成差異 真核生物以復(fù)制子為單位各自復(fù)制，復(fù)制子多、岡崎片段短、復(fù)制叉前進(jìn)速度慢 DNA復(fù)制從引發(fā)進(jìn)入延伸階段發(fā)生DNA聚合酶a/d轉(zhuǎn)換 切除岡崎片段RNA引物的是核酸酶RNAse HⅠ和FEN1等 一.真核生物復(fù)制的起始,與原核基本相似。 1. 概述:

13、 真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多復(fù)制子復(fù)制。復(fù)制有時(shí)序性，即復(fù)制子以分組方式激活而不是同步起動(dòng)。復(fù)制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）參與。還需拓?fù)涿负蛷?fù)制因子(RF)。PCNA起關(guān)鍵作用.自主復(fù)制序列（ARS 11BP 富含AT） 2. 增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）在復(fù)制起始和延長(zhǎng)中起關(guān)鍵作用。 PCNA: 是一種酸性蛋白，分子量36KD，在DNA復(fù)制時(shí)為 DNA聚合酶的輔助物，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入增殖周期時(shí)，此蛋白即已出現(xiàn)。它是細(xì)胞增殖周期的標(biāo)記物，尤其是S期。 結(jié)構(gòu): 同源三聚體，可形成閉合環(huán)形的可滑動(dòng)DNA夾子(具有與E.coli DNA 聚合酶Ⅲ的β

14、亞基相同的功能和相似的構(gòu)象) 作用: 在RFC的作用下PCNA結(jié)合于引物－模板鏈； PCNA是Pol d的進(jìn)行性因子，使Pol d獲得持續(xù)合成能力。 PCNA是協(xié)調(diào)DNA復(fù)制、損傷修復(fù)、表觀遺傳和細(xì)胞周期調(diào)控的核心因子。 PCNA水平是檢測(cè)細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)。 PCNA能激活Pol e。 3.調(diào)節(jié) 關(guān)鍵點(diǎn):進(jìn)入S期及M期, G1→S及G2→M的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關(guān)。 調(diào)節(jié)因子:蛋白激酶通過(guò)磷酸化激活或抑制各種復(fù)制因子而實(shí)施調(diào)控作用。相關(guān)的激酶都有調(diào)節(jié)亞基即細(xì)胞周期蛋白(cyclin)，和催化亞基即細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(CDK)。哺乳類動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)還發(fā)現(xiàn)天然抑制CDK的蛋白質(zhì)，

15、例如錨蛋白(ankynin)是CDK4的特異性抑制物，P21蛋白能抑制多種CDK。錨蛋白 和P21蛋白的抑制/活化可使細(xì)胞周期開放/關(guān)閉（S期），因此被形容為細(xì)胞周期的檢查點(diǎn)(check point)蛋白。>>>與癌基因聯(lián)系 二.真核生物復(fù)制的延長(zhǎng),發(fā)生DNA聚合酶α/δ轉(zhuǎn)換。 DNA-pol δ和pol α分別兼有解螺旋酶和引物酶活性。在復(fù)制叉及引物生成后，DNA-pol δ通過(guò)PCNA的協(xié)同作用，逐步取代polα，在RNA引物的3’-OH基礎(chǔ)上連續(xù)合成領(lǐng)頭鏈。隨從鏈引物也由polα催化合成。然后由PCNA協(xié)同，polδ置換polα，繼續(xù)合成DNA子鏈。 引物有DNA，領(lǐng)頭鏈的復(fù)制只限

16、于半個(gè)復(fù)制子的程度？？ 拓?fù)洚悩?gòu)酶，去除負(fù)超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除復(fù)制叉前方產(chǎn)生的正超螺旋 TolⅠ和TolⅡ DNA雙螺旋解鏈，參與組裝引發(fā)體 DNA解旋酶 連接岡崎片段 DNA連接酶Ⅰ 核酸酶(內(nèi)切)，切除RNA引物 先切 RNAse HⅠ 核酸酶(內(nèi)切 53外切) ，切除RNA引物 后切 ) FEN1 DNA復(fù)制，核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù) Pol d/e 合成RNA-DNA引物 Pol a/引發(fā)酶 有依賴DNA的ATPase活性，結(jié)合于引物-模板鏈，激活DNA聚合酶，促使PCNA結(jié)合于引物-模板鏈 RFC 激活DNA聚合酶和RF

17、C的ATPase活性 PCNA 單鏈DNA結(jié)合蛋白，激活DNA聚合酶，使解旋酶容易結(jié)合DNA RPA 功 能 蛋白質(zhì) 三.端粒酶參與解決染色體末端復(fù)制問(wèn)題。 1. 染色體DNA呈線狀，復(fù)制在末端停止 復(fù)制中岡崎片段的連接，復(fù)制子之間的連接； 染色體兩端DNA子鏈上最后復(fù)制的RNA引物，去除后留下空隙。（未復(fù)制ssDNA） 2. 端粒(telomere)：指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)。 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成；末端DNA序列是多次重復(fù)的富含G、C堿基的短序列。 人TTAGG 功能：維持染色體的穩(wěn)定性，維持DNA

18、復(fù)制的完整性。 3. 端粒酶(telomerase) 是一種核糖核蛋白（RNP） 以自己的RNA組分作為模板，以染色體的3￠端ssDNA（后隨鏈模板）為引物，將端粒序列添加于染色體的3￠端。這些新合成的DNA為單鏈。 由端粒酶RNA(hTR)、端粒酶協(xié)同蛋白(hTP1)、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTRT)組成。 4. 端粒酶的催化延長(zhǎng)作用：爬行模型。GG發(fā)夾 3端反折 其他轉(zhuǎn)錄 一.逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象: RNA 模板經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶生成DNA-RNA雜化雙鏈，接著在RNA酶作用下生成單鏈DNA，最后在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下生成雙鏈DNA。 酶功能：RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；DN

19、A指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；RNAse H的活性是指它能夠從5?￠3￠和3?￠5￠兩個(gè)方向水解DNA-RNA雜合分子中的RNA。 二.cDNA：為試管內(nèi)合成，以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成的與mRNA堿基序列互補(bǔ)的DNA鏈。 三.滾環(huán)復(fù)制(rolling circle replication)：某些低等生物的復(fù)制形式，如X174和M13噬菌體等。 四.D環(huán)復(fù)制(D-loop replication): 是線粒體DNA的復(fù)制形式。 DNA損傷和修復(fù) 遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變而引起的遺傳信息改變，均可稱為突變。在復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的DNA突變稱為DNA損傷(DNA damage)。結(jié)果：復(fù)制轉(zhuǎn)錄障礙

20、，復(fù)制后基因突變 1. 錯(cuò)配：DNA分子上的堿基錯(cuò)配稱點(diǎn)突變(point mutation)，包括轉(zhuǎn)換（同型堿基間）和顛換（異型堿基間）。Hb 2. 缺失：一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上消失。 3. 插入：原來(lái)沒(méi)有的一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈插入到DNA大分子中間。 4. 重排：DNA分子內(nèi)較大片段的交換。地貧 5. 框移突變?nèi)?lián)體密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生改變，缺失或插入都可導(dǎo)致框移突變。 DNA損傷的修復(fù): 1. 光修復(fù)。嘧啶二聚 2. 切除修復(fù)：是細(xì)胞內(nèi)最重要和有效的修復(fù)機(jī)制，主要由DNA-polⅠ和連接酶完成。Urv XPC XPD

21、 轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)263 著色性干皮病XP RAD 3. 重組修復(fù)：作用于單鏈 4. SOS修復(fù)：當(dāng)DNA損傷廣泛難以繼續(xù)復(fù)制時(shí)，由此而誘發(fā)出一系列復(fù)雜的反應(yīng)。在E. coli，各種與修復(fù)有關(guān)的基因（切除重組系統(tǒng)和調(diào)控蛋白），組成一個(gè)稱為調(diào)節(jié)子(regulon)的網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控系統(tǒng)。這種修復(fù)特異性低，對(duì)堿基的識(shí)別、選擇能力差。通過(guò)SOS修復(fù)，復(fù)制如能繼續(xù)，細(xì)胞是可存活的；然而DNA保留的錯(cuò)誤較多，導(dǎo)致較廣泛、長(zhǎng)期的突變。 第十一章 RNA的生物合成 復(fù)制轉(zhuǎn)錄區(qū)別 模板 原料 酶 產(chǎn)物 配對(duì) 一．中心法則(The Central Dogma)：是指遺傳

22、信息從DNA傳遞給RNA，再?gòu)腞NA傳遞給蛋白質(zhì)，即完成遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯的過(guò)程。也可以從DNA傳遞給DNA，即完成DNA的復(fù)制過(guò)程。這是所有有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物所遵循的法則。在某些病毒中的RNA自我復(fù)制和在某些病毒中能以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成DNA的過(guò)程是對(duì)中心法則的補(bǔ)充。 二．轉(zhuǎn)錄(transcription)：生物體以DNA為模板合成RNA的過(guò)程。 1.RNA合成有轉(zhuǎn)錄與RNA復(fù)制兩種形式。 2.與復(fù)制相同處：酶促的核苷酸聚合過(guò)程，以DNA為模板，依賴DNA的RNA聚合酶，產(chǎn)物是磷酸二酯鍵連接的核苷酸鏈，都從5`-3`方向合成新鏈，遵從堿基配對(duì)規(guī)律。 3.與復(fù)制不同處：模

23、板（不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄）、產(chǎn)物、配對(duì)、原料（NTP）、酶（RNA-pol）。 三．原核生物的轉(zhuǎn)錄模板。 1.結(jié)構(gòu)基因(structural gene)：DNA分子上轉(zhuǎn)錄出RNA的區(qū)段。 2.不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄(asymmetric transcription)：在DNA分子雙鏈上某一區(qū)段，一股鏈用作模板指引轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄；模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一條單鏈上。 3.轉(zhuǎn)錄是有方向性的，按照產(chǎn)物鏈的5`向3`方向延長(zhǎng)。 4．DNA雙鏈中按堿基配對(duì)規(guī)律能指引轉(zhuǎn)錄生成RNA的一股單鏈，稱為模板鏈(template strand)，也稱作有意義鏈或Watson鏈。相對(duì)的另一股單鏈?zhǔn)蔷幋a鏈(cod

24、ing strand)，也稱為反義鏈或Crick鏈。 四．RNA聚合酶 A．RNA聚合酶能直接啟動(dòng)RNA鏈的合成。 1. DNA依賴的RNA聚合酶催化合成RNA，機(jī)制與DNA-POL相似 (NMP)n+NTP→(NMP)n+1+PPi。MG ZN 2.RNA聚合酶通過(guò)在RNA的3’-羥基端加入核苷酸延長(zhǎng)RNA鏈，以5’到3’方向合成RNA。 3. DNA聚合酶在啟動(dòng)DNA鏈延長(zhǎng)時(shí)需要引物存在，而RNA聚合酶不需要引物就能直接啟動(dòng)RNA鏈的延長(zhǎng)。RNA聚合酶和DNA的特殊序列-啟動(dòng)子(promoter)結(jié)合后，就能啟動(dòng)RNA合成。 雜合雙螺旋8bp轉(zhuǎn)錄泡 DNA

25、揭開范圍17bp B．多個(gè)亞基組成。 1.亞基：α（決定哪些基因被轉(zhuǎn)錄）、β（催化功能）、β’（結(jié)合DNA模板開鏈）、σ（辨認(rèn)起始點(diǎn)）。 2.全酶(holoenzyme)：作用于轉(zhuǎn)錄起始階段，由以上四種亞基組成。 3.核心酶(core enzyme)：作用于整個(gè)轉(zhuǎn)錄過(guò)程由αββ’三種亞基組成。 4.熱休克蛋白、熱休克反應(yīng)與σ因子的轉(zhuǎn)變（70→32）。 5.利福平（抗結(jié)核）對(duì)RNA聚合酶β亞基有專一性抑制，用以判斷β亞基在轉(zhuǎn)錄中的作用。 C．RNA聚合酶結(jié)合到DNA的啟動(dòng)子上啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。 1.轉(zhuǎn)錄是不連續(xù)、分區(qū)段進(jìn)行的。每一轉(zhuǎn)錄區(qū)段可視為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，稱為操

26、縱子(operon)。操縱子包括若干個(gè)結(jié)構(gòu)基因及其上游的調(diào)控序列。 2. RNA聚合酶結(jié)合模板DNA的部位，稱為啟動(dòng)子(promoter)。啟動(dòng)子是控制轉(zhuǎn)錄關(guān)鍵部位。原核生物以RNA聚合酶全酶結(jié)合到DNA啟動(dòng)子上而起動(dòng)轉(zhuǎn)錄，其中由σ亞基辨認(rèn)啟動(dòng)子，其他亞基相互配合。RNA聚合酶保護(hù)法 3. RNA-pol與－10區(qū)（Pribnow Box，富含TATAAT）的結(jié)合比與－35區(qū)的結(jié)合牢固。－35區(qū)是RNA－pol對(duì)轉(zhuǎn)錄起始的辨認(rèn)位點(diǎn)，辨認(rèn)結(jié)合后，酶向下游移動(dòng)，達(dá)到－10區(qū)，就跨入轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，形成相對(duì)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，開始進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。 五．轉(zhuǎn)錄起始需要RNA聚合酶全酶。從RNA-pol

27、結(jié)合到啟動(dòng)子，到第一個(gè)NTP加入形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物（RNApol (a2s￠bb) - DNA - pppGpN- OH 3￠）。 六．原核生物轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程： 1.RNA聚合酶識(shí)別啟動(dòng)子并與模板結(jié)合，形成閉合轉(zhuǎn)錄復(fù)合體。 2.DNA雙鏈局部解開，形成開放轉(zhuǎn)錄復(fù)合體。 3.σ因子識(shí)別轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。先識(shí)別-35區(qū)，移向-10區(qū)，跨入轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。（轉(zhuǎn)錄起始或延長(zhǎng)中，DNA雙鏈的解開范圍比復(fù)制叉小得多；轉(zhuǎn)錄不需要引物，RNA-pol可以把兩個(gè)與模板配對(duì)相鄰核苷酸形成磷酸二酯鍵。） 4.第一個(gè)核苷酸常為GTP或ATP，與第二個(gè)核苷酸形成四磷酸二核苷酸，這種結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中一直保

28、留。在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應(yīng)，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。（5￠-pppG-OH + NTP? 5￠-pppGpN-OH 3￠ +ppi）RNApol (a2s￠bb) - DNA - pppGpN- OH 3￠ 5.第一個(gè)磷酸二酯鍵形成后，亞基即從起始復(fù)合物上脫落。核心酶進(jìn)入延長(zhǎng)階段。亞基脫落可以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，也是其循環(huán)利用的基礎(chǔ)。 延長(zhǎng)階段 七．原核生物的轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)時(shí)蛋白質(zhì)的翻譯也同時(shí)進(jìn)行。 1.亞基脫落，RNA–pol聚合酶核心酶變構(gòu)，與模板結(jié)合非特異性，松弛，沿著DNA模板前移；在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長(zhǎng)。 2.轉(zhuǎn)錄空泡（transcript

29、ion bubble）：由RNA-pol、DNA、RNA組成。 3.轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物向外延伸。（DNA/DNA雙鏈的結(jié)構(gòu)比DNA/RNA雜化雙鏈穩(wěn)定；GC比AT穩(wěn)定，AT比AU穩(wěn)定；轉(zhuǎn)錄完成后的局部DNA單鏈會(huì)自動(dòng)回復(fù)成雙鏈） 4.原核生物轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的羽毛狀現(xiàn)象。（在同一DNA模板上，有多個(gè)轉(zhuǎn)錄同時(shí)在進(jìn)行；轉(zhuǎn)錄尚未完成，翻譯已在進(jìn)行；真核生物沒(méi)有這種現(xiàn)象） 終止階段 八.原核生物依賴 Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止。（pol變構(gòu),解旋） 1. 試管內(nèi)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長(zhǎng)于細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，促進(jìn)了ρ因子的發(fā)現(xiàn)。 2.ρ因子對(duì)polyC的結(jié)合力最強(qiáng)，而產(chǎn)物RNA的3`端有豐富的C。

30、 3.轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)是存在于產(chǎn)物RNA中而不是模板DNA中。 4.ρ因子的結(jié)構(gòu) ：相同亞基組成的六聚體蛋白質(zhì) 三個(gè)活性：ATP酶活性和解螺旋酶，轉(zhuǎn)錄終止活性 十一. 原核生物不依賴 Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止。 1. DNA模板上靠近終止處，有些特殊的堿基序列，轉(zhuǎn)錄出RNA后，RNA產(chǎn)物形成特殊的結(jié)構(gòu)來(lái)終止轉(zhuǎn)錄。 2. 莖環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)理：使RNA聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停頓；使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物趨于解離，RNA產(chǎn)物釋放；3`端的寡聚U是RNA從模板脫落的促進(jìn)因素。 十二.真核生物有DNA依賴性RNA聚合酶。 1. Ⅰ型轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為45s-rRNA，Ⅱ型轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為hnRNA，Ⅲ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為5s

31、-rRNA、tRNA、snRNA。對(duì)鵝膏x堿有反應(yīng)。 2. 所有真核生物的RNA聚合酶都有幾個(gè)不同的大亞基和十幾個(gè)小亞基。 3. 以RNA pol 2 為例 12亞基RBP1 末端有CTD 羧基末端結(jié)構(gòu)域(CTD)：RNA聚合酶Ⅱ最大亞基的羧基末端有一段共有序列為Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser重復(fù)序列片段。這一序列在RNA 聚合酶Ⅱ中是獨(dú)一無(wú)二的；所有真核生物的RNA聚合酶Ⅱ都具有CTD，只是共有序列的重復(fù)程度不同；去磷酸化的CTD在轉(zhuǎn)錄起始中發(fā)揮作用。 十三.轉(zhuǎn)錄起始需要啟動(dòng)子、RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子的參與。 A.轉(zhuǎn)錄起始前的上游區(qū)段具有啟動(dòng)子核心序

32、列。 1. 不同物種、不同細(xì)胞或不同的基因，轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游可以有不同的DNA序列，但這些序列都可統(tǒng)稱為順式作用元件(cis-acting element)。 2. 順式作用元件包括啟動(dòng)子、啟動(dòng)子上游元件等近端調(diào)控元件和增強(qiáng)子等遠(yuǎn)隔序列。 3. 起始點(diǎn)上游多數(shù)有共同的TATA序列，稱為Hognest盒或TATA盒(TATA box)。通常認(rèn)為這就是啟動(dòng)子的核心序列。 4. 許多RNA聚合酶II識(shí)別的啟動(dòng)子具有保守的共有序列：位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近的起始子(Inr)。 5. 啟動(dòng)子上游元件是位于TATA盒上游的DNA序列，多在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)約-40～-100nt的位置，比較常見的是GC盒和C

33、AAT盒,與上游元件結(jié)合的蛋白質(zhì)稱為上游因子，如SP1與GC盒結(jié)合，CEBP與CAAT盒的結(jié)合。 6. 增強(qiáng)子是能夠結(jié)合特異基因調(diào)節(jié)蛋白，促進(jìn)鄰近或遠(yuǎn)隔特定基因表達(dá)的DNA序列?？烧T導(dǎo)因子與增強(qiáng)子結(jié)合，如HIF-1等。 336表區(qū)域 OCT-1 ATTTGCAT八聚體 十五.轉(zhuǎn)錄因子： 1. 能直接、間接辨認(rèn)和結(jié)合轉(zhuǎn)錄上游區(qū)段DNA的蛋白質(zhì)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種，統(tǒng)稱為反式作用因子(trans-acting factors)。 2. 反式作用因子中，直接或間接結(jié)合RNA聚合酶的，則稱為轉(zhuǎn)錄因子(TF)。 3. RNA聚合酶II與啟動(dòng)子的結(jié)合、啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄需要多種蛋白質(zhì)因子的協(xié)同作用

34、。通常包括：可誘導(dǎo)因子或上游因子與增強(qiáng)子或啟動(dòng)子上游元件的結(jié)合；轉(zhuǎn)錄因子在啟動(dòng)子處的組裝；輔激活因子/或中介子在通用轉(zhuǎn)錄因子/RNA聚合酶II復(fù)合物與可誘導(dǎo)因子、上游因子之間的輔助和中介作用。 轉(zhuǎn)錄因子 具體組分 結(jié)合序列 功能 基本組分 TBP,TFⅡA,B,E,G, F和H TBP結(jié)合TATA盒 轉(zhuǎn)錄起始定位； 轉(zhuǎn)錄起始和延長(zhǎng) 輔激活因子 TAFs和中介子 ? 在可誘導(dǎo)因子和上游因子與基本轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶結(jié)合中起聯(lián)結(jié)和中介作用 上游因子 SP1、ATF、CTF等 啟動(dòng)子上游元件 協(xié)助基本轉(zhuǎn)錄因子，提高轉(zhuǎn)錄效率和專一

35、性 可誘導(dǎo)因子 如MyoD、HIF-1等 增強(qiáng)子等遠(yuǎn)隔調(diào)控序列 時(shí)間和空間（組織）特異性地調(diào)控轉(zhuǎn)錄 十六. 真核生物RNA-pol不與DNA分子直接結(jié)合，而需依靠眾多的轉(zhuǎn)錄因子，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物(PIC)，由RNA-Pol Ⅱ催化。 形成機(jī)制 1. 2. 3. 十七.少數(shù)幾個(gè)反式作用因子的搭配啟動(dòng)特定基因的轉(zhuǎn)錄。 1. 為了保證轉(zhuǎn)錄的準(zhǔn)確性，不同基因需不同轉(zhuǎn)錄因子。 2. 一個(gè)真核生物基因的轉(zhuǎn)錄需要3至5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。 3. 拼板理論(piecing theory) ：少數(shù)幾個(gè)反式作用因子（主要是可誘導(dǎo)因子和上游因子）之

36、間互相作用，再與基本轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶搭配而有針對(duì)性地結(jié)合、轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的基因。可誘導(dǎo)因子和上游因子常常通過(guò)輔激活因子或中介子與基本轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶結(jié)合，但有時(shí)也可直接與基本轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶結(jié)合。 十八.真核生物轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過(guò)程中沒(méi)有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)象。 1. 真核生物轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過(guò)程與原核生物大致相似，但因有核膜相隔，沒(méi)有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)象。 2. RNA-pol前移處處都遇上核小體。 3. 轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過(guò)程中可以觀察到核小體移位和解聚現(xiàn)象。 十九.真核生物的轉(zhuǎn)錄終止和加尾修飾同時(shí)進(jìn)行。 1. 真核生物的轉(zhuǎn)錄終止，是和轉(zhuǎn)錄后修飾密切相關(guān)的。 2.真核生物mRNA有聚腺苷

37、酸(poly A)尾巴結(jié)構(gòu)，是轉(zhuǎn)錄后才加進(jìn)去的。 3.轉(zhuǎn)錄不是在poly A的位置上終止，而是超出數(shù)百個(gè)乃至上千個(gè)核苷酸后才停頓。已發(fā)現(xiàn)，在讀碼框架的下游，常有一組共同序列AATAAA，再下游還有相當(dāng)多的GT序列。這些序列稱為轉(zhuǎn)錄終止的修飾點(diǎn)。 二十.真核生物RNA的加工。 1. 真核生物轉(zhuǎn)錄生成的RNA分子是初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄物(primary RNA transcript)，幾乎所有的初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄物都要經(jīng)過(guò)加工，才能成為具有功能的成熟的RNA。加工主要在細(xì)胞核中進(jìn)行。 2. 包括剪接、剪切、修飾、添加。 A． 前體mRNA在5’-末端加入“帽”結(jié)構(gòu)（5’m7GpppGp…）

38、。 1. 大多數(shù)真核mRNA的5’-末端有7-甲基鳥嘌呤的帽結(jié)構(gòu)。 起始步驟由兩種酶，加帽酶和甲基轉(zhuǎn)移酶催化完成。 2. 意義：可以使mRNA免遭核酸酶的攻擊； 能與帽結(jié)合蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)合，并參與mRNA和核糖體的結(jié)合，啟動(dòng)蛋白質(zhì)的生物合成。 B． 前體mRNA在3’端特異位點(diǎn)斷裂并加上多聚腺苷酸尾（…AAAAAAA 3’）。 1. 模板上沒(méi)有poly A相應(yīng)結(jié)構(gòu)；尾部修飾與轉(zhuǎn)錄終止同時(shí)進(jìn)行。在加入poly A之前，mRNA先切去一段。 2. 在核內(nèi)完成；poly A的有無(wú)與長(zhǎng)短，是維持mRNA作為翻譯模板的活性，以及增加mRNA本身穩(wěn)定性的因素。 3. 一般真核生物在胞漿內(nèi)

39、出現(xiàn)的mRNA，其poly A長(zhǎng)度為100至200個(gè)核苷酸之間，也有少數(shù)例外；前體mRNA分子的斷裂和加多聚腺苷酸尾是多步驟過(guò)程。 機(jī)制：斷裂和聚腺苷酸化特異性因子CPSF 斷裂因子CStF CF1 CF2 多聚腺苷酸結(jié)合蛋白PAB2 C．前體mRNA的剪接主要是去除內(nèi)含子。 1. hnRNA：核內(nèi)的初級(jí)mRNA。 2. 斷裂基因：真核生物結(jié)構(gòu)基因，由若干個(gè)編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質(zhì)，這些基因稱為斷裂基因。 3. 外顯子（exon）：在斷裂基因及其初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)，并表達(dá)為成熟RNA的核酸序列。

40、 4. 內(nèi)含子（intron）：隔斷基因的線性表達(dá)而在剪接過(guò)程中被除去的核酸序列。代表了結(jié)構(gòu)基因的非編碼區(qū)。它有利于物種的進(jìn)化選擇，在基因表達(dá)調(diào)控中的作用。 5. mRNA的剪接：除去hnRNA中的內(nèi)含子，將外顯子連接。 剪接接口或邊界序列：內(nèi)含子都以GU為5`端起始，末端為AG-OH-3`。 剪接體: mRNA剪接場(chǎng)所，由小分子核糖體核蛋白（snRNP）組成, 每種snRNP 包含snRNA(有U1、U2、U4、U5、U6五種類型)與一組蛋白質(zhì)。 過(guò)程：snRNP與hnRNA結(jié)合成為并接體，二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。 snRNP作用機(jī)理：12和snRNA配對(duì) 456加入 14

41、5釋放26催化 6. 真核生物前體mRNA分子經(jīng)剪切和剪接兩種模式可加工成不同的mRNA。 剪接：剪去內(nèi)含子后，相鄰?fù)怙@子之間的連接，然后3`末端多聚腺苷酸化。 剪切：剪去內(nèi)含子，3`末端多聚腺苷酸化，不進(jìn)行相鄰?fù)怙@子之間的連接反應(yīng)。 7． mRNA編輯是對(duì)基因的編碼序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后加工。 1. 估計(jì)人體蛋白有5萬(wàn)~10萬(wàn)種，但人類基因組計(jì)劃完成后證實(shí)人類只有25000~35000個(gè)結(jié)構(gòu)基因。 2. RNA編輯作用說(shuō)明，基因的編碼序列經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄后加工，是可有多用途分化的，因此也稱為分化加工。 例子:APO B 真核前體rRNA的加工：45S-rRNA經(jīng)剪接后

42、形成18S-rRNA、5.8和28S-rRNA。 真核前體tRNA加工包括稀有堿基修飾。包括甲基化、還原反應(yīng)、核苷內(nèi)的轉(zhuǎn)位反應(yīng)、脫氨反應(yīng)。 RNA pol3,內(nèi)切， tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶、連接酶 RNA催化一些真核和原核基因內(nèi)含子的自剪接。組1組2內(nèi)含子 1. 核酶(ribozyme)：具有酶促活性的RNA稱為核酶，最早在四膜蟲的內(nèi)含子自身剪接的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)。 2. 除rRNA外，tRNA、mRNA的加工也可采用自我剪接方式。 3. 最簡(jiǎn)單的核酶二級(jí)結(jié)構(gòu)——槌頭狀結(jié)構(gòu)。 第十一章 蛋白質(zhì)的生物合成 一．蛋白質(zhì)生物合成(protein biosynthesis)也稱翻

43、譯(translation)，是生物細(xì)胞以mRNA為模板，按照mRNA分子中核苷酸的排列順序所組成的密碼信息合成蛋白質(zhì)的過(guò)程。將核酸中 4 種核苷酸序列編碼的遺傳信息，通過(guò)遺傳密碼破譯的方式解讀為蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中20種氨基酸的排列順序。蛋白質(zhì)生物合成是基因表達(dá)的最終階段。 1.反應(yīng)過(guò)程：氨基酸的活化，肽鏈的生物合成（起始、延長(zhǎng)和終止），肽鏈形成后的加工和靶向輸送。 2.生物學(xué)意義：蛋白質(zhì)合成在細(xì)胞生命過(guò)程中有至關(guān)重要的核心作用（生命必需和藥物作用靶點(diǎn)）。 二．蛋白質(zhì)生物合成體系： 1.基本原料:20種編碼氨基酸。 2.三種RNA:mRNA---模板; tRNA ---

44、適配器；核蛋白體---裝配機(jī)。 3.主要酶和蛋白質(zhì)因子:氨基酰-tRNA合成酶、轉(zhuǎn)肽酶、起始因子、延長(zhǎng)因子、釋放因子等。 4.能源物質(zhì):ATP、GTP。 5.無(wú)機(jī)離子:Mg2+、K+。 三．mRNA的基本結(jié)構(gòu)。 1.組成：5’-端非翻譯區(qū)、開放閱讀框架、3’-端非翻譯區(qū)。 2.從mRNA 5’-端起始密碼子AUG到3’-端終止密碼子之間的核苷酸序列，稱為開放閱讀框架(ORF)。 3.順?lè)醋?遺傳學(xué)將編碼一個(gè)多肽的遺傳單位稱為。 四．遺傳密碼。 1.密碼子（codon）：在mRNA的開放閱讀框架區(qū)，從5’至3’方向，由AUG開始，每3個(gè)核苷酸為一組，

45、決定肽鏈上某一個(gè)氨基酸或蛋白質(zhì)合成的起始、終止信號(hào)，稱為三聯(lián)體密碼(有43個(gè))。其破譯在生物學(xué)史上有里程碑的意義。 2.有意義密碼：能決定氨基酸的密碼子（61個(gè)）。 起始密碼子(initiation codon)：AUG。 終止密碼子(termination codon) ：UAA、UAG、UGA。 3.特點(diǎn)： 方向性(directional。翻譯時(shí)遺傳密碼的閱讀方向是5’→3’，即讀碼從mRNA的起始密碼子AUG開始，按5’→3’的方向逐一閱讀，直至終止密碼子)、 連續(xù)性(non-punctuated。編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列的各個(gè)三聯(lián)體密碼連續(xù)閱讀，密碼子及密碼子

46、的各堿基之間既無(wú)間隔、無(wú)重疊) m RNA 編輯 框移突變 簡(jiǎn)并性(degenerate。一種氨基酸可具有2個(gè)或2個(gè)以上的密碼子為其編碼，存在同義密碼子 通用性(universal。從簡(jiǎn)單的病毒到高等的人類，幾乎使用同一套遺傳密碼)、 擺動(dòng)性(wobble。轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的tRNA的反密碼子需要通過(guò)堿基互補(bǔ)與mRNA上的遺傳密碼反向配對(duì)結(jié)合，但反密碼子與密碼子間不嚴(yán)格遵守常見的堿基配對(duì)規(guī)律，稱為擺動(dòng)配對(duì)。通常出現(xiàn)在密碼子的第3位堿基與反密碼子的第1位堿基之間)。I~U C A 五．核蛋白體的組成。和snRNP(剪接體中。。285 ) 對(duì)比 1.核蛋白體又稱核糖體，是由rRNA和多種蛋白質(zhì)

47、結(jié)合而成的一種大的核糖核蛋白顆粒，是蛋白質(zhì)生物合成的場(chǎng)所。 2.原核生物翻譯過(guò)程中核蛋白體結(jié)構(gòu)模式：A位氨基酰位、P位肽酰位、E位排出位。 六．tRNA。 1.結(jié)構(gòu)：二級(jí)結(jié)構(gòu)三葉草型（由氨基酸臂、反密碼環(huán)、DHU環(huán)、TΨC環(huán)組成），三級(jí)結(jié)構(gòu)呈L型。 2.作用：運(yùn)載氨基酸（氨基酸各由其特異的tRNA攜帶，一種氨基酸可有幾種對(duì)應(yīng)的tRNA，氨基酸的羧基結(jié)合在tRNA 3ˊ-CCA的位置（形成酯鍵），結(jié)合需要ATP供能）；充當(dāng)“適配器”（每種tRNA的反密碼子決定了所攜帶的氨基酸能準(zhǔn)確地在mRNA上對(duì)號(hào)入座）。 七.重要的酶類。 1.氨基酰-tRNA合成酶：催化氨基酸的活化； 2.

48、轉(zhuǎn)肽酶(peptidase)：催化核蛋白體P位上的肽?；D(zhuǎn)移至A位氨基酰-tRNA的氨基上，使?；c氨基結(jié)合形成肽鍵;并受釋放因子的作用后發(fā)生變構(gòu)，表現(xiàn)出酯酶的水解活性，使P位上的肽鏈與tRNA分離； 3.轉(zhuǎn)位酶(translocase)：催化核蛋白體向mRNA3’-端移動(dòng)一個(gè)密碼子的距離，使下一個(gè)密碼子定位于A位。 八．輔助元素 蛋白因子（原核生物）。表12-3 1.起始因子：IF-1（占據(jù)A位防止結(jié)合其他tRNA）、IF-2（促進(jìn)起始tRNA與小亞基結(jié)合）、IF-3 （促進(jìn)大小亞基分離，提高P位對(duì)結(jié)合起始tRNA的敏感性）。 2.延長(zhǎng)因子：EF-Tu（促進(jìn)氨基酰-tRNA進(jìn)入A

49、位，結(jié)合并分解GTP）、EF-Ts （調(diào)節(jié)亞基）、EF-G （有轉(zhuǎn)位酶活性，促進(jìn)mRNA-肽酰-tRNA由A位移至P位，促進(jìn)tRNA卸載與釋放）。 3.釋放因子： RF-1（特異識(shí)別UAA、UAG，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)肽酶轉(zhuǎn)變?yōu)轷ッ福?、RF-2，（特異識(shí)別UAA、UGA，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)肽酶轉(zhuǎn)變?yōu)轷ィ?、RF-3（可與核蛋白體其他部位結(jié)合，有GTP酶活性，能介導(dǎo)RF-1及RF-2與核蛋白體的相互作用）。 真核 表 12-4 能源物質(zhì)（ATP和GTP）及離子（Mg2+、K+ 等）。 合成過(guò)程： 氨基酸的活化概述： 氨基酸與特異的tRNA結(jié)合形成氨基酰-tRNA的過(guò)程稱為氨基酸的活化

50、。 酶：氨基酰-tRNA合成酶。 1.反應(yīng)過(guò)程：AMP-E 成脂 2.酶的結(jié)構(gòu)： 酶有3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，氨基酸和ATP形成氨基酰腺苷，氨基酰轉(zhuǎn)移到tRNA上，tRNA負(fù)載了氨基酸 3.特性：氨基酰-tRNA合成酶對(duì)底物氨基酸和tRNA都有高度特異性；該酶與二者中之一結(jié)合后，空間構(gòu)像改變，選擇性與對(duì)應(yīng)氨基酸的結(jié)合。氨基酰-tRNA合成酶具有校正活性。 生理意義：蛋白質(zhì)生物學(xué)合成中的保真性機(jī)制。 1.密碼子與反密碼子的辨認(rèn)結(jié)合。 2.氨基酰-tRNA合成酶對(duì)底物氨基酸和tRNA都有高度特異性。 3.氨基酰-tRNA合成酶具有校正活性。 4.核糖體對(duì)氨基酰-tRNA

51、的進(jìn)位具有校正作用。 特點(diǎn)：起始氨基酰-tRNA。 1. 起始氨基酰-tRNA，Met-tRNAiMet（真核生物）：tRNAiMet與甲硫氨酸結(jié)合后形成Met-tRNAiMet，在mRNA起始密碼子AUG處就位，參與形成翻譯起始復(fù)合物。起始密碼子只能辨認(rèn)Met-tRNAiMet。 2. 肽鏈延長(zhǎng)的甲硫氨酰-tRNA，Met-tRNAMet（真核生物）：tRNAMet和甲硫氨酸結(jié)合后生成Met-tRNAMet，必要時(shí)進(jìn)入核蛋白體，為延長(zhǎng)中的肽鏈添加甲硫氨酸。 3. 起始氨基酰-tRNA，fMet-tRNAfMet（原核生物）：具有起始功能的tRNAfMet與甲硫氨酸結(jié)合后，甲硫氨酸很快

52、被甲?；癁镹-甲酰甲硫氨酸(fMet)，于是形成N-甲酰甲硫氨酰-tRNA(fMet-tRNAfMet)，可以在mRNA的起始密碼子AUG處就位，參與形成翻譯起始復(fù)合物。原核生物起始密碼子只能辨認(rèn)fMet-tRNAfMet。 原核生物合成過(guò)程（廣義核糖體循環(huán)） A．原核生物肽鏈合成起始：指mRNA和起始氨基酰-tRNA分別與核蛋白體結(jié)合而形成翻譯起始復(fù)合物的過(guò)程。物質(zhì)： 1. 核蛋白體大小亞基分離。IF1 IF3 2. mRNA在小亞基定位結(jié)合（兩種機(jī)制）：SD序列/RBS〉16S的3端嘧啶堿基段序列 小核苷酸序列〉rpS-1 在各種mRNA起始AUG上游約8～13核苷酸部位

53、，存在一段由4～9個(gè)核苷酸組成的一致序列，富含嘌呤堿基，如-AGGAGG-，稱為Shine-Dalgarno序列(S-D序列)，又稱核蛋白體結(jié)合位點(diǎn)(ribosomal binding site, RBS)。一條多順?lè)醋觤RNA序列上的每個(gè)基因編碼序列均擁有各自的S-D序列和起始AUG。mRNA序列上緊接S-D序列后的小核苷酸序列，可被核蛋白體小亞基蛋白rpS-1識(shí)別并結(jié)合。 3. 起始氨基酰-tRNA的結(jié)合。 GTP-IF2 4. 大亞基的結(jié)合。GTP水解 B．原核生物肽鏈合成延長(zhǎng)： 又稱為核蛋白體循環(huán)。在mRNA模板的指導(dǎo)下，氨基酸依次進(jìn)入核蛋白體并聚合成多肽鏈的過(guò)程。每輪循環(huán)使

54、多肽鏈增加一個(gè)氨基酸殘基。 1. 進(jìn)位：又稱注冊(cè)(registration)，是指一個(gè)氨基酰-tRNA按照mRNA模板的指令進(jìn)入并結(jié)合到核蛋白體A位的過(guò)程，需要延長(zhǎng)因子EF-Tu（GTP水解酶活性）與EF-Ts參與。（核糖體對(duì)氨基酰-tRNA的進(jìn)位具有校正作用是翻譯保真性的另一機(jī)制）。。。 2. 成肽：在轉(zhuǎn)肽酶的催化下，核蛋白體P位上起始氨基酰-tRNA的N-甲酰甲硫氨?；螂孽?tRNA的肽?；D(zhuǎn)移到A位并與A位上氨基酰-tRNA的α-氨基結(jié)合形成肽鍵的過(guò)程。 3. 轉(zhuǎn)位：在轉(zhuǎn)位酶的催化下，核蛋白體向mRNA的3′-端移動(dòng)一個(gè)密碼子的距離，使mRNA序列上的下一個(gè)密碼子進(jìn)入核蛋白體的A

55、位、而占據(jù)A位的肽酰-tRNA移入P位的過(guò)程，需要延長(zhǎng)因子EF-G（有轉(zhuǎn)位酶活性，可結(jié)合并水解1分子GTP，釋放的能量促進(jìn)核蛋白體向mRNA的3′側(cè)移動(dòng)，使起始二肽酰-tRNA-mRNA相對(duì)位移進(jìn)入核蛋白體P位，而卸載的tRNA則移入E位）參與。 C.原核生物肽鏈合成終止：指核蛋白體A位出現(xiàn)mRNA的終止密碼子后，多肽鏈合成停止，肽鏈從肽酰-tRNA中釋出，mRNA、核蛋白體大、小亞基等分離的過(guò)程，需要釋放因子RF-1、RF-2 和 RF-3（RF: 識(shí)別終止密碼子；激活成肽酶的酯酶活性）參與。RF-1（UAG）、RF-2( UGA ) 1. 識(shí)別終止密碼子：RF-1特異識(shí)別UAA、UAG

56、，RF-2特異識(shí)別UAA、UGA。 2. 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)肽酶轉(zhuǎn)變?yōu)轷ッ富钚裕捍呋律逆溑c結(jié)合在P位的tRNA之間的酯鍵水解，使肽鏈從核蛋白體上釋放。 3. RF-3可結(jié)合核蛋白體其他部位，有GTP酶活性，能介導(dǎo)RF-1、RF-2與核蛋白體的相互作用。 真核合成過(guò)程 A.真核生物肽鏈合成起始：KOZAK 共有序列 ACCAUGG 1. 核蛋白體大小亞基分離；2B 3（介導(dǎo)） 6 2. 起始氨基酰-tRNA的結(jié)合； eIF-2- GTP GTP酶。。。 3. mRNA在小亞基定位結(jié)合 e IF-4F 帽子結(jié)合蛋白復(fù)合物 4E，4G，4A， PAB）ATP（4B引導(dǎo)） 4A解螺旋（MR

57、NA 5 端發(fā)夾） 4. 核蛋白體大亞基結(jié)合。5 B.真核生物肽鏈合成延長(zhǎng)：真核生物肽鏈合成的延長(zhǎng)過(guò)程與原核生物基本相似，但有不同的反應(yīng)體系和延長(zhǎng)因子。另外，真核細(xì)胞核蛋白體沒(méi)有E位，轉(zhuǎn)位時(shí)卸載的tRNA直接從P位脫落。 C.真核生物肽鏈合成終止：真核生物翻譯終止過(guò)程與原核生物相似，但只有1個(gè)釋放因子eRF，可識(shí)別所有終止密碼子，完成原核生物各類RF的功能。 多聚核蛋白體(polysome)：1條mRNA模板鏈都可附著10～100個(gè)核蛋白體，這些核蛋白體依次結(jié)合起始密碼子并沿5′→3′方向讀碼移動(dòng)，同時(shí)進(jìn)行肽鏈合成，這種mRNA與多個(gè)核蛋白體形成的聚合物稱為多聚核蛋白體。多聚核蛋白體的

58、形成可以使蛋白質(zhì)生物合成以高速度、高效率進(jìn)行。 原核生物與真核生物肽鏈合成過(guò)程的主要差別。 原核生物 真核生物 mRNA 一條mRNA編碼幾種蛋白質(zhì)（多順?lè)醋樱? 一條mRNA編碼一種蛋白質(zhì)（單順?lè)醋樱? 轉(zhuǎn)錄后很少加工 轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行首尾修飾及剪接 轉(zhuǎn)錄、翻譯和mRNA的降解可同時(shí)發(fā)生 mRNA在核內(nèi)合成，加工后進(jìn)入胞液，再作為模板指導(dǎo)翻譯 核蛋白體 30S小亞基＋50S大亞基 ? 70S核蛋白體 40S小亞基＋60S大亞基 ? 80S核蛋白體 起始階段 起始氨基酰-Trna為fMet-tRNAfMet 起始氨基酰-tRNA為Met-tRNAiMet

59、 核蛋白體小亞基先與mRNA結(jié)合,再與fMet-tRNAfMet結(jié)合 核蛋白體小亞基先與Met-tRNAiMet結(jié)合，再與mRNA結(jié)合 mRNA中的S-D序列與16S rRNA 3￠-端的一段序列結(jié)合 Mrna中的帽子結(jié)構(gòu)與帽子結(jié)合蛋白復(fù)合物結(jié)合 3種IF參與起始復(fù)合物的形成 有至少10種eIF參與起始復(fù)合物的形成 延長(zhǎng)階段 延長(zhǎng)因子為EF-Tu、EF-Ts和EF-G 延長(zhǎng)因子為eEF-1α、eEF-1βγ和eEF-2 終止階段 釋放因子為RF-1、RF-2和RF-3 釋放因子為eRF 蛋白質(zhì)加工修飾 多肽鏈折疊為天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)：新生肽鏈的折疊在肽

60、鏈合成中、合成后完成，新生肽鏈N-端在核蛋白體上一出現(xiàn)，肽鏈的折疊即開始?？赡茈S著序列的不斷延伸肽鏈逐步折疊，產(chǎn)生正確的二級(jí)結(jié)構(gòu)、模序、結(jié)構(gòu)域到形成完整空間構(gòu)象。 一般認(rèn)為，多肽鏈自身氨基酸順序儲(chǔ)存著蛋白質(zhì)折疊的信息，即一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ)。 細(xì)胞中大多數(shù)天然蛋白質(zhì)折疊都不是自動(dòng)完成，而需要其他酶和蛋白質(zhì)輔助。 1. 分子伴侶：分子伴侶是細(xì)胞內(nèi)一類可識(shí)別肽鏈的非天然構(gòu)象、促進(jìn)各功能域和整體蛋白質(zhì)的正確折疊的保守蛋白質(zhì)。功能為①封閉待折疊蛋白質(zhì)的暴露的疏水區(qū)段②創(chuàng)建一個(gè)隔離的環(huán)境，可以使蛋白質(zhì)的折疊互不干擾③促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊和去聚集④遇到應(yīng)激刺激，使已折疊的蛋白質(zhì)去折疊。分為核糖體結(jié)合性

61、（觸發(fā)因子TF、新生鏈相關(guān)復(fù)合物NAC）和非核糖體結(jié)合性（HSP 伴侶蛋白）。 熱休克蛋白(HSP)：熱休克蛋白屬于應(yīng)激反應(yīng)性蛋白質(zhì)，高溫應(yīng)激可誘導(dǎo)該蛋白質(zhì)合成。熱休克蛋白可促進(jìn)需要折疊的多肽折疊為有天然空間構(gòu)象的蛋白質(zhì)。包括HSP70、HSP40和GrpE三族。人類細(xì)胞中HSP蛋白質(zhì)家族可存在于胞漿、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、線粒體、胞核等部位，涉及多種細(xì)胞保護(hù)功能：如使線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)保持未折疊狀態(tài)而轉(zhuǎn)運(yùn)、跨膜，再折疊成功能構(gòu)象； 結(jié)構(gòu)：N-端高度保守的ATP酶結(jié)構(gòu)域，能結(jié)合水解ATP；GRP EC-端的多肽鏈結(jié)合結(jié)構(gòu)域。 HSP70反應(yīng)循環(huán); Dna J, Dna K-ATP,復(fù)合物形成

62、，GRP E交換 2ATP 功能：通過(guò)類似上述機(jī)制，避免或消除蛋白質(zhì)變性后因疏水基團(tuán)暴露而發(fā)生的不可逆聚集，以利于清除變性或錯(cuò)誤折疊的多肽中間物等。 伴侶蛋白：伴侶蛋白是分子伴侶的另一家族，如大腸桿菌的Gro EL和Gro ES（真核細(xì)胞中同源物為HSP60和HSP10）等家族。 主要作用：為非自發(fā)性折疊蛋白質(zhì)提供能折疊形成天然空間構(gòu)象的微環(huán)境。Gro EL與Gro ES的結(jié)構(gòu)特征。 Gro EL-Gro ES反應(yīng)循環(huán)： GRO –ES蓋子， 7ATP+14ATP（循環(huán)），親水活性步驟 2. 蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）：穩(wěn)定分泌型蛋白質(zhì)、膜蛋白質(zhì) 定位：

63、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。二硫鍵異構(gòu)酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔活性很高，可在較大區(qū)段肽鏈中催化錯(cuò)配二硫鍵斷裂并形成正確二硫鍵連接。 分子構(gòu)象病 3. 肽-脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶（PPI）：多肽鏈中肽酰-脯氨酸間形成的肽鍵有順?lè)磧煞N異構(gòu)體，空間構(gòu)象有明顯差別。 作用：肽酰-脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶是蛋白質(zhì)三維構(gòu)象形成的限速酶，在肽鏈合成需形成順式構(gòu)型時(shí)，可使多肽在各脯氨酸彎折處形成準(zhǔn)確折疊。 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)修飾主要是肽鍵水解和化學(xué)修飾。 1. 肽鏈末端的修飾。N-端修飾：原核生物是N-甲酰甲硫氨酸，真核生物是甲硫氨酸，加工切除（甲?；富虬被拿福?；真核生物有50%的蛋白質(zhì)存在N-端氨基酸的乙?；-端修飾：可能存在修飾。

64、2. 個(gè)別氨基酸的共價(jià)修飾。糖基化：天冬酰胺、絲氨酸、蘇氨酸等；羥基化：膠原中的賴氨酸、脯氨酸等；甲基化（SAM）：谷氨酸、精氨酸、天冬酸；磷酸化（ATP）：絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、代謝酶（鈣調(diào)蛋白，組蛋白，Cyto C）、CTD；二硫鍵形成：分泌性蛋白；親脂性修飾：一些跨膜蛋白，如G蛋白、Ras蛋白，進(jìn)行疏水性脂鏈的修飾。 3. 水解加工可生成具有生物活性的蛋白質(zhì)或多肽。 鴉片促黑皮質(zhì)素原(POMC)的水解修飾,256 空間結(jié)構(gòu)的修飾:亞基，輔基 1. 通過(guò)非共價(jià)鍵亞基聚合形成具有四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。具有四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)由兩條以上的肽鏈通過(guò)非共價(jià)鍵聚合，形成寡聚體。HB A2B2

65、 2. 輔基連接后形成完整的結(jié)合蛋白質(zhì)。結(jié)合蛋白質(zhì)合成后都需要結(jié)合相應(yīng)輔基，才能成為具有功能活性的天然蛋白質(zhì)。 靶向輸送（細(xì)胞液、細(xì)胞器、細(xì)胞外） 定義： 蛋白質(zhì)在核蛋白體上合成后，必須被分選出來(lái)，經(jīng)過(guò)復(fù)雜機(jī)制定向輸送到最終發(fā)揮生物功能的細(xì)胞靶部位，這一過(guò)程稱為蛋白質(zhì)的靶向輸送。蛋白質(zhì)的靶向輸送與翻譯后修飾過(guò)程同步進(jìn)行。二十五.靶向輸送的蛋白質(zhì)N-端存在信號(hào)序列。去向：3個(gè) 分選信號(hào)： 1. 信號(hào)序列 定義：所有靶向輸送的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中存在分選信號(hào)，主要是N末端特異氨基酸序列，可引導(dǎo)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞的適當(dāng)靶部位，這類序列稱為信號(hào)序列(signal sequence)。 作用：決定

66、蛋白質(zhì)靶向輸送特性的最重要元件，提示指導(dǎo)蛋白質(zhì)靶向輸送的信息存在于蛋白質(zhì)自身的一級(jí)結(jié)構(gòu)中。 特點(diǎn)：N-端含1個(gè)或幾個(gè)帶正電荷的堿性氨基酸殘基，如賴氨酸、精氨酸； 中段為疏水核心區(qū)，主要含疏水的中性氨基酸，如亮氨酸、異亮氨酸等； C-端加工區(qū)由一些極性相對(duì)較大、側(cè)鏈較短的氨基酸組成，緊接著是被信號(hào)肽酶裂解的位點(diǎn)。 2. 核定位序列（NLS）：靶向輸送到細(xì)胞核的蛋白質(zhì)其多肽鏈內(nèi)含有特異信號(hào)序列， 組成：其為含4～8個(gè)氨基酸殘基的短序列，富含帶正電荷的賴氨酸、精氨酸和脯氨酸，可位于肽鏈的不同部位，而不只在N末端。 不同的NLS間未發(fā)現(xiàn)共有序列； 在蛋白質(zhì)進(jìn)核定位后，NLS不被切除。 輸送靶向 1. 胞外：分泌型蛋白質(zhì)由分泌小泡靶向輸送至胞外。 由信號(hào)肽引導(dǎo)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔折疊成為具有一定功能構(gòu)象的蛋白質(zhì)。 高爾基復(fù)合體中分選包裝為分泌小泡，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜，再分泌到細(xì)胞外。 機(jī)制：SRP（6+1（7S），GTP酶） DP（A亞基GTP酶） 肽轉(zhuǎn)位復(fù)合物， 2. 溶酶體：蛋白質(zhì)6-磷酸甘露糖基化是靶向輸送至溶酶體的信號(hào)。 3. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向輸送至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì) C-端