高中生物多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課件 人教版選修1

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1、 PCR概述 PCR原理 PCR實(shí)驗(yàn)操作 PCR應(yīng)用PCR技術(shù)概論技術(shù)概論聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80 年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA 片段于數(shù)小時內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA 供分析研究和檢測鑒定。過去幾天幾星期才能做到的事情，用PCR 幾小時便可完成。PCR 技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑。溫故而知新溫故而知新（DNA的結(jié)構(gòu)與復(fù)制）

2、的結(jié)構(gòu)與復(fù)制）一、一、DNA結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)：1、DNA的基本單位：的基本單位：脫氧核苷酸脫氧核苷酸堿基堿基脫氧核糖P2、化學(xué)結(jié)構(gòu)：、化學(xué)結(jié)構(gòu)：二、二、DNA復(fù)制：復(fù)制：1、復(fù)制方式：、復(fù)制方式：2、DNA復(fù)制所需條件：復(fù)制所需條件：模板：模板：_原料：原料：_酶：酶：_能量：能量：_引物：引物：_適宜的溫度與酸堿度適宜的溫度與酸堿度DNA的兩條鏈的兩條鏈四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸解旋酶、解旋酶、DNA聚合酶聚合酶DNA或或RNA片段片段ATPDNA聚合酶不能從頭開始合成聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從，只能從3端延伸端延伸DNA鏈。鏈。理論基礎(chǔ)理論基礎(chǔ)1、PCR原理原理體外模擬體外模擬DNA

3、復(fù)制的過程，對復(fù)制的過程，對DNA進(jìn)進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù)。行擴(kuò)增的技術(shù)。其所需條件其所需條件（即標(biāo)準(zhǔn)的（即標(biāo)準(zhǔn)的pcr反應(yīng)體系）：反應(yīng)體系）： 10擴(kuò)增緩沖液擴(kuò)增緩沖液 10ul4種種dNTP混合物混合物 各各200umol/l2種引物種引物 各各10100pmol模板模板DNA 0.12ugTaq DNA聚合酶聚合酶 2.5umg2+ 1.5mmol/l加蒸餾水至加蒸餾水至 100ul參加參加pcr反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種，即引物、反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種，即引物、酶、酶、dNTP、模板和、模板和mg2+1、PCR原理原理其中引物是其中引物是pcr特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，pcr 產(chǎn)物的特異產(chǎn)物

4、的特異性取決于引物與模板性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用的寡核苷酸鏈做引物，利用pcr就可將模板就可將模板DNA在在體外大量擴(kuò)增。引物長度：體外大量擴(kuò)增。引物長度： 15-30bp，常用為，常用為20bp左右。左右。2、PCR一般過程一般過程（變性（變性退火退火延伸）延伸）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（1）按配方將所需試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌上（準(zhǔn)備）按配方將所需試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌上（準(zhǔn)備）（2）用微量移液器按配方往微量離心管中依次加入）用微量移液器按配方往微量離心管中依

5、次加入各組分（移液）各組分（移液）（3）蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁）蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁（混合）（混合）（4）將微量離心管放在離心機(jī)上（離心）將微量離心管放在離心機(jī)上（離心）（5）將微量離心管放入）將微量離心管放入PCR儀中，設(shè)置好儀中，設(shè)置好PCR儀儀的循環(huán)程序（反應(yīng)）的循環(huán)程序（反應(yīng)）PCR儀儀PCR反應(yīng)反應(yīng)（無（無PCR儀時）儀時）PCR技術(shù)應(yīng)用十分廣泛，可用于分子生物學(xué)、遺傳工程、腫瘤學(xué)、法醫(yī)學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)及病毒和病原體的診斷等各個領(lǐng)域。 臨床應(yīng)用舉例： 1. 遺傳病診斷：型、型地中海貧血癥，血友病以及苯丙酮尿癥的產(chǎn)前胎兒診斷等。 2. 病毒感染疾病診斷：肝炎病毒系列(HAV、HBV、HCV、HDV、HEV等)，艾滋病毒(HIV-I)、人乳頭瘤病毒(HPV)、人巨細(xì)胞病毒(HCMV)、風(fēng)疹病毒(RV)、單純皰疹病毒(HSV)、EB病毒(EBV)等。 3. 傳染性病原體檢測：沙眼衣原體、肺炎支原體、立克次氏體、真菌、梅毒螺旋體、瘧原蟲、弓形體、結(jié)核桿菌、分枝桿菌等。 4. 腫瘤基因檢測：癌基因、抑癌基因、腫瘤藥敏基因等。PCR簡介簡介PCR實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作