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在旋轉(zhuǎn)生物接觸器中形成的氧化亞鐵硫桿菌生物膜的性質(zhì)
L. Nikolova, D. Karamanevb,?, V. Mamatarkovaa,
D. Mehochev a, D. Dimitrov a
（a. 索菲亞大學(xué)生物系，8 Dr燦可夫大道，1421 So?a, Bulgaria b. 安大略大學(xué)化學(xué)工程與生物工程系，倫敦，安大略，加拿大，N6G 5B9）
2001年三月八日收到；2002年二月二十七日修訂后接受
摘要:本文在穩(wěn)態(tài)條件下對(duì)在旋轉(zhuǎn)生物接觸器表面上形成的氧化亞鐵硫桿菌生物膜的理化性質(zhì)進(jìn)行了研究。主要的獨(dú)立變量是生物反應(yīng)器中培養(yǎng)基（鐵）的濃度。研究表明，生物膜的厚度越大，生物膜的密度就越小，當(dāng)輸入的亞鐵濃度為1和2.1克/升之間時(shí)，在生物膜中孔的比表面積最大。在培養(yǎng)基濃度在0.49和14.21克/升之間時(shí)，生物膜的體積幾乎是相同的，對(duì)應(yīng)的氧化率為0.35～8.6 g/m2 .h。
關(guān)鍵詞：生物膜；生物反應(yīng)器；動(dòng)力學(xué)參數(shù)；氧化亞鐵硫桿菌；鐵氧化
1.前言
細(xì)菌氧化亞鐵硫桿菌（最近更名為氧化亞鐵硫桿菌）在固體表面形成生物膜載體的能力被認(rèn)為是高性能的生物反應(yīng)器的開(kāi)發(fā)來(lái)處理金屬浸出技術(shù)、凈化氣體含硫化合物和酸性礦山廢水的需要?！?】生物膜本身一直是眾多研究的課題，包括化學(xué)、生物組成部分【2，3】和與固相載體的相互作用【4】。但是，這里缺少一個(gè)關(guān)于生物膜密度，水含量和孔隙度特性的理化數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)可能對(duì)生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)以及數(shù)學(xué)模型的建立很有幫助【5】。
這項(xiàng)工作的主要目的是揭示Ｔ氧化亞鐵硫桿菌生物膜的主要理化性質(zhì)和亞鐵氧化率，培養(yǎng)基中Fe2+和產(chǎn)物中Fe３+濃度的一個(gè)函數(shù)關(guān)系。
２．材料和方法
2.1.生物反應(yīng)器
一種實(shí)驗(yàn)室型的旋轉(zhuǎn)生物接觸器已經(jīng)被使用。這種裝置在以前就被描述過(guò)【６】。它由相同的六個(gè)2.3L工作容積部分安裝在同一個(gè)軸上組成。這樣保證了有一個(gè)相同的轉(zhuǎn)速。每個(gè)部分包含七個(gè)塑料（PVC）盤(pán)，直徑0.2m，安裝在水平旋轉(zhuǎn)的不銹鋼軸上。所有實(shí)驗(yàn)均在26轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行。從鐵的氧化效率的角度上認(rèn)為這個(gè)速度是最優(yōu)的?！荆贰扛鞑糠知?dú)立操作作為一個(gè)單獨(dú)的生物反應(yīng)器（見(jiàn)表1）。輸入的亞鐵濃度（表1）被選為封面的紅細(xì)胞的應(yīng)用范圍。
接種后，初始的生物膜的形成是在第一個(gè)20天內(nèi)反復(fù)進(jìn)行的。初始底物濃度，如表1所示。在第二步中，生物反應(yīng)器被切換到液體停留時(shí)間為400min的連續(xù)操作。（對(duì)應(yīng)的稀釋率為0.15h-1。在批處理操作期間，輸入的亞鐵濃度與起始的濃度相同。在恒溫槽中液體的溫度保持恒定在18.5℃；環(huán)境空氣溫度為20±2℃。進(jìn)料的pH值保持在2。生物反應(yīng)器中液體的pH要測(cè)量但不控制它的變化。通過(guò)測(cè)量發(fā)現(xiàn)所有的反應(yīng)器內(nèi)液體的pH值在2.05和2.25之間。所有的結(jié)果報(bào)告在接種后的第三十五天和第三十八天期間獲得，這時(shí)鐵的氧化速率處于穩(wěn)態(tài)條件。生物膜樣品取自生物膜的不同徑向位置。
表1 在穩(wěn)態(tài)條件下輸入（初始）和輸出底物的濃度
反應(yīng)器#
輸入（起始）亞鐵濃度（g/L）
輸出亞鐵濃度（g/L）
鐵氧化率
(g/L.h)
1
0.49
0.04
0.0675
2
1.01
0.10
0.136
3
2.13
0.32
0.271
4
3.95
0.33
0.543
5
9.06
1.91
1.07
6
14.21
3.27
1.64
2.2.菌株和介質(zhì)
所有的部分都已經(jīng)同100ml從保加利亞中部一個(gè)銅礦礦山排水水域收集的含108細(xì)胞/毫升的T.氧化亞鐵硫桿菌菌株G-15（索菲亞大學(xué)生物系收集）接種。該菌株在西爾弗曼和倫德格倫的9K培養(yǎng)基【8】上培養(yǎng)。所有使用的化學(xué)品都被分析等級(jí)（默克公司，德國(guó)）。
2.3. 生物膜特性
在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中目測(cè)觀察生物膜的顏色。通過(guò)在110℃下干的生物膜和濕的生物膜重量的不同測(cè)量生物膜的含水量。用千分尺測(cè)量生物膜的厚度。從生物膜的濕重測(cè)定生物膜的密度；采用比重瓶測(cè)定其體積。在經(jīng)過(guò)525或1000℃下烘干使生物膜至恒重后確定在生物膜中揮發(fā)的固體。通過(guò)自動(dòng)孔徑測(cè)定儀測(cè)定生物膜的孔徑分布和內(nèi)孔表面(Micromeretics auto-pore 9200)。在其溶解在濃鹽酸中測(cè)定了生物膜中鐵總含量。使用sulfosalycilic作為指示劑，通過(guò)分光光度法測(cè)定得到的溶液中鐵的濃度?！?】
3.結(jié)果
在穩(wěn)態(tài)條件下生物膜的厚度（35–38天）作為輸入的鐵濃度的函數(shù)如圖1所示?？梢钥闯觯锬さ暮穸入S著輸入亞鐵濃度從0.49到2.13 g / L的增加而增加，相應(yīng)的鐵的氧化率0.067和0.27 g / L.H之間，并且在達(dá)到一個(gè)最大值后，高鐵的氧化率值下降。
輸
圖1.鐵濃度與生物膜厚度的關(guān)系
圖2.鐵濃度和生物膜密度的關(guān)系
生物膜的密度(圖2)，當(dāng)輸入的Fe2+的濃度為2.13 g/L時(shí)，生物膜的密度下降到一個(gè)局部最低點(diǎn)。在鐵濃度的進(jìn)一步增加下生物膜的密度也增加。通過(guò)視覺(jué)觀察看出，隨著輸入底物濃度的增加，當(dāng)輸入底物濃度最低時(shí)生物反應(yīng)器中（生物反應(yīng)器# 1–3）的生物膜呈現(xiàn)淺黃色，暗黃色（生物反應(yīng)器# 4），褐色（生化反應(yīng)器# 5）和紅棕色（生物反應(yīng)器# 6）。類似的生物膜性能在以前的實(shí)驗(yàn)研究中也被發(fā)現(xiàn)，包括使用逆流流化床生物反應(yīng)器。在生物反應(yīng)器運(yùn)行過(guò)程的6個(gè)月中，每個(gè)反應(yīng)器的顏色保持不變?！?】黏液（可能是胞外多糖）的形成也可以通過(guò)視覺(jué)觀察到。只有在輸入亞鐵濃度為0.49和2.13 g / L之間的生物反應(yīng)器才觀察到有黏液的形成（生物反應(yīng)器# 1–3）。在#4生物反應(yīng)器中觀察到有少量的黏液形成，而在#5和#6即輸入鐵濃度較高的生物反應(yīng)器內(nèi)顯然沒(méi)有檢查到黏液的形成。生物膜顏色的差異可以歸因于存在或不存在胞外多糖：在較低的鐵含量下，多糖的量較低，生物膜的顏色較淺。然而要得到更確切的結(jié)論需要有更深入的研究。
干的相對(duì)恒定的生物膜中鐵的含量與輸入的鐵的濃度函數(shù)關(guān)系（見(jiàn)圖3）。
在525和1000?C下測(cè)定的生物膜中的揮發(fā)性固體（見(jiàn)圖4）。在這兩種情況下，當(dāng)輸入鐵濃度為1和2.13個(gè)/L之間時(shí)觀測(cè)到最低值。
圖5所示為生物膜中的含水量。表明其含水量隨著輸入底物濃度的增加而減少，直到達(dá)到了一個(gè)平穩(wěn)值為60%（W / W）。
生物膜孔比表面也被測(cè)定，它與輸入底物濃度的函數(shù)關(guān)系（見(jiàn)圖6）。在2.13 g / L的觀察到最大的表面，此濃度為最佳值。在底物濃度為3.9 g / L或更高濃度時(shí)，處于平穩(wěn)時(shí)期。
圖3.鐵濃度與生物膜中鐵含量的關(guān)系
圖4.鐵濃度與生物膜中揮發(fā)性固體的關(guān)系
圖5.鐵的濃度與生物膜中含水量的函數(shù)關(guān)系
圖6.鐵的濃度與生物膜孔的比表面積的函數(shù)關(guān)系
4.結(jié)論
通過(guò)幾個(gè)有趣的觀察，可以得到一個(gè)分析的結(jié)果。眾所周知，T.氧化亞鐵硫桿菌的生物膜主要是黃鉀鐵礬，它是一個(gè)多孔的無(wú)機(jī)物質(zhì)，它的化學(xué)通式為AFe3(SO4)2(OH)6，其中A可以是K+,Na+,NH4+ 或 H3O+。黃鉀鐵礬數(shù)量與鐵的氧化量（鐵的氧化率）成比例這一假設(shè)應(yīng)該是合乎邏輯的。然而，在鐵的氧化率近25倍的增加（從0.0675到1.64個(gè)/ L .和），對(duì)應(yīng)于輸入的鐵濃度為0.49和14.2g/L之間時(shí)，結(jié)果是生物膜厚度幾乎相同，具有幾乎恒定的密度（圖1和2）。T.桿菌細(xì)胞貼附在黃鉀鐵礬孔隙表面。如果假定一個(gè)恒定的細(xì)胞底物產(chǎn)率系數(shù)，那么細(xì)胞的數(shù)量應(yīng)該與鐵的氧化速率處于一個(gè)成比例的穩(wěn)態(tài)。然而，當(dāng)氧化率從0.0675增加到1.64 g / L.h時(shí)，無(wú)論是生物膜的厚度（圖1）還是孔的表面（圖6）都是同一量級(jí)的。因此，生物反應(yīng)器#1和#6總孔表面相似。它表明，T.氧化亞鐵硫桿菌在孔隙表面形式單層【5】，預(yù)計(jì)總的固定化細(xì)胞在這些生物反應(yīng)器是幾乎恒定的。這可能會(huì)導(dǎo)致一個(gè)可能的結(jié)論，# 1生物反應(yīng)器產(chǎn)量系數(shù)比# 6高出25倍。然而，很可能有第二個(gè)解釋：這項(xiàng)工作的結(jié)果報(bào)告可以由先前提出的一種特殊的人口動(dòng)力學(xué)機(jī)制來(lái)解釋【5】。假定當(dāng)T.氧化亞鐵硫桿菌的細(xì)胞形成單層時(shí)，細(xì)胞分裂，產(chǎn)生兩個(gè)子細(xì)胞，在液體介質(zhì)中的一個(gè)被驅(qū)逐，而在生物膜中的第二個(gè)遺留的結(jié)果。因此，在液體中可以發(fā)現(xiàn)有生物膜產(chǎn)生的顯著數(shù)量的細(xì)胞存在?！?】在這種情況下，產(chǎn)量系數(shù)應(yīng)在細(xì)胞總量的基礎(chǔ)計(jì)算（固定加自由懸?。?，并且在我們所有的生物反應(yīng)器應(yīng)該是相似的。這也可以解釋在不同鐵氧化率下生物膜的厚度是相似的。
本研究的第二個(gè)有趣的結(jié)果是大多數(shù)研究的參數(shù)值（生物膜厚度，密度，孔隙比表面）作為鐵的氧化率的一個(gè)函數(shù)的一個(gè)最佳的存在（無(wú)論是最小或最大）。在所有的情況下，在2.1 g / L的相同的輸入的底物濃度時(shí)觀察到這個(gè)最佳值，對(duì)應(yīng)于一個(gè)底物氧化率為0.27 g / L.h。在這種情況下，生物膜厚度最大，密度最小，孔的表面最大（圖1–3）。這時(shí)，我們無(wú)法解釋這一效應(yīng)。這可能與微生物和黃鉀鐵礬的相互作用有關(guān)。
致謝：
這項(xiàng)工作是由北約（批準(zhǔn)號(hào)：環(huán)境。crg974643），索菲亞大學(xué)和加拿大自然科學(xué)和工程研究委員會(huì)支持。
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