生物化學技術(shù)補充1吸收光譜分析法.ppt

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補充1光譜檢驗技術(shù),概念及分類,概念利用各種化學物質(zhì)具有發(fā)射、吸收或散射光譜譜系的特征，來確定物質(zhì)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或含量的技術(shù)分類（根據(jù)物質(zhì)對光譜響應特征的不同，可將其分為）發(fā)射光譜分析技術(shù)吸收光譜分析技術(shù)散射光譜分析技術(shù)在生化技術(shù)方面，光譜分析是一類十分重要的技術(shù)，應用極為廣泛；它既可以研究物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，也可以對特定物質(zhì)進行定性或定量分析,一、吸收光譜分析法,吸收光譜是指波長連續(xù)分布的光透過物質(zhì)時，某些波長的光被物質(zhì)吸收而產(chǎn)生暗線或暗帶組成的光譜吸收光譜分析法利用吸收光譜對物質(zhì)進行定量的技術(shù)稱為吸收光譜分析法，是實驗室最常用的分析技術(shù)之一特點它操作簡便、快速，線性范圍較寬，應用廣泛分類目前最常應用的技術(shù)有可見—紫外分光光度法和原子吸收分光光度法,(一)可見-紫外分光光度法,1.原理L-B爾定律（可見-紫外光區(qū)波長為200~760nm，其中200~400nm為紫外光）2.方法①對比法②標準曲線法,,3.排除干擾的方法,當兩種或兩種以上的組分共存時，可出現(xiàn)吸收光譜重疊的情況；測定某一組分時，其他組分對它會有不同程度的干擾，此時可采用雙波長法排除雜質(zhì)的干擾吸收光譜相互重疊的a、b兩組分。選擇各自的測得波長λ1和λ2，使干擾組分在這兩個波長處的吸光系數(shù)相同，而欲測組分在兩波長處的吸光系數(shù)有顯著的區(qū)別。用這樣兩個波長測得混合物溶液的吸光度差值ΔA，只與欲測組分的濃度成正比，而不受共存組分的影響,在測得波長λ1和λ2處測得混合物的吸光度分別是A1a+b和A2a+b，則ΔAa+b=A1a+b-A2a+b=A1a+A1b–A2a–A2b=ΔAa+ΔAb因組分a在λ1和λ2處的吸光系數(shù)相等，即欲測組分b在兩波長處的吸光系數(shù)相差愈大，則靈敏度愈高。用雙波長法還能消除樣品溶液背景吸收的干擾和混濁的干擾，提高測定的準確性。近年來由于新的、靈敏度高、選擇性好的顯色劑和掩蔽劑不斷出現(xiàn)，一般不經(jīng)分離過程即可直接比色測定；還可采用聯(lián)立方程法、等吸收點法等解決定量中的干擾問題,3.分光光度計的光源檢查和波長校正,(1)光源檢查即波長的初步檢查不論何種分光光度計在校正之前都要先檢查光源。檢查方法是將波長選定在580nm處，將狹縫開到最大(或打開光門)，打開鎢燈，在比色皿內(nèi)插一白紙片。光源正常時，應看到均勻的黃色光斑，邊緣清晰整齊；如果明暗不勻，形狀異常，則應調(diào)節(jié)光源燈的位置,常用的方法有①用含某些特定元素的玻璃來較正最常用的有鐠釹玻璃、鈥玻璃等。校正時將這種玻璃放在比色皿座上，以空氣調(diào)0，測定幾個吸收峰值的波長是否相符。如最常用的測定鐠釹濾光片在585nm的雜光水平應在5%以內(nèi)②可利用某些標準溶液進行校正如標準重鉻酸鉀溶液(在1000ml的0.05mol／L的KOH溶液中溶解0.0400g純重鉻酸鉀．(K2CrO4))，在25℃以1cm比色皿在各波長測定其標準吸光度，如表2~1。重鉻酸鉀溶液的優(yōu)點是在紫外區(qū)270nm及370nm處有兩個最大吸收,(2)波長校正,(二)原子吸收分光光度法,1.原理基于光源輻射出具有待測元素特征譜線的光，通過原子化器被其中待測元素的基態(tài)原子所吸收，根據(jù)吸收而導致輻射特征譜線光被減弱的程度來測定待測元素的含量2.方法標準曲線法、直接比較法和標準加入法主要用于鈣、鎂、銅、鉛、鋅等微量元素的測定3.原子吸收分光光度計結(jié)構(gòu)特點有單光束型和雙光束型兩類。主要由光源、原子化器、單色器和檢測系統(tǒng)組成,在微量元素測定中，首先根據(jù)有關(guān)資料了解儀器待測元素的靈敏度和檢出限①對靈敏度達不到要求的可以選擇最靈敏的吸收線，選用小的狹縫寬度，采用較小的燈電流和最佳火焰類型及狀態(tài)等來提高靈敏度②測定物質(zhì)溶解后干擾要小，易于噴霧和原子化，稀釋后測定結(jié)果應在線性范圍內(nèi)③儀器通電后要預熱30min，使光源的發(fā)射穩(wěn)定。狹縫的寬度影響光的譜帶寬度與檢測器的接受能量，使用較寬的狹縫可以增加光強度，提高信噪比，改善檢出限④當吸收線附近有干擾譜線與非吸收光存在時，使用較寬的狹縫會降低靈敏度。在火焰化法中，火焰的類型是影響原子化效率的主要因素。因此，需通過調(diào)節(jié)燃氣與助燃氣的流量獲得最佳原子化條件，以達到最高的測定靈敏度總之，一種元素的原子吸收法測定需要考慮儀器工作的各種條件，以期達到實驗的最佳結(jié)果,二、發(fā)射光譜分析法,基本概念熒光某些物質(zhì)吸收了一定波長的光能后，獨自從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，此類分子經(jīng)與同類或其他類分子相互碰撞，消耗相當，而下降至第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能階。最低能階下降到基態(tài)，同時發(fā)射出較原來所吸收的頻率低、波長長的光能，稱為熒光熒光分析法對熒光物質(zhì)進行定量測定的方法發(fā)射光譜分析法分類熒光分析法火焰光譜法,(一)熒光分析的基本原理,1.原理利用元素的原子所發(fā)射的共振熒光波長的差異，可確定元素的種類或物質(zhì)分子中某種結(jié)構(gòu)，據(jù)熒光的強弱可以測定物質(zhì)的含量2.方法熒光分析定量是基于熒光物質(zhì)的稀溶液，在一定的溫度下，當激發(fā)光的波長、強度、熒光測定波長以及液層厚度一定時，所測得的熒光強度F與該溶液中熒光物質(zhì)的濃度C成正比，即F=kC。采用標準曲線法或標準對照法，對熒光物質(zhì)進行定量。在一定條件下，熒光物質(zhì)的濃度愈大，發(fā)射的熒光強度也愈強（熒光分析的靈敏度比分光度法高，通?？蛇_10-13g／L，對特定物質(zhì)甚至可達到10-15g／L）,(二)影響熒光分析的因素,1.溶劑配制溶液的溶劑除水外，常用的乙醇、環(huán)己烷、四氯化碳、氯仿、丙酮等溶劑中常含有熒光雜質(zhì)，影響測定，必須經(jīng)過重蒸餾等凈化處理才能使用2.熒光物質(zhì)的濃度熒光強度與溶液的線性關(guān)系只限于很稀的溶液，符合下列方程：F=kCI0，式中F為熒光強度，C為溶液的濃度，I0為激發(fā)光強度，k為熒光效率。對于較濃的溶液，熒光強度并不隨濃度增大而增加，相反，卻隨溶液濃度增大而下降。①當熒光物質(zhì)濃度高時，分子間碰撞增加，使熒光強度減弱；另外，②濃度較大時，激發(fā)光被表面的熒光物質(zhì)所吸收，產(chǎn)生強烈的熒光，以致使后面的溶液不易受照射而不發(fā)光3.溫度大多數(shù)情況下，溫度升高，分子間碰撞次數(shù)便增加，消耗分子的內(nèi)部能量而產(chǎn)生自熄滅現(xiàn)象；溫度降低時，則熒光強度增大,(三)熒光分析技術(shù)的應用,熒光分析法靈敏度高、取樣量少，廣泛應用于各領(lǐng)域，在生化技術(shù)領(lǐng)域主要用于糖類、胺類、甾族化合物、DNA與RNA、酶與輔酶、維生素等物質(zhì)的分析測定熒光強度常用熒光分光光度計，它主要包括激發(fā)光源、一對單色器、比色杯和檢測器等部件,熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜和熒光光譜,激發(fā)光譜與熒光光譜,激發(fā)光譜（吸收光譜）熒光物質(zhì)吸收紫外光后被激發(fā)出熒光，如果將激發(fā)光的光源用單色器使其分光后，測定在每一波長的激發(fā)光照射下，物質(zhì)發(fā)射的熒光，以熒光強度對激發(fā)光波長作圖，得到熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜熒光光譜（發(fā)射光譜）如果使激發(fā)光的波長和強度保持不變，而讓物質(zhì)所發(fā)生的熒光通過單色器色散，依次將不同波長的熒光照射到單色器上，并依次測定其熒光強度，然后以熒光強度對相應的熒光作圖，得到該物質(zhì)的熒光發(fā)射光譜,三、散射光譜分析法,散射光譜分析法測定光通過溶液混懸顆粒后的吸光度或光散射程度的一類定量方法散射比濁法是指一定波長的光沿水平軸照射，通過溶液時遇到抗原抗體復合物粒子，光線被粒子顆粒折射，發(fā)生偏轉(zhuǎn)，光線偏轉(zhuǎn)的角度與發(fā)射光的波長以及抗原抗體復合物顆粒大小、數(shù)目密切相關(guān)。散射光的強度與復合物的含量成正比透射比濁法是測定一定體積的溶液通過的光線量(光通量)，當光線通過時，由于溶液中存在抗原—抗體復合物粒子對光線的反射和吸收，引起透射光的減少，測得的光通量和抗原抗體復合物的量成反比,發(fā)射光譜分析法,,(一)散射免疫比濁分析1．散射顆粒與散射光的關(guān)系懸浮在反應溶液中的分子，無論是固體還是膠體粒子都可以是散射中心。當入射光通過時，如果顆粒直徑比入射光的波長小很多，則散射光比較均勻的分布于顆粒的四周，稱為Rayleigh散射；如果顆粒直徑遠遠地大于入射光的波長，則散射光的分布呈明顯不勻稱為Mie散射,,2.反應物含量與散射濁度抗原—抗體結(jié)合反應中，遵守典型的Heidelberger曲線,(二)免疫透射比濁分析,原理試驗中設(shè)計檢測抗體過量，待測樣品中的Ig在反應介質(zhì)中與相應的檢測抗體發(fā)生抗原—抗體反應，形成不溶性復合物，在聚乙二醇(PEG)的作用下，加速抗原-抗體復合物的形成并增加其穩(wěn)定性，使反應介質(zhì)的濁度發(fā)生改變，利用分光光度計測定光線被吸收的量，待測樣本的抗原含量與吸光度成正比，光通量與抗原含量成反比。利用標準品做出標準曲線，待測樣本的濁度變化在標準曲線上計算出來,