高考生物總復(fù)習(xí) 第六章第2節(jié) DNA片段的擴增 PCR技術(shù)課件 中圖版選修1

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1、第第2節(jié)節(jié)DNA片段的擴增片段的擴增PCR技術(shù)技術(shù)學(xué)習(xí)導(dǎo)航學(xué)習(xí)導(dǎo)航1.理解理解PCR擴增擴增DNA片段的原理。片段的原理。重點重點2.嘗試嘗試PCR技術(shù)的基本操作和應(yīng)用。技術(shù)的基本操作和應(yīng)用。 難點難點新知初探思維啟動新知初探思維啟動一、一、DNA在細胞內(nèi)的復(fù)制在細胞內(nèi)的復(fù)制1.所需的酶：所需的酶：_酶、酶、DNA聚合酶和聚合酶和RNA聚合酶等。聚合酶等。2.引物：引物：_。3.原料：原料：_。4.原則：原則：_。DNA解旋解旋一段一段RNA四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸堿基互補配對原則堿基互補配對原則二、二、PCR及其過程及其過程1.概念：概念：PCR即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，實際上是即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

2、，實際上是在在_模擬細胞內(nèi)的模擬細胞內(nèi)的_，形，形成大量成大量_的的DNA片段。片段。體外體外DNA復(fù)制過程復(fù)制過程特異性特異性2.過程過程條件條件過程過程加加樣樣室溫室溫把把PCR緩沖液緩沖液、_、一對引物、四種脫氧核苷酸、一對引物、四種脫氧核苷酸、DNA聚合酶、聚合酶、Mg2等成分加等成分加入到微量離心管中入到微量離心管中DNA模板模板氫鍵氫鍵一對引物一對引物DNA聚合聚合脫氧核苷酸脫氧核苷酸判一判判一判(1)細胞內(nèi)細胞內(nèi)DNA復(fù)制和復(fù)制和PCR技術(shù)所需的引物一技術(shù)所需的引物一樣，都是樣，都是RNA。()(2)經(jīng)經(jīng)PCR技術(shù)合成的技術(shù)合成的DNA分子中，每條單鏈分子中，每條單鏈都含有引物。

3、都含有引物。()(3)PCR實驗的原理和操作都十分復(fù)雜，不易實驗的原理和操作都十分復(fù)雜，不易于操作。于操作。()(4)經(jīng)過高溫變性、低溫復(fù)性和中溫延伸三步經(jīng)過高溫變性、低溫復(fù)性和中溫延伸三步操作，操作，DNA片段可呈指數(shù)增長。片段可呈指數(shù)增長。()三、實驗操作三、實驗操作1.準(zhǔn)備準(zhǔn)備(1)為了避免為了避免_等因素的污染，等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、吸頭、緩沖液以實驗中使用的微量離心管、吸頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進行及蒸餾水等在使用前必須進行_。(2)如果沒有如果沒有PCR儀，可以設(shè)置儀，可以設(shè)置3個恒溫水浴個恒溫水浴鍋，溫度分別為鍋，溫度分別為_、_和和_，然后按要求

4、在然后按要求在3個水浴鍋中來回轉(zhuǎn)移個水浴鍋中來回轉(zhuǎn)移PCR的的微量離心管即可。微量離心管即可。外源外源DNA高壓滅菌高壓滅菌95 55 72 PCR熱循環(huán)熱循環(huán)260 nm想一想想一想決定決定PCR反應(yīng)特異性的原因有哪些？反應(yīng)特異性的原因有哪些？【提示提示】待擴增待擴增DNA片段的特異性。片段的特異性。要點突破講練互動要點突破講練互動要點一要點一PCR技術(shù)與體內(nèi)技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制的比較復(fù)制的比較細胞內(nèi)復(fù)制細胞內(nèi)復(fù)制PCR反應(yīng)反應(yīng)解旋解旋在解旋酶作用在解旋酶作用下下,細細胞提供能量，胞提供能量，部分解開部分解開加熱至加熱至90 以以上時，雙鏈全上時，雙鏈全部解開部解開酶酶DNA解旋酶、解旋酶、

5、DNA聚合酶聚合酶耐高溫的耐高溫的DNA聚合酶聚合酶引物引物一小段一小段RNA單鏈單鏈DNA細胞內(nèi)復(fù)制細胞內(nèi)復(fù)制PCR反應(yīng)反應(yīng)能量能量ATP不加不加循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)生物自身控制生物自身控制30多次多次子鏈合成子鏈合成一條鏈連續(xù)合一條鏈連續(xù)合成成,另另一條鏈不連續(xù)一條鏈不連續(xù)合成合成兩條子鏈為連續(xù)兩條子鏈為連續(xù)合合成成,溫溫度為度為72 產(chǎn)物產(chǎn)物完整完整DNADNA片段片段相同點相同點需提供需提供DNA復(fù)制的模板復(fù)制的模板四種脫氧核苷酸為原料四種脫氧核苷酸為原料堿基互補配對原則堿基互補配對原則子鏈延伸的方向都是從子鏈延伸的方向都是從5端到端到3端端特別提醒特別提醒PCR反應(yīng)需要可變的溫度，而反應(yīng)

6、需要可變的溫度，而體內(nèi)體內(nèi)DNA復(fù)制需要穩(wěn)定的溫度。復(fù)制需要穩(wěn)定的溫度。DNA解旋酶的作用是使解旋酶的作用是使DNA兩條鏈的氫鍵兩條鏈的氫鍵斷開；斷開；DNA聚合酶的作用是將單個脫氧核苷聚合酶的作用是將單個脫氧核苷酸加到已有的單鏈片段的酸加到已有的單鏈片段的3端上，需要模板端上，需要模板; DNA連接酶連接的是兩條連接酶連接的是兩條DNA片段的缺口，片段的缺口，不需要模板。不需要模板。 PCR過程與細胞內(nèi)的過程與細胞內(nèi)的DNA復(fù)制過程相復(fù)制過程相比，主要有兩點不同，它們是比，主要有兩點不同，它們是()PCR過程需要的引物是人工合成的單鏈過程需要的引物是人工合成的單鏈DNAPCR過程不需要過程不

7、需要DNA聚合酶聚合酶PCR過程中過程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而的解旋不依靠解旋酶，而是通過對反應(yīng)溫度的控制來實現(xiàn)的是通過對反應(yīng)溫度的控制來實現(xiàn)的PCR過程中，過程中，DNA不需要解旋，直接以雙不需要解旋，直接以雙鏈鏈DNA為模板進行復(fù)制為模板進行復(fù)制例例1A BC D【解析解析】PCR過程與細胞內(nèi)的過程與細胞內(nèi)的DNA復(fù)制過復(fù)制過程相比較，主要有兩點不同：程相比較，主要有兩點不同：PCR過程需過程需要的引物是人工合成的單鏈要的引物是人工合成的單鏈DNA，長度通常，長度通常為為1540個核苷酸。個核苷酸。PCR過程中，過程中，DNA解解旋不依賴解旋酶，而是通過對反應(yīng)溫度的控旋不依賴解旋酶，

8、而是通過對反應(yīng)溫度的控制來實現(xiàn)的。制來實現(xiàn)的?！敬鸢复鸢浮緾變式訓(xùn)練變式訓(xùn)練(2012成都七中高二檢測成都七中高二檢測)下列關(guān)于下列關(guān)于DNA復(fù)制復(fù)制和和PCR的描述中，正確的是的描述中，正確的是()ADNA聚合酶不能從頭開始合成聚合酶不能從頭開始合成DNA，只，只能從能從5端延伸端延伸DNA鏈鏈BDNA復(fù)制不需要引物復(fù)制不需要引物C引物與引物與DNA母鏈通過堿基互補配對進行母鏈通過堿基互補配對進行結(jié)合結(jié)合DPCR擴增的對象是氨基酸序列擴增的對象是氨基酸序列解析：選解析：選C。由于。由于DNA聚合酶不能從頭開始聚合酶不能從頭開始合成合成DNA，只能從，只能從3端延伸端延伸DNA鏈，故鏈，故DN

9、A復(fù)制需要引物，而且它與復(fù)制需要引物，而且它與DNA母鏈通過堿基母鏈通過堿基互補配對結(jié)合。互補配對結(jié)合。PCR擴增的對象是擴增的對象是DNA，而，而不是氨基酸。不是氨基酸。2.PCR擴增過程擴增過程變性變性復(fù)性復(fù)性延伸延伸預(yù)變性預(yù)變性95 ，5 min55 ，1 min72 ，1 min重復(fù)重復(fù)30次次95 ，30 s55 ，30 s72 ，1 min最后一最后一次循環(huán)次循環(huán)72 ，1 min圖示：圖示：3.DNA擴增數(shù)目的理論計算擴增數(shù)目的理論計算理論上理論上DNA擴增呈指數(shù)增長。若只有一條擴增呈指數(shù)增長。若只有一條DNA模板，則復(fù)制模板，則復(fù)制n次后有次后有2n條；若一開始條；若一開始有有

10、m條條DNA模板，則復(fù)制模板，則復(fù)制n次后有次后有m2n條；條；實際操作過程中，由于無關(guān)變量的影響，一實際操作過程中，由于無關(guān)變量的影響，一般來說實驗值要略小于理論值。般來說實驗值要略小于理論值。 近近20年來，年來，PCR技術(shù)技術(shù)(多聚酶鏈?zhǔn)蕉嗑勖告準(zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng))成為分子生物學(xué)實驗室的一種常規(guī)實驗成為分子生物學(xué)實驗室的一種常規(guī)實驗手段，其原理是利用手段，其原理是利用DNA半保留復(fù)制，在試半保留復(fù)制，在試管中進行管中進行DNA的人工復(fù)制的人工復(fù)制(如圖如圖)，在短時間，在短時間內(nèi)內(nèi),將將DNA擴增幾百萬倍甚至幾十億倍，從而擴增幾百萬倍甚至幾十億倍，從而使實驗室所需要的遺傳物質(zhì)不再受限于活的使實驗

11、室所需要的遺傳物質(zhì)不再受限于活的生物體。生物體。例例2(1)加熱使加熱使DNA雙鏈間的雙鏈間的_鍵完全鍵完全打開，稱為打開，稱為_；而在細胞中是在；而在細胞中是在_酶的作用下進行的。酶的作用下進行的。(2)如果只需要大量克隆模板如果只需要大量克隆模板DNA中間的某中間的某個特定區(qū)段，應(yīng)該加入個特定區(qū)段，應(yīng)該加入_種特定的種特定的引物。當(dāng)溫度降低至引物。當(dāng)溫度降低至55 C時，引物與兩條時，引物與兩條“舒展舒展”的模板的特定位置結(jié)合，在的模板的特定位置結(jié)合，在DNA聚聚合酶的作用下，只能在引物的合酶的作用下，只能在引物的_端連端連接脫氧核苷酸，兩條子鏈的延伸方向都是接脫氧核苷酸，兩條子鏈的延伸方

12、向都是_。(3)PCR技術(shù)的必需條件，除了模板、原料、技術(shù)的必需條件，除了模板、原料、酶之外，至少還有三個條件，即液體環(huán)境、酶之外，至少還有三個條件，即液體環(huán)境、適宜的適宜的_和和_，前者由，前者由_自動調(diào)控，后者則靠自動調(diào)控，后者則靠_來維持。來維持。(4)通過通過PCR技術(shù)使技術(shù)使DNA分子大量復(fù)制，如果分子大量復(fù)制，如果將一個用將一個用15N標(biāo)記的標(biāo)記的DNA分子放入試管中，以分子放入試管中，以14N標(biāo)記的脫氧核苷酸為原料，連續(xù)復(fù)制四次標(biāo)記的脫氧核苷酸為原料，連續(xù)復(fù)制四次之后，則之后，則15N標(biāo)記的標(biāo)記的DNA分子占全部分子占全部DNA分分子總數(shù)的比例是子總數(shù)的比例是_?！窘馕鼋馕觥?1

13、)PCR技術(shù)利用熱變性原理使技術(shù)利用熱變性原理使DNA雙鏈之間的氫鍵斷裂，稱為變性，而在雙鏈之間的氫鍵斷裂，稱為變性，而在細胞內(nèi)是在解旋酶的作用下使氫鍵斷裂。細胞內(nèi)是在解旋酶的作用下使氫鍵斷裂。(2)PCR分為三個基本反應(yīng)步驟分為三個基本反應(yīng)步驟:變性變性(95 )、復(fù)性復(fù)性(55 )、延伸、延伸(72 )，其特異性依賴于，其特異性依賴于與靶序列互補的引物，引物是兩段與待擴增與靶序列互補的引物，引物是兩段與待擴增DNA序列互補的片段，兩引物之間的距離決序列互補的片段，兩引物之間的距離決定擴增片段的長度。定擴增片段的長度。由于由于DNA聚合酶不能從頭開始合成聚合酶不能從頭開始合成DNA，只，只能

14、從引物的能從引物的3端延伸端延伸DNA鏈，則鏈，則DNA的合成的合成方向總是從子鏈的方向總是從子鏈的5端向端向3端延伸。端延伸。(3)PCR技術(shù)與細胞內(nèi)的技術(shù)與細胞內(nèi)的DNA復(fù)制不完全相同，除了復(fù)制不完全相同，除了需要模板、原料、酶以外，至少還需要液體需要模板、原料、酶以外，至少還需要液體環(huán)境環(huán)境(穩(wěn)定的緩沖液穩(wěn)定的緩沖液)，每一個步驟需要適宜，每一個步驟需要適宜的溫度和酸堿度等。的溫度和酸堿度等。(4)一個一個DNA分子連續(xù)復(fù)分子連續(xù)復(fù)制四次之后，形成制四次之后，形成16個個DNA分子，分子，15N標(biāo)記標(biāo)記的的DNA分子有分子有2個，則個，則15N標(biāo)記的標(biāo)記的DNA分子占分子占全部全部DNA

15、分子總數(shù)的比例為分子總數(shù)的比例為1/8?！敬鸢复鸢浮?1)氫氫變性變性解旋解旋(2)兩兩3從子鏈的從子鏈的5端向端向3端延伸端延伸(3)溫度溫度酸堿度酸堿度PCR儀儀緩沖液緩沖液(4)1/8互動探究互動探究(1)PCR中由堿基錯配而引起哪種變異？中由堿基錯配而引起哪種變異？(2)假設(shè)對一個假設(shè)對一個DNA進行擴增，第一次循環(huán)進行擴增，第一次循環(huán)時某一條模板鏈上發(fā)生堿基錯配，則擴增若時某一條模板鏈上發(fā)生堿基錯配，則擴增若干次后檢測所用干次后檢測所用DNA的擴增片段，與原的擴增片段，與原DNA相應(yīng)片段相同的占多少？相應(yīng)片段相同的占多少？【提示提示】(1)基因突變?；蛲蛔?。(2)50%。【誤區(qū)警示

16、誤區(qū)警示】關(guān)于關(guān)于DNA的擴增方向容易發(fā)的擴增方向容易發(fā)生混淆，為了明確表示生混淆，為了明確表示DNA的方向，通常將的方向，通常將DNA的羥基的羥基(OH)末端稱為末端稱為3端，磷酸基團端，磷酸基團的末端稱為的末端稱為5端，子鏈從引物端，子鏈從引物3端開始延伸，端開始延伸，而子鏈的合成方向是從而子鏈的合成方向是從5端向端向3端延伸。端延伸。要點三要點三實驗操作與結(jié)果分析實驗操作與結(jié)果分析1.檢測檢測PCR擴增效果的過程擴增效果的過程2.結(jié)果分析結(jié)果分析DNA片段的擴增是否成功的判斷片段的擴增是否成功的判斷(1)對于電泳檢測的方法，可以通過在紫外線對于電泳檢測的方法，可以通過在紫外線下直接觀察下

17、直接觀察DNA帶的分布及粗細程度來評價帶的分布及粗細程度來評價擴增的效果。擴增的效果。(2)擴增不成功的可能原因有：擴增不成功的可能原因有：漏加了漏加了PCR的反應(yīng)成分；的反應(yīng)成分；各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)；各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)；PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)?。程序設(shè)置不當(dāng)?shù)取?在在PCR擴增擴增DNA的實驗中，預(yù)計一的實驗中，預(yù)計一分子分子DNA經(jīng)過經(jīng)過30次循環(huán)后，應(yīng)該得到次循環(huán)后，應(yīng)該得到230個個DNA分子，但是結(jié)果只有約分子，但是結(jié)果只有約210個個DNA分子，分子，那么不是出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因是那么不是出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因是()ATaq DNA聚合酶的活力不夠，或活性受聚合酶的活力不夠，或活性受到抑制到

18、抑制B系統(tǒng)設(shè)計欠妥系統(tǒng)設(shè)計欠妥C循環(huán)次數(shù)不夠循環(huán)次數(shù)不夠D復(fù)性時，部分親鏈與親鏈結(jié)合復(fù)性時，部分親鏈與親鏈結(jié)合例例3【解析解析】如果如果Taq DNA聚合酶活力不夠，聚合酶活力不夠，或活性受到抑制，則導(dǎo)致催化效率降低，得或活性受到抑制，則導(dǎo)致催化效率降低，得到的產(chǎn)物比預(yù)期的少。如果到的產(chǎn)物比預(yù)期的少。如果PCR系統(tǒng)設(shè)置不系統(tǒng)設(shè)置不妥，達不到預(yù)期的結(jié)果。復(fù)性時，模板鏈既妥，達不到預(yù)期的結(jié)果。復(fù)性時，模板鏈既可以和引物結(jié)合，互補的模板鏈也可相互結(jié)可以和引物結(jié)合，互補的模板鏈也可相互結(jié)合，從而導(dǎo)致產(chǎn)物減少。合，從而導(dǎo)致產(chǎn)物減少?！敬鸢复鸢浮緾變式訓(xùn)練變式訓(xùn)練DNA在在_nm的紫外線波段存在一強烈的的紫外線波段存在一強烈的吸收峰，其峰值的大小與吸收峰，其峰值的大小與DNA含量有關(guān)含量有關(guān)()A220 B240C260 D280解析：選解析：選C。DNA在在260 nm的紫外線波段存的紫外線波段存在一強烈的吸收峰，其峰值的大小與在一強烈的吸收峰，其峰值的大小與DNA含含量有關(guān)。據(jù)此，可以進行量有關(guān)。據(jù)此，可以進行DNA含量的測定。含量的測定。